Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы

Исследовали влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы. Установлено, что при трансплантации фрагментов ткани щитовидной железы при отсутствии иммуносупрессии на 35-е сутки наблюдается острое отторжение аллотрансплант...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2011
Автор:	Божок, Г.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2011
Теми:	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44880
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы / Г.А. Божок // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 330-337. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-44880
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-448802013-06-07T03:06:46Z Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы Божок, Г.А. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Исследовали влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы. Установлено, что при трансплантации фрагментов ткани щитовидной железы при отсутствии иммуносупрессии на 35-е сутки наблюдается острое отторжение аллотрансплантата, тогда как введение суспензии нативных спленоцитов донорского происхождения в портальную вену печени реципиентов за 7 суток до аллотрансплантации пролонгирует его выживаемость. При использовании размороженной суспензии спленоцитов этого эффекта не наблюдается, возможно, вследствие элиминации из нее макрофагов под действием факторов криоконсервирования. Досліджували вплив інтрапортального введення кріоконсервованих спленоцитів на виживання алотрансплантату тканини щитовидної залози. Встановлено, що за умов трансплантації фрагментів тканини щитовидної залози при відсутності імуносупресії на 35-у добу спостерігається гостре відторгнення алотрансплантату, тоді як введення суспензії нативних спленоцитів донорського походження в портальну вену печінки за 7 діб до алотрансплантації пролонгує його виживання. При використанні розмороженої суспензії спленоцитів цього ефекту не спостерігається, можливо, внаслідок елімінації з неї макрофагів під впливом факторів кріоконсервування. The influence of intraportal introduction of cryopreserved splenocytes on the survival of thyroid tissue allograft was investigated. An acute allograft rejection after transplantation of thyroid tissue fragments in the absence of immunosuppressant for 35 days was established, whereas introduction of native splenocytes of donor’s origin into portal vein of the recipient’s liver 7 days prior to allotransplantation prolongs an allograft survival. This effect is not observed when using post-thaw splenocyte suspensions, probably due to the elimination of macrophages under the influence of cryopreservation factors. 2011 Article Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы / Г.А. Божок // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 330-337. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44880 611.41.018:611.441.018.089:57.043 ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
spellingShingle	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Божок, Г.А. Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
description	Исследовали влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы. Установлено, что при трансплантации фрагментов ткани щитовидной железы при отсутствии иммуносупрессии на 35-е сутки наблюдается острое отторжение аллотрансплантата, тогда как введение суспензии нативных спленоцитов донорского происхождения в портальную вену печени реципиентов за 7 суток до аллотрансплантации пролонгирует его выживаемость. При использовании размороженной суспензии спленоцитов этого эффекта не наблюдается, возможно, вследствие элиминации из нее макрофагов под действием факторов криоконсервирования.
format	Article
author	Божок, Г.А.
author_facet	Божок, Г.А.
author_sort	Божок, Г.А.
title	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
title_short	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
title_full	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
title_fullStr	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
title_full_unstemmed	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
title_sort	влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2011
topic_facet	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44880
citation_txt	Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы / Г.А. Божок // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 330-337. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ.
work_keys_str_mv	AT božokga vliânieintraportalʹnogovvedeniâkriokonservirovannyhsplenocitovnavyživaemostʹallotransplantatatkaniŝitovidnojželezy
first_indexed	2025-07-04T03:27:08Z
last_indexed	2025-07-04T03:27:08Z
_version_	1836685332684210176
