Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят

Исследовано влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин с применением криозащитных сред на основе раствора диметилсульфоксида (ДМСО) на показатели сохранности и жизнеспособности первичной культуры тироцитов новорожденных поросят, представленной клеточной и фолликулярной фракци...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2011
Автори:	Билявская, С.Б., Устиченко, В.Д., Божок, Г.А., Легач, Е.И.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2011
Назва видання:	Проблемы криобиологии
Теми:	Криоконсервирование биообъектов
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44885
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят / С.Б. Билявская, В.Д. Устиченко, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 68-74. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-44885
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-448852013-06-07T03:07:16Z Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят Билявская, С.Б. Устиченко, В.Д. Божок, Г.А. Легач, Е.И. Криоконсервирование биообъектов Исследовано влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин с применением криозащитных сред на основе раствора диметилсульфоксида (ДМСО) на показатели сохранности и жизнеспособности первичной культуры тироцитов новорожденных поросят, представленной клеточной и фолликулярной фракциями. Определены оптимальные концентрации ДМСО для криоконсервирования клеток и фолликулов щитовидной железы. Досліджено вплив кріоконсервування зі швидкістю охолодження 1 градус/хв з використанням кріозахисних середовищ на основі розчину диметилсульфоксиду (ДМСО) на показники збереженості та життєздатності первинної культури тироцитів новонароджених поросят, представленою клітинною та фолікулярною фракціями. Визначено оптимальні концентрації ДМСО для кріоконсервування клітин і фолікулів щитовидної залози. Effect of cryopreservation with the cooling rate of 1 degree/min and cryoprotective media based on dimethylsulfoxide (DMSO) solution on survival and viability indices of newborn piglets thyrocyte primary culture, represented by cell and follicular fractions was studied. The optimal concentrations of DMSO for cryopreservation of thyroid gland cells and follicles were established. 2011 Article Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят / С.Б. Билявская, В.Д. Устиченко, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 68-74. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44885 611.441.085.23:615.014.41 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов
spellingShingle	Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Билявская, С.Б. Устиченко, В.Д. Божок, Г.А. Легач, Е.И. Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят Проблемы криобиологии
description	Исследовано влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин с применением криозащитных сред на основе раствора диметилсульфоксида (ДМСО) на показатели сохранности и жизнеспособности первичной культуры тироцитов новорожденных поросят, представленной клеточной и фолликулярной фракциями. Определены оптимальные концентрации ДМСО для криоконсервирования клеток и фолликулов щитовидной железы.
format	Article
author	Билявская, С.Б. Устиченко, В.Д. Божок, Г.А. Легач, Е.И.
author_facet	Билявская, С.Б. Устиченко, В.Д. Божок, Г.А. Легач, Е.И.
author_sort	Билявская, С.Б.
title	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
title_short	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
title_full	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
title_fullStr	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
title_full_unstemmed	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
title_sort	криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2011
topic_facet	Криоконсервирование биообъектов
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44885
citation_txt	Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят / С.Б. Билявская, В.Д. Устиченко, Г.А. Божок, Е.И. Легач // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 68-74. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии
work_keys_str_mv	AT bilâvskaâsb kriokonservirovaniepervičnojkulʹturytirocitovnovoroždennyhporosât AT ustičenkovd kriokonservirovaniepervičnojkulʹturytirocitovnovoroždennyhporosât AT božokga kriokonservirovaniepervičnojkulʹturytirocitovnovoroždennyhporosât AT legačei kriokonservirovaniepervičnojkulʹturytirocitovnovoroždennyhporosât
first_indexed	2025-07-04T03:27:27Z
last_indexed	2025-07-04T03:27:27Z
_version_	1836685352756051968