fulltext	330 * Адрес для корреспонденции: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: bozhokgaru@mail.ru * Address for correspondence: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: bozhokgaru@mail.ru Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков В современной клинической трансплантологии основным способом поддержания выживаемости аллогенного трансплантата является пожизненная иммуносупрессия. В связи с тем, что риск развития смертельных осложнений при приеме иммуно- супрессантов очень велик [8], актуальной задачей является разработка методов индукции специфи- ческой толерантности к трансплантату. Экспериментально показано, что инфузия кле- ток донора за несколько дней до аллотранспланта- ции органа от того же донора уменьшает выражен- ность реакции отторжения, а в некоторых случаях приводит к перманентной выживаемости транс- плантата без применения иммуносупрессии [16, 17, 19, 21, 27]. Это явление получило название индук- ции донор-специфической толерантности (ДСТ). Для индукции ДСТ применяют клетки, получен- ные из лимфоузлов, селезенки, костного мозга, пе- In contemporary clinical transplantology the main method for maintaining the survival of allogeneic graft is live-long immune suppression. Because of a high risk of development of lethal complications when tak- ing immune suppressants [8], an actual task is the de- veloping of the methods inducing a graft-specific tole- rance. It has been shown in the experiments that donor cell infusion several days prior to allotransplantation of the organ from the same donor reduces the manifesta- tion of rejection response and in some cases leads to permanent survival of the transplant with no applica- tion of immune suppression [16, 17, 19, 21, 27]. This phenomenon was called as the induction of donor-spe- cific tolerance (DST). To induce DST the cells obtained from lymph nodes, spleen, bone marrow, peripheral blood [15, 17, 27] are applied. At the first stage the donor cells are injected problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 УДК 611.41.018:611.441.018.089:57.043 Г.А. БОЖОК Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы UDC 611.41.018:611.441.018.089:57.043 G.A. BOZHOK Effect of Intraportal Administration of Cryopreserved Splenocytes on Thyroid Gland Tissue Allograft Survival Исследовали влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы. Установлено, что при трансплантации фрагментов ткани щитовидной железы при отсутствии иммуносупрессии на 35-е сутки наблюдается острое отторжение аллотрансплантата, тогда как введение суспензии нативных спленоцитов донорского происхождения в портальную вену печени реципиентов за 7 суток до аллотрансплантации пролонгирует его выживаемость. При использовании размороженной суспензии спленоцитов этого эффекта не наблюдается, возможно, вследствие элиминации из нее макрофагов под действием факторов криоконсервирования. Ключевые слова: щитовидная железа, спленоциты, криоконсервирование, аллотрансплантация, донор-специфическая толерантность. Досліджували вплив інтрапортального введення кріоконсервованих спленоцитів на виживання алотрансплантату тканини щитовидної залози. Встановлено, що за умов трансплантації фрагментів тканини щитовидної залози при відсутності імуносупресії на 35-у добу спостерігається гостре відторгнення алотрансплантату, тоді як введення суспензії нативних спленоцитів донорського походження в портальну вену печінки за 7 діб до алотрансплантації пролонгує його виживання. При використанні розмороженої суспензії спленоцитів цього ефекту не спостерігається, можливо, внаслідок елімінації з неї макрофагів під впливом факторів кріоконсервування. Ключові слова: щитовидна залоза, спленоцити, кріоконсервування, алотрансплантація, донор-специфічна толерантність. The influence of intraportal introduction of cryopreserved splenocytes on the survival of thyroid tissue allograft was investigated. An acute allograft rejection after transplantation of thyroid tissue fragments in the absence of immunosuppressant for 35 days was established, whereas introduction of native splenocytes of donor’s origin into portal vein of the recipient’s liver 7 days prior to allotransplantation prolongs an allograft survival. This effect is not observed when using post-thaw splenocyte suspensions, probably due to the elimination of macrophages under the influence of cryopreservation factors. Key words: thyroid gland, splenocytes, cryopreservation, allotransplantation, donor-specific tolerance. 331 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 риферической крови [15, 17, 27]. На первом этапе вводят донорские клетки внутривенно или в пор- тальный кровоток печени за 7–14 дней до транс- плантации. На втором этапе производят трансплан- тацию органа или ткани от того же донора. Многие протоколы индукции ДСТ предполагают повторную инфузию донорских клеток [19]. Несмотря на то, что такой метод достижения ДСТ активно исполь- зуется в экспериментальной и клинической практи- ке на протяжении последнего десятилетия, до сих пор не пытались применять в качестве индуци- рующего агента криоконсервированные клетки. Криоконсервирование донорского биоматериала позволяет выполнять трансплантацию не в экс- тренном режиме, а планировать сроки операции в зависимости от состояния реципиента. Ранее была показана лучшая выживаемость фрагментов яичников и щитовидной железы крыс при аллотрансплантации после инфузии спленоци- тов донорской линии [1, 2] . В данной работе изучали возможность применения криоконсервированных клеток селезенки для индукции ДСТ при трансплан- тации фрагментов щитовидной железы (ФЩЖ). Целью работы было изучение влияния интра- портального введения криоконсервированных спле- ноцитов на выживаемость аллотрансплантата ФЩЖ у тиреоидэктомированных крыс. Материалы и методы Эксперименты проводили в соответствии с "Общими принципами экспериментов на живот- ных", одобренными IV Национальным конгрессом по биоэтике (2010 г., Киев) и согласованными с положениями “Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экс- периментальных и других научных целей” (Страс- бург, 1986). Исследования проводили на 3–4-месячных кры- сах линий Вистар и Август. В эксперименте были использованы следующие группы животных: 1 – интактный контроль (n = 5); 2 – с тиреоидэктомией (n = 14); 3 – с тиреоидэктомией и трансплантацией ФЩЖ (n = 15); 4 – с введением нативных сплено- цитов, тиреоидэктомией и трансплантацией ФЩЖ (n = 10); 5 – с введением криоконсервированных спленоцитов, тиреоидэктомией и трансплантацией ФЩЖ (n = 10). Спленоциты получали из селезенки крыс линии Вистар по методу [4]. Эритроциты удаляли трех- кратной обработкой лизирующим раствором, со- держащим 154 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикар- боната натрия, 0,082 мМ ЭДТА. Спленоциты криоконсервировали по методу [11]. Криозащитная среда, приготовленная на осно- ве среды 199 (“PAA”, Австрия), содержала 10% ДМСО и 25% фетальной телячьей сыворотки (“Биолот”, Россия). Спленоциты замораживали на either intravenously or into liver portal blood flow 7– 14 days prior to the transplantation. At the second stage the organ or tissue of the same donor is transplanted. Many protocols for DST inducing include the repeated infusion of donor cells [19]. In spite of the fact that this method of DST achieving has been actively used in experimental and clinical practice during recent dec- ade till now there have been no attempts of using cryo- preserved cells as an inducing agent. Donor material cryopreservation enables the transplantation as not an emergency case but as planned surgery depending on the recipient’s state. Higher survival of rat ovary and thyroid gland frag- ments following allotransplantation after infusion of donor line splenocytes has been shown recently [1, 2]. This research deals with the possible application of cryopreserved spleen cells to induce DST during trans- plantation of thyroid gland fragments (TGF). The research aim was to investigate the effect of intraportal introduction of cryopreserved splenocytes on survival of TGF allograft in thyroidectomized rats. Materials and methods The experiments were performed according to General Principles of Experiments in Animals, approved by the 4th National Congress in Bioethics (Kiev, 2010) and coordinated with the statements of European Con- vention on the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Stras- bourg, 1986). The studies were carried-out in 3–4-month-old Wi- star and August rats. In the experiment the following groups of animals were used: 1 – intact control (n = 5); 2 – thyreoidectomized rats (n = 14); 3 – animals with thyreoidectomy and TGF transplantation (n = 15); 4 – introduction of native splenocytes, thyreoidectomy and transplantation of TGF (n = 10); 5 – introduction of frozen-thawed splenocytes, thyreoidectomy and TGF transplantation (n = 10). Splenocytes were isolated from Wistar rat spleen [4]. Erythrocytes were removed with three-fold treat- ment by lysing solution containing 154 mM ammonium chloride, 10 mM sodium bicarbonate, 0.082 mM EDTA. Splenocytes were cryopreserved according to Hem E. [11]. Cryoprotective medium was prepared on the base of medium 199 (PAA, Austria), and contained 10% DMSO and 25% fetal bovine serum (Biolot, Russia). Splenocytes were frozen with programmable freezer (Cryoson, Germany) with 1 degree/min cooling rate down to –40°C with following plunging into liquid ni- trogen. Later they were thawed in water bath at 40°C, afterwards cryoprotective medium was removed [23]. Viability of the obtained cells was examined by trypan blue staining. It made in average 90% for na- tive and 85% for cryopreserved suspensions. Thyreoidectomy to the August rats was performed according to Legach E.I. [5] 7 days prior to transplan- 332 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 программном замораживателе “Cryoson” (Герма- ния) со скоростью охлаждения 1 град/мин до –40°С с последующим погружением в жидкий азот. Ото- гревали на водяной бане при температуре 40°С, после чего ступенчато удаляли криозащитную сре- ду [23]. Жизнеспособность полученных клеток опреде- ляли с помощью окрашивания трипановым синим. Она составляла в среднем 90% для нативной и 85% для криоконсервированной суспензий. Тиреоидэктомию крысам линии Август прово- дили по методу [5] за 7 суток до трансплантации. В эти же сутки животным групп 3 и 4 в портальную вену печени вводили 0,5 мл физиологического раст- вора, содержащего нативные или криоконсерви- рованные спленоциты (2×107 кл/мл) донорской линии Вистар. Через 7 суток у крыс донорской линии Вистар забирали щитовидные железы, измельчали их на 4–5 фрагментов, отмывали 3–4 раза физиологи- ческим раствором и трансплантировали под капсу- лу левой почки крысам линии Август. На 35-е сутки после трансплантации животных забивали. Выживаемость трансплантата оценивали по двум параметрам: уровню Т4 в сыворотке крови и сохранности структуры ткани трансплантата на гистологических образцах. Общий Т4 измеряли радиоиммунологическим методом с помощью тест-набора Total T4 RIA Kit (“Immunotech”, Фран- ция). Для гистологического анализа почки с транс- плантатами фиксировали в 10%-м формалине и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Гис- тологические образцы исследовали с помощью олетитнА ydobitnA ьнешиМ tegraT тагюьноK etagujnoC нолK enolC питозИ epytosI амриФ - ьлетидовзиорп recudorP itnA - taR egahporcaM rekraM гафоркаМ egahporcaM EP 63SIH esuoM ,a2GgI κ naS,ecneicsoiBe ASU,ogeiD