fulltext	68 * Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: s_bilyavskaya@mail.ru * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: s_bilyavskaya@mail.ru Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков УДК 611.441.085.23:615.014.41 С.Б. БИЛЯВСКАЯ, В.Д. УСТИЧЕНКО, Г.А. БОЖОК, Е.И. ЛЕГАЧ Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят UDC 611.441.085.23:615.014.41 S.B. BILYAVSKAYA, V.D. USTICHENKO, G.A. BOZHOK, E.I. LEGACH Cryopreservation of Thyroid Primary Culture of Newborn Piglets Исследовано влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин с применением криозащитных сред на основе раствора диметилсульфоксида (ДМСО) на показатели сохранности и жизнеспособности первичной культуры тироцитов новорожденных поросят, представленной клеточной и фолликулярной фракциями. Определены оптимальные концентрации ДМСО для криоконсервирования клеток и фолликулов щитовидной железы. Ключевые слова: тироцит, щитовидная железа, первичная культура, клеточная и фолликулярная фракции, криоконсер- вирование, субкультивирование. Досліджено вплив кріоконсервування зі швидкістю охолодження 1 градус/хв з використанням кріозахисних середовищ на основі розчину диметилсульфоксиду (ДМСО) на показники збереженості та життєздатності первинної культури тироцитів новонароджених поросят, представленою клітинною та фолікулярною фракціями. Визначено оптимальні концентрації ДМСО для кріоконсервування клітин і фолікулів щитовидної залози. Ключові слова: тироцит, щитовидна залоза, первинна культура, клітинна і фолікулярна фракції, кріоконсервування, субкультивування. Effect of cryopreservation with the cooling rate of 1 degree/min and cryoprotective media based on dimethylsulfoxide (DMSO) solution on survival and viability indices of newborn piglets thyrocyte primary culture, represented by cell and follicular fractions was studied. The optimal concentrations of DMSO for cryopreservation of thyroid gland cells and follicles were established. Key words: thyrocyte, thyroid gland, primary culture, cell and follicular fractions, cryopreservation, subculturing. The tasks of culturing and cryopreservation of thyroid gland cells are of great value in experimental and clinical transplantology due to possible application of organotypic and cell cultures in correction of thyroid deficiency [1, 7]. The advantages of cultured cells transplantation are, in particular, the minimization of procedure invasiveness, small amount of required ma- terial, since the defects in the organ biochemical func- tion could be compensated by 1–10% cells of the organ [6], as well as reduction of immunogenecity by elimina- tion of "passenger leukocytes", being co-stimulators of immune response [11]. There is an opinion that cryo- preservation also reduces immunogenecity due to decrease of a pool of antigen-presenting cells [16, 17], and the cell cultures unlike the native cell suspension have higher resistance to cryopreservation [15]. In this aspect a task about development of cryopreservation regimens for biological material directed to maximum preservation of viable cells is an actual one. It has been known that endocrine tissues are highly sensitive to various ischemic factors, osmotic changes, and effect of low temperatures. There are various reports presenting the cryopreservation methods for cells and tissues of some endocrine organs utilizing Вопросы культивирования и криоконсервиро- вания клеток щитовидной железы имеют большое значение в экспериментальной и клинической транс- плантологии в связи с возможностью применения органотипических и клеточных культур для коррек- ции тиреоидной недостаточности [1, 7]. К преиму- ществам трансплантации культивированных клеток можно отнести минимизацию инвазивности проце- дуры, небольшой объем необходимого материала, поскольку дефекты биохимической функции органа можно компенсировать 1–10% клеток органа [6], а также снижение иммуногенности путем элимина- ции “лейкоцитов-пассажиров”, которые являются костимуляторами иммунного ответа [11]. Сущест- вует мнение, что криоконсервирование также сни- жает иммуногенность за счет уменьшения пула антигенпрезентирующих клеток [16, 17], а клеточ- ные культуры по сравнению с нативной суспензией клеток обладают более высокой устойчивостью к процессу криоконсервирования [15]. В этом аспекте актуальным является вопрос разработки режимов криоконсервирования биологического материала, направленных на максимальное сохранение жизне- способных клеток. problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 69 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 low cooling rates, particularly 1 degree/min and DMSO cryoprotectant solution, which in certain concentration expressed an anti-ischemic effect [14]. There are the successful attempts to cryopreserve the pancreatic islet cells using 20% DMSO solution [12, 13], newborn piglet adrenal gland cell suspensions with 7% DMSO [8], Sertoli cell suspensions of rat fetal testes with 10% DMSO [10] and organotypic culture of newborn piglet thyroid gland with 7% DMSO [4]. The existing experimental data on cryopreservation of thyroid tissue [1, 3–5, 9] do not include the infor- mation about possibility of the freezing of primary cel- lular and follicular cultures of thyroid gland. The research aim is to study the survival and viabi- lity of cell and follicular fractions of newborn piglet thyrocyte primary culture after cryopreservation with the cooling rate of 1 degree/min in presence of various DMSO concentrations and further subculturing. Materials and methods The experiments in animals were performed accord- ing to the General ethical principles of experiments in animals, approved by the 3rd National congress on bioethics (Kiev, 2007) and agreed with the