itnA - taR AR54DC В- тицофмил llecB EP XO - 33 esuoM 1GgI efiL,negortivnI seigolonhceT ,noitaroproC ASU itnA - taR a8DC 8DС Т- тицофмил llecT - 8XO esuoM 1GgI naS,ecneicsoiBe ASU,ogeiD itnA - 4DCtaR 4DС Т- тицофмил llecT - 53XO esuoM a2GgI naS,ecneicsoiBe ASU,ogeiD yradnoceS itnA2)'ba(F - GgIesuoM GgIesuoM EP lanolcyloP GgIyeknoD naS,ecneicsoiBe ASU,ogeiD Примечание: РЕ – фикоэритрин. Note: PE – phycoerythrin. Антитела для проточной цитофлуориметрии Antibodies used for flow cytometry микроскопа Olympus 70XI и пакета прикладных программ для обработ- ки изображения. Анализ сохранности клеточных субпопуляций в суспензии сплено- цитов после криоконсервирования проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Набор антител, использованных для анализа, пред- ставлен в таблице. Окрашивание осуществляли в соответствии со стандартным протоколом [10]. Мерт- вые клетки идентифицировали с помощью 7-AAD (“eBioscience”, США). Флуоресценцию клеток из- меряли на проточном цитофлуори- метре BD FACS Calibur (“BD Bio- science”, США) и анализировали с использованием программного обеспечения CellQuestPro. Статистическую достоверность данных оценивали с помощью tation. Simultaneously the animals of groups 3 and 4 were injected into liver portal vein with 0.5 ml physio- logical solution, containing either native or frozen- thawed splenocytes (2×107 cells/ml) of Wistar line do- nors. Seven days later thyroid glands of Wistar rat do- nors were isolated, disintegrated into 4–5 fragments, washed 3–4 times with physiological solution and trans- planted under the capsule of left kidney to August rats. To the 35th day after transplantation the animals were sacrified. The graft survival was assessed by two parameters: T4 level in blood serum and integrity of graft tissue structure in histological samples. Total T4 was measured with radio immunological method by Total T4 RIA Kit (Immunotech, France). For histo- logical analysis the kidneys with grafts were fixed in 10% formalin and paraffin embedded. Serial sections of 5 mm width were stained with hematoxylin and eosin. Histological samples were studied by Olympus 70XI microscope and the image processing software. Cell subpopulation survival in splenocyte suspen- sion after freeze-thawing was analyzed by means of flow cytometry. The kit of antibodies used for analysis is presented in the Table. Staining was performed in accordance with the standard protocol [10]. Dead cells were identified by 7-AAD (e-Bioscience, USA). Cell fluorescence was measured with flow cytometer BD FACS Calibur (BD Bioscience, USA) and analyzed using CellQuestPro software. The data were statistically processed using one way ANOVA test, the differences at p < 0.05 were consid- ered as statistically significant. The data are presented as a mean of the values obtained in 2 similar experi- ments and measured in two parallel samples, ±SE. 333 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 однофакторного дисперсионного анализа, досто- верными считались различия при р < 0,05. Данные представлены как среднее значений, полученных в 2-х аналогичных экспериментах и измеренных в двух параллельных пробах, ± стандартная ошибка. Результаты и обсуждение Установлено, что на 35-е сутки у тиреоидэкто- мированных крыс (группа 2) в сыворотке крови на- блюдалось уменьшение уровня Т4. Значения уров- ня гормона у животных этой группы колебались от 15,3 до 26,1 нмоль/л (медиана 19,6 нмоль/л). Это составляло в среднем 27% от уровня гормона интактной группы (р < 0,05), в которой значения Т4 были в пределах 44,5–88,6 нмоль/л (медиана 75,1 нмоль/л). У животных группы 3 на 35-е сутки уровень Т4 был в пределах 23,5–48,7 нмоль/л (медиана 32,4 нмоль/л). Это составляло в среднем 46% от уровня Т4 у контрольных животных, р < 0,05. В группе 4 наблюдался разброс уровня гормона от 27,7 до 64,1 нмоль/л (медиана 49,4 нмоль/л), что составляло в среднем 66% от значений Т4 у ин- тактного контроля, р < 0,05. У животных группы 5 уровень Т4 находился в пределах от 19,4 до 41,5 нмоль/л (медиана 27,5 нмоль/л), что составляло 41% от контрольных значений. Таким образом, наибольший уровень Т4 на- блюдался в плазме крови крыс, которым за 7 суток до трансплантации были введены нативные спле- ноциты. При анализе гистологических образцов почек с трансплантатами животных группы 3 выявлены явные признаки отторжения трансплантата: ин- фильтрация лимфоцитами, полная деградация фолликулярного строения ткани, замещение ткани трансплантата соединительной тканью (рис. 1, а). У животных группы 4 в целом наблюдалась хорошая выживаемость трансплантатов (рис. 1, б). Видна сохранившаяся ткань щитовидной железы, содержащая фолликулы, выстланные высоким кубическим эпителием и заполненные коллоидом с вакуолями резорбции. Это является признаком гормоносинтезирующей функции трансплантата, что подтверждалось присутствием значительного уровня Т4 в сыворотке крови у крыс этой группы. Гистологический анализ образцов транспланта- тов группы 5 выявил отсутствие аллографтов с сохранившейся тканью щитовидной железы. На- блюдались те же признаки отторжения трансплан- татов, как и у животных группы 3. Таким образом, по уровню Т4 в сыворотке кро- ви и сохранности структуры ткани трансплантата на гистологических образцах хорошая выживае- Results and discussion It has been found a decreased T4 level in blood serum to the 35th day in thyroidectomized rats (group 2). The values of hormone level in animals in the group varied from 15.3 to 26.1 nmol/l (median 19.6 nmol/l). This made in average 27% of the hormone level for intact group (p < 0.05), wherein T4 values were within the range of 44.5–88.6 nmol/l (median 75.1 nmol/l). In the animals of group 3 to the 35th day T4 level was within the range of 23.5–48.7 nmol/l (median 32.4 nmol/l). This made in average 46% of T4 level in the control animals, p < 0.05. In the group 4 there was observed the hormone level dispersion from 22.7 to 64.1 nmol/l (median 49.4 nmol/l), making in average 66% of T4 values in intact control, p < 0.05. In the animals of group 5 T4 level was within the range of 19.4–41.5 nmol/l (median 27.5 nmol/l), mak- ing 41% of the control values. Thus the highest level of T4 was observed in blood plasma of the rats, which were 7 days prior to trans- plantation introduced with native splenocytes. When analyzing histological sections of kidneys with the grafts of the group 3 animals there were revealed evident signs of graft rejection: infiltration with lympho- cytes, complete degradation of tissue follicular struc- ture, substitution of graft tissue with connective one (Fig. 1a). In the group 4 animals in a whole there was ob- served a good survival of the grafts (Fig. 1b). There was found the preserved tissue of thyroid gland, con- taining the follicles, embedded with a high cubic epi- thelium and comprised colloid with resorption vacuoles. This is the sign of hormone-synthesizing graft func- tion, confirmed with the presence of significant amount of T4 in blood serum of this group rats. Histological analysis of the samples of group 5 grafts demonstrated the absence of allografts with a preserved tissue of thyroid gland. There were found the same signs of graft rejection as in the animals of group 3. Thus based upon T4 level in blood serum and preser- vation of graft tissue structure in histological sections a good survival of TGF allografts was found only in the animals of group 4, which were introduced with native splenocytes. The cryopreservation of spleno- cytes led to the cancellation of the prolonged survival effect for TGF allografts. This result is in accordance with the data of Hollander et al. [13], showed no in- duction of DST after introduction of cryopreserved cells. At the following stage of the study the freeze-thaw- ing effect on subpopulational composition of spleno- cyte suspension was assessed. It is known that cell suspension isolated from spleen in addition to erythro- cytes contains B and T lymphocytes, macrophages, 334 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 мость аллографтов ФЩЖ была установлена лишь у животных группы 4, которым были введены нативные спленоциты. Криоконсервирование спле- ноцитов приводило к отмене эффекта пролонгиро- вания выживаемости аллографтов ФЩЖ. Этот результат согласуется с данными работы [13], в которой также отмечено отсутствие индукции ДСТ после введения криоконсервированных клеток. На следующем этапе работы изучалось влия- ние криоконсервирования на субпопуляционный состав суспензии спленоцитов. Известно, что сус- пензия клеток, которую получают из селезенки, кроме эритроцитов, содержит В- и Т-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки [6]. При использо- вании антител к специфическим рецепторам раз- личных субпопуляций спленоцитов с помощью про- точной цитофлуориметрии был проведен сравни- тельный анализ нативной и криоконсервированной суспензий клеток. На гистограммах (рис. 2) представлены дан- ные, выражающие степень экспрессии специфичес- ких маркеров субпопуляций клеток в нативной и криоконсервированной суспензиях спленоцитов. В нативной суспензии спленоцитов около 34% клеток экспрессируют маркер В-лимфоцитов крыс CD45RA, 16% – маркер цитотоксических Т-лим- фоцитов CD8, 26% – маркер Т-хелперов CD4 и 3,5% – макрофагальный маркер. После криокон- сервирования отмечаются некоторые изменения в субпопуляционном составе суспензии спленоци- тов. Количество В-лимфоцитов и CD8+ – Т-лим- фоцитов практически не изменяется. Количество CD4+ – Т-лимфоцитов уменьшается в среднем на 20, а макрофагов – на 83%. Таким образом, основ- а a б b Рис.1. Гистологические образцы аллографтов ФЩЖ на 35-е сутки после трансплантации под капсулу почки животным экспериментальных групп: а – группа 3; б – группа 4; K – ткань почки, Т – ткань трансплантата. Fig. 1. Histological samples of allografts of TGF to the 35th day after transplantation under kidney capsule of experimental group animals: a – group 3; b – group 4; K – kidney tissue; T – transplant tissue. dendritic cells [6]. Keeping this in mind a comparative analysis of native and cryopreserved cell suspensions was performed using flow cytometry with antibodies to specific receptors of different splenocyte subpopu- lations. The histograms (Fig. 2) represent the data on the expression rate of specific markers of cell subpopu- lations in native and cryopreserved suspensions of sple- nocytes. In native suspension of splenocytes about 34% of cells express the markers of rat B lymphocytes CD45RA, 16% have the marker of cytotoxic T lym- phocytes CD8, 26% of cells possessing CD4 helper T cell marker and 3.5% have macrophage marker. Af- ter freeze-thawing there are found some changes in subpopulational composition of splenocyte suspension. The number of B lymphocytes and CD8+ T lymphocy- tes is almost not changed. The number of