statements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1985). Thyrocytes and follicles were isolated from thyroid glands of newborn piglets by 3-stage enzyme disaggre- gation using 1 µg/ml collagenase of type I A and 0.15 µg/ml deoxyribonuclease (Sigma, USA) at 37°C with further cooling and 3-fold washing with the solu- tion, containing 0.2% of bovine serum albumin. Follicu- lar and cellular fractions were separated by filtration through the membrane with of 30 mm pores (Consalt T.S., Italy). After filtration the follicular fraction was mainly represented by middle size follicles (> 30 mm) and cellular fraction included thyrocytes, erythrocytes and small follicles (< 30 mm). The obtained fractions with concentration of cells 1×106 and follicles 1×105 were cultured in cultural flasks (Sarstedt, USA) with the medium 199, enriched by 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma, USA) supple- mented with antibiotics as penicillin (100 units/ml, kanamycine (200 µg/ml) and amphotericin B (1 µg/ml) at 37°C in the atmosphere of 5% CO2 for 6 days. The culture was disaggregated by incubation in 0.25% tryp- sin mixed with Versene solution in the 1:1 ratio at 37°C for 3 min with further adding of nutrition medium 199 with 5% FBS, and removed from the substrate by pipeting till the moment of monolayer detaching and then centrifuged at 1,000 rpm. The samples were cryopreserved in the program- able freezer (Cryoson 115, Germany) using the cooling rate of 1 degree/min [2] in presence of 10 and 15% DMSO both with and without adding 25% FCS. Thawing was carried-out on water bath at 37°C till Известно, что эндокринные ткани высоко чувст- вительны к различного рода ишемическим факто- рам, осмотическим изменениям, действию низких температур. В литературе широко представлены способы криоконсервирования клеток и ткани неко- торых эндокринных органов с использованием низ- ких скоростей охлаждения, в частности 1 градус/мин, и растворов криопротектора ДМСО, который в оп- ределенной концентрации обладает выраженным противоишемическим действием [14]. Описаны положительные результаты при замораживании островков поджелудочной железы в присутствии 20%-го раствора ДМСО [12, 13], суспензии клеток надпочечников новорожденных поросят – 7%-го [8], суспензии клеток Сертоли фетальных семенни- ков крыс – 10%-го [10], органотипической культуры щитовидной железы новорожденных поросят – 7%- го [4]. Накопленный в литературе экспериментальный материал по криоконсервированию тиреоидной ткани [1, 3–5, 9] не включает данные о возможности замораживания клеточных и фолликулярных пер- вичных культур щитовидной железы. Цель работы – изучение сохранности, жизнеспо- собности клеточной и фолликулярной фракций первичной культуры тироцитов новорожденных поросят после криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин в присутствии различных концентраций ДМСО и последующего субкульти- вирования. Материалы и методы Эксперименты на животных проводили в соот- ветствии с “Общими принципами экспериментов на животных”, одобренными III Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2007) и согласован- ными с положениями “Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985). Тироциты и фолликулы изолировали из щитовид- ных желез новорожденных поросят путем 3-этапной ферментативной дезагрегации с использованием 1 мкг/мл коллагеназы типа I А и 0,15 мкг/мл де- зоксирибонуклеазы (“Sigma”, США) при 37°С с по- следующим охлаждением и 3-кратной отмывкой раствором, содержащим 0,2% бычьего сывороточ- ного альбумина. Фолликулярную и клеточную фракции разделяли путем фильтрации через мемб- рану с диаметром пор 30 мкм (“Consalt T.S.”, Ита- лия). После фильтрации фолликулярная фракция была представлена в основном фолликулами сред- него диаметра (> 30 мкм), а клеточная фракция – тироцитами, эритроцитами и мелкими фолликулами (< 30 мкм). Полученные фракции c концентрацией клеток 1×106 и фолликулов 1×105 культивировали в 70 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 disappearance of a solid phase. After step-wise remo- val of cryoprotectant the cellular and follicular fractions were subcultured during 6 days in 24-well plate (Sarstedt, USA) with seeding concentration of 1×104 in 1 ml both of cells and follicles according the above described conditions. Post-thaw cell survival was determined as a total number of cells after thawing in respect of total number of cells prior to freezing and expressed in percents. A post-thaw number of viable cells was established using the method of supravital staining with trypan blue by calculation in hemocyto- meter and determined by the formula: VC = Σnonstained ×100,Σ total where Σnonstained is the number of living (nonstained) cells; Σtotal is total number of cells per vision field. By the 6th day the culture was fixed in 4% para- formaldehyde and stained with haematoxylin and eosin according to the standard method. Microscopy was carried-out with inverted light-optical microscope (Meiji Techno, Japan) equipped with digital camera and the software Bio Vision 4 was used for image processing. Statistical processing of results was performed with Student's t-criterion for samples with normal distribution of values and single-factor dispersion analysis (ANOVA) for non-parametric data. Results and discussion Cryopreservation of thyrocyte primary culture using different DMSO concentrations showed that the culture, obtained from follicular fraction (Fig. 1) was more resistant to freeze-thawing unlike the culture, passaged from cellular fraction (Fig. 2). This effect may be explained by preserved intercellular contacts of thyrocyte basal membranes, that is associated with morphological peculiarities of thyroid parenchyma. Whereas structure-functional unit of thyroid gland is a follicle, containing colloid, which is a product of thyroid epithelium cell secretion, it likely affects the follicle cell survival due to restriction of volumetric changes. The highest survival (95–97%) was characteristic for the samples of follicular fraction, cryopreserved with 15% DMSO both with serum and without it (see Fig. 1). The viability made 65–80%. These high values could be the result of using high concentrations of cryoprotectant in the case of cell clusters, due to its longer penetration into cells with the preserved intercel- lular bonds. This suggestion agrees with the reported data on cryopreservation of other type of cell clusters, pancreatic islets, where authors used successfully 20% DMSO concentration [12, 13]. Freezing with 10% DMSO resulted in insignificant reduction of survival and viability of follicular fraction. Herewith the cryoprotective effect of serum was found, культуральных флаконах (“Sarstedt”, США) на среде 199, обогащенной 10%-й фетальной телячьей сывороткой (ФТС) (“Sigma”, США) с добавлением антибиотиков – пенициллина (100 ЕД/мл), кана- мицина (200 мкг/мл) и амфотерицина Б (1 мкг/мл) при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 6 суток. Культуру дезагрегировали путем инкубации в 0,25%-м растворе трипсина, смешанном с раство- ром Версена в соотношении 1:1, при 37°С в течение 3 мин с последующим добавлением питательной среды 199 с 5% ФТС, снимали с подложки пипети- рованием до открепления монослоя и центрифуги- ровали при 1000 об/мин. Образцы криоконсервировали с использованием скорости охлаждения 1 градус/мин [2] в присут- ствии 10 и 15%-го ДМСО с добавлением и без до- бавления 25% ФТС на программном заморажива- теле (“Cryoson 115”, Германия). Отогрев проводили на водяной бане при 37°С до исчезновения твердой фазы. После ступенчатого удаления криопротек- тора клеточную и фолликулярную фракции субкуль- тивировали 6 суток в 24-луночном планшете (“Sarstedt”, США) при концентрации 1×104 клеток и фолликулов в 1 мл при описанных выше условиях. Сохранность клеток после криоконсервирования определяли как общее количество клеток после отогрева по отношению к общему количеству кле- ток до замораживания, выраженное в процентах. Количество жизнеспособных клеток после замора- живания-отогрева устанавливали методом супра- витального окрашивания с трипановым синим пу- тем подсчета в гемоцитометре и находили по формуле: ЖК = Σнеокр ×100,Σобщ где Σнеокр – количество живых (неокрашенных) кле- ток, Σобщ – общее количество клеток в поле зрения. На 6-е сутки культуру фиксировали в 4%-м пара- формальдегиде и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Микроскопию проводили на инвертированном светооптическом микроскопе (“Meiji Techno”, Япония) с цифровой ка- мерой и пакетом прикладных программ для обра- ботки изображения Bio Vision 4. Статистическую обработку результатов прово- дили с использованием t-критерия Стьюдента для выборки с нормальным распределением значений и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для непараметрических данных. Результаты и обсуждение Криоконсервирование первичной культуры тироцитов с использованием различных концентра- ций ДМСО показало, что культура, полученная из 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 71 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 фолликулярной фракции (рис. 1), более устойчива к замораживанию-отогреву по сравнению с культу- рой, полученной при пассаже клеточной фракции (рис. 2). Такой эффект можно объяснить сохранени- ем межклеточных контактов на базальных мемб- ранах тироцитов, что связано с морфологическими особенностями тиреоидной паренхимы. Поскольку структурно-функциональной единицей щитовидной железы является фолликул, содержащий продукт секрета клеток тиреоидного эпителия – коллоид, это возможно влияет на целостность клеток фолли- кула вследствие ограничения объемных измене- ний. Наиболее высокая сохранность (95–97%) была характерна для образцов фолликулярной фракции, криоконсервированных с 15%-м ДМСО как в при- сутствии сыворотки, так и без нее (см. рис. 1). Жиз- неспособность составляла 65–80%. Такие показ- атели можно объяснить использованием высоких концентраций криопротектора именно для клеточ- ных кластеров по причине более длительного его проникновения в клетки с сохраненными межкле- точными связями. Данное предположение согла- суется с исследованиями, в которых для криокон- сервирования другого вида клеточных кластеров – островков поджелудочной железы использовали 20%-й ДМСО [12, 13]. Замораживание в присутствии 10%-го ДМСО приводило к незначительному снижению сохран- ности и