CD4+ T lym- phocytes decreases in average by 20%, and 83% of macrophages are lost. Thus the main distinction con- sists in a sharp reduction of macrophage subpopulations in the suspension of splenocytes after freeze-thawing. The available data of freezing effect on subpopulatio- nal composition of the cells isolated from spleen are quite contradictory. Some authors [3, 22, 26] report no changes in antigenic properties of splenocyte suspen- sion. Hem E. [12] established that spleen macropha- ges are less resistant to freeze-thawing unlike lympho- cytes. According to other data [7, 14] the post-thaw survival and immune reactivity of splenocytes are re- duced. It is known that macrophages and dendritic cells have a high sensitivity to cooling rate. Optimum of macrophage and dendrocyte survival was found to be 335 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 ное различие состоит в резком уменьшении субпо- пуляции макрофагов в суспензии спленоцитов после криоконсервирования. В научной литературе существуют противо- положные данные о влиянии замораживания на субпопуляционный состав клеток, получаемых из селезенки. В работах [3, 22, 26] не обнаружены изменения антигенных свойств суспензии сплено- цитов после криоконсервирования. В работе [12] установлено, что макрофаги селезенки менее ус- тойчивы к процессу замораживания-оттаивания, чем лимфоциты. По данным [7, 14] после криокон- сервирования снижались сохранность и иммунная реактивность спленоцитов. Известно, что макрофаги и дендритные клетки имеют высокую чувствительность к скорости ох- лаждения. Оптимум выживаемости макрофагов и дендритных клеток наблюдался при использовании скоростей охлаждения в диапазоне 0,3–5 град/мин [24, 25]. В наших экспериментах скорость охлаж- дения составляла 1 град/мин, однако наблюдалось резкое уменьшение количества макрофагов. Несмотря на то, что в практике клинической и экспериментальной трансплантации имеется достаточно данных об индукции ДСТ путем пред- варительного введения донорского антигена в организм реципиента, механизм развития этого явления до конца не выяснен. Известно, что на- ступление состояния толерантности к трансплан- тату зависит от места введения донорских клеток, при этом состояние ДСТ чаще наступает при введении клеток в портальную вену печени, а не периферические сосуды [17, 20]. Предполагается, что механизм развития ДСТ связан с особеннос- тями процесса презентации антигена в печени, в частности макрофагами печени – клетками Купфе- ра [18], так как при введении хлорида гадолиния, избирательно блокирующего функцию макрофагов, индукции ДСТ не наблюдается [9]. Результаты данного исследования показывают, что элимина- ция макрофагов из суспензии клеток, используемой для индукции ДСТ, также имеет значение для реализации этого феномена. По-видимому, для развития ДСТ важно наличие макрофагов не только реципиента, но и донорского происхождения. Выводы Аллотрансплантация ФЩЖ без иммуносупрес- сии приводит к острому отторжению трансплан- тата на 35-е сутки, тогда как введение нативных спленоцитов донорского происхождения в порталь- ную вену печени реципиентов за 7 суток до алло- трансплантации пролонгирует его выживаемость. При использовании размороженной суспензии спленоцитов этого эффекта не наблюдается, воз- можно, за счет элиминации из нее макрофагов под действием факторов криоконсервирования. – 34% – 35,1% – 16,6% – 16,1% – 26,4% – 21,3% – 3,5% – 0,6% Рис. 2. Степень экспрессии специфических маркеров в суспензии клеток, полученной из селезенки: – клетки, не подвергавшиеся замораживанию-оттаиванию; – замороженные-отогретые клетки. Цифры на гистограм- мах обозначают процент клеток, экспрессирующих спе- цифические маркеры, в выделенном регионе. Представ- лены данные 5 независимых экспериментов. Fig. 2. Expression rate of specific markers in spleen-derived cell suspension: – non-frozen-thawed cells; – frozen- thawed cells. Numbers in histograms denote the percent- age of cells, expressing specific markers in marked region. The data of 5 independent experiments are presented. within the cooling rate range of 0.3–5 degree/min [24, 25]. In our experiments the cooling rate made 2 de- gree/min, but the number of macrophages reduced. In spite of the fact that clinical and experimental transplantology accumulated a vast volume of obser- vations of DST induction by preliminary introduction of donor antigen into a recipient organism, the mecha- nism of this phenomenon development has not been studied completely. It is known that onset of graft-tole- rance state depends on the site of donor cells adminis- tration, herewith the DST state more frequently starts when the cells are administered into liver portal vein and not peripheral vessels [17, 20]. It is supposed that the mechanism of DST development is related to the peculiarities of antigen presentation in liver, in particu- lar, liver macrophages, Kupffer cells [18], since the introduction of gadolinium chloride selectively block- ing the function of macrophages prevents the DST in- duction [9]. The results of our experiments demon- 336 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 Автор выражает благодарность доктору мед. наук Легачу Е.И., канд. биол. наук Гуриной Т.М., канд. биол. наук Зубову П.М. и канд. биол. наук Губиной Н.Ф. за помощь в проведении экспериментов. Литература Божок Г.А. Влияние введения донорских спленоцитов на выживаемость фрагментов ткани щитовидной железы при аллотрансплантации // Проблеми ендокринної пато- логії.– 2011.– №1.– С. 60–66. Божок Г.А., Кирошка В.В., Тищенко Ю.О., Легач Е.И. Предтрансплантационное введение донорских лимфоци- тов пролонгирует выживаемость аллогенной ткани яичников у овариэктомированных животных реципиен- тов // Проблеми ендокринної патології.– 2009.– №4.– С. 15–18. Калужина Н.Н., Абрамов В.Ю. Изучение экспрессии HLA- антигенов II класса на криоконсервированных изоли- рованных мононуклеарных клетках селезенки // Гемато- логия и трансфузиология.– 1991.– Т. 36, №3.– С. 5–6. Клаус Дж. Лимфоциты: Методы.– М.: Мир, 1990.– 395 с. Легач Е.И. Ретроградный способ тиреоидэктомии крыс как адекватная модель гипотиреоза // Трансплантологія.– 2005.– Т. 8, №2.– С. 92–94. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология.– М.: Мир, 2000.– 592 с. Цуцаева А.А. Криоконсервирование клеточных суспен- зий.– Киев: Наук. думка, 1983.– 240 с. Шумаков В.И. Трансплантология (руководство для врачей).– М.: Медицина, 1995.– 575 с. Diaz-Peromingo J.A., Gonzalez-Quintela A. Influence of gadolinium-induced kupffer cell blockade on portal venous tolerance in rat skin allograft transplantation // Eur. Surg. Res.– 2005.– Vol. 37, N1.– P. 45–49. Hawley T.S., Hawley R.G. Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.– Totowa, NJ: Humana Press.– 2004.– 424 p. Hem E. Freezing of rat lymphocytes. I. The effects of dimethyl sulfoxide and freezing on the phytohemagglutinin- and pokeweed mitogen-responding lymphocyte subpopulations // Cryobiology.– 1976.– Vol.13, N2.– P. 134–141. Hem E. Freezing of rat lymphocytes. V. The effect of suppressor cells in phytohaemagglutinin-stimulated spleen cell cultures before and after freeze-thawing // Acta Pathol. Microbiol. Scand.– 1978.– Vol. 86, N4.– P. 153–158. Hollander A.A.M.J., de Waal L.P., van Bockel H.J. et al. No tolerance induction with cryopreserved bone marrow cells after allogeneic kidney transplantation and antilymphocyte globulin in rhesus monkeys // Transplant. Int.– 1997.– Vol. 10, N3.– P. 249–250. Jenning J.J., Yanari S.S., Reid R. Immune reactivity of frozen- thawed murine spleen cells // Сryobiology.– 1978.– Vol. 15, N3.– P. 272–278. Kang H.G., Lee J.E., Yang S.H. et al. Donor-strain-derived immature dendritic cell pre-treatment induced hyporespon- siveness against allogeneic antigens // Immunology.– 2010.– Vol. 129, N4.– P. 567–577. Kenick S., Lowry R.P., Forbes R.D.S. et al. Prolonged cardiac allograft survival following portal venous inoculation of allogeneic cells: What is “hepatic tolerance”? // Transplant. Proc.– 1987.– Vol. 19, N4.– P. 478–479. Oko A., Idasiak-Piechocka I., Pawlaczyk K. et al. Prolonga- tion of rat kidney graft survival after inoculation of allogeneic spleen cells: the effect of various routes of cell transfer // Ann. Transplant.– 2002.– Vol. 7, N2.– P. 51–53. Parker G.A., Picut C.A. Liver immunobiology // Toxicol. Pathol.– 2005.– Vol. 33, N1.– P. 52–62. strate that elimination of macrophages from cell sus- pensions, used for DST induction is also of some value for implementing this phenomenon. Not only the pres- ence of recipient's macrophages but of donor’s origin can be of importance for DST development as well. Conclusions Allotransplantation of TGF without suppression leads to an acute rejection of the graft to the 35th day, whereas the introduction of native splenocytes of do- nor origin into recipient liver portal vein 7 days prior to the allotransplantation prolongs its survival. When us- ing frozen-thawed suspension of splenocytes this ef- fect is not observed, probably due to the elimination of macrophages due to the effect of cryopreservation factors. The author aknowledges Dr. E. I. Legach, Dr. T.M. Gu- rina, Dr. P.M. Zubov and Dr. N.F. Gubina for the help in performance of the experiments. Литература Bozhok G.A. Effect of introduction of donor splenocytes on survival of fragments of thyroid gland tissue at allotrans- plantation // Problemy Endokrinnoi Patologii.– 2011.– N1.– P. 60– 66. Bozhok G.A., Kiroshka V.V., Tishchenko Yu.O., Legach E.I. Pre-transplanted administration of donor lymphocytes pro- longs survival of ova allogenic tissue in ovariectomized animal recipients // Problemy Endokrinnoi Patologii.– 2009.– N4.– P. 15–18. Kaluzhina N.N., Abramov V.Iu. Expression of class II HLA antigens on cryopreserved isolated mononuclear splenic cells // Gematol. Transfuziol.– 1991.– Vol. 36, N3.– P. 5–7. Klaus G. Lymphocytes: Methods.– Moscow: Mir, 1990.– 395 p. Legach E.I. Retrograde method of rat thyroidectomy as adequate model of hypotheriosis // Transplantologiya.– 2005.– Vol. 8, N2.– P. 92–94. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology.– Moscow: Mir, 2000.– 592 p. Tsutsayeva A.A. Cryopreservation of cell suspensions.– Kiev: Naukova Dumka, 1983.– 240 p. Shumakov V.I. Transplantology (Manual for doctors).– Moscow: Medicine, 1995.– 575 p. Diaz-Peromingo J.A., Gonzalez-Quintela A. Influence of gadolinium-induced kupffer cell blockade on portal venous tolerance in rat skin allograft transplantation // Eur. Surg. Res.– 2005.– Vol. 37, N1.– P. 45–49. Hawley T.S., Hawley R.G. Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.– Totowa, NJ: Humana Press.– 2004.– 424 p. Hem E. Freezing of rat lymphocytes. I. The effects of dimethyl sulfoxide and freezing on the phytohemagglutinin- and pokeweed mitogen-responding lymphocyte subpopulations // Cryobiology.– 1976.– Vol.13, N2.– P. 134–141. Hem E. Freezing of rat lymphocytes. V. The effect of suppres- sor cells in phytohaemagglutinin-stimulated spleen cell cultures before and after freeze-thawing // Acta Pathol. Microbiol. Scand.– 1978.– Vol. 86, N4.– P. 153–158. Hollander A.A.M.J., de Waal L.P., van Bockel H.J. et al. No tolerance induction with cryopreserved bone marrow cells after allogeneic kidney transplantation and antilymphocyte 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 337 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №3 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №3 Sato Y., Ichida T., Watanabe H. et al. Repeating intraportal donor-specific transfusion may induce tolerance following adult living-related donor liver transplantation // Hepatogastro- enterology.– 2003.– Vol. 50.– P. 601–606. Sato Y., Farges O., Buffello D. et al. Impact of 70% partial hepatectomy on administration of donor leukocytes in cardiac transplantation in rats // Transplant. Proc.– 1998.– Vol. 30, N7.– P. 3873–3875. Sheng Sun D., Iwagaki H., Ozaki M. et al. Prolonged survival of donor-specific rat intestinal allograft by administration of bone-marrow-derived immature dendritic cells // Transplant. Immunol.– 2005.– Vol. 14, N1.– P. 17–20. Sogut I., Hatipoglu I., Serhatli M. et al. Cryopreservation of spleen and lymph nodes as a source of mononuclear cells to be used for the development of monoclonal antibody producing hybridoma cells // Cryo Letters.– 2011.– Vol. 32, N3.– P. 266– 274. Stephens E.A., Sharma J.M. Cryopreservation of avian lymphoid cells // Avian Diseases.– 1981.– Vol. 25, N3.– P. 614– 627. Taylor M.J., Bank H.L., Benton M.J. Selective destruction of leucocytes by freezing as a potential means of modulating tissue immunogenicity: membrane integrity of lymphocytes and macrophages // Cryobiology.– 1987, N2.– Vol. 24.– P. 91– 102. Taylor M.J., London N.J., Thirdborough S.M. et al. The cryo- biology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N3.– P. 269–278. Tomita Y., Yoshikawa M., Zhang Q.W. et al. Immune and non-immune factors in cryopreserved tissues // J. Heart Lung Transplant.– 2003.– Vol. 22, N5.– P. 560–567. Yang L., Du Temple B., Khan Q. et al. Mechanisms of long- term donor-specific allograft survival induced by pretrans- plant infusion of lymphocytes // Blood.– 1998.– Vol. 91, N1.– P. 324–330. Поступила 25.08.2011 Рецензент В.А. Македонская globulin in rhesus monkeys // Transplant. Int.– 1997.– Vol. 10, N3.– P. 249–250. Jenning J.J., Yanari S.S., Reid R. Immune reactivity of frozen- thawed murine spleen cells // Сryobiology.– 1978.– Vol. 15, N3.– P. 272–278. Kang H.G., Lee J.E., Yang S.H. et al. Donor-strain-derived immature dendritic cell pre-treatment induced hyporespon- siveness against allogeneic antigens // Immunology.– 2010.– Vol. 129, N4.– P. 567–577. Kenick S., Lowry R.P., Forbes R.D.S. et al. Prolonged cardiac allograft survival following portal venous inoculation of allogeneic cells: What is “hepatic tolerance”? // Transplant. Proc.– 1987.– Vol. 19, N4.– P. 478–479. Oko A., Idasiak-Piechocka I., Pawlaczyk K. et al. Prolonga- tion of rat kidney graft survival after inoculation of allogeneic spleen cells: the effect of various routes of cell transfer // Ann. Transplant.– 2002.– Vol. 7, N2.– P. 51–53. Parker G.A., Picut C.A. Liver immunobiology // Toxicol. Pathol.– 2005.– Vol. 33, N1.– P. 52–62. Sato Y., Ichida T., Watanabe H. et al. Repeating intraportal donor-specific transfusion may induce tolerance following adult living-related donor liver transplantation // Hepatogastro- enterology.– 2003.– Vol. 50.– P. 601–606. Sato Y., Farges O., Buffello D. et al. Impact of 70% partial hepatectomy on administration of donor leukocytes in cardiac transplantation in rats // Transplant. Proc.– 1998.– Vol. 30, N7.– P. 3873–3875. Sheng Sun D., Iwagaki H., Ozaki M. et al. Prolonged survival of donor-specific rat intestinal allograft by administration of bone-marrow-derived immature dendritic cells // Transplant. Immunol.– 2005.– Vol. 14, N1.– P. 17–20. Sogut I., Hatipoglu I., Serhatli M. et al. Cryopreservation of spleen and lymph nodes as a source of mononuclear cells to be used for the development of monoclonal antibody producing hybridoma cells // Cryo Letters.– 2011.– Vol. 32, N3.– P. 266– 274. Stephens E.A., Sharma J.M. Cryopreservation of avian lymphoid cells // Avian Diseases.– 1981.– Vol. 25, N3.– P. 614– 627. Taylor M.J., Bank H.L., Benton M.J. Selective destruction of leucocytes by freezing as a potential means of modulating tissue immunogenicity: membrane integrity of lymphocytes and macrophages // Cryobiology.– 1987, N2.– Vol. 24.– P. 91– 102. Taylor M.J., London N.J., Thirdborough S.M. et al. The cryo- biology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N3.– P. 269–278. Tomita Y., Yoshikawa M., Zhang Q.W. et al. Immune and non-immune factors in cryopreserved tissues // J. Heart Lung Transplant.– 2003.– Vol. 22, N5.– P. 560–567. Yang L., Du Temple B., Khan Q. et al. Mechanisms of long- term donor-specific allograft survival induced by pretrans- plant infusion of lymphocytes // Blood.– 1998.– Vol. 91, N1.– P. 324–330. Accepted 25.08.2011 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.

Влияние интрапортального введения криоконсервированных спленоцитов на выживаемость аллотрансплантата ткани щитовидной железы

Репозитарії

Схожі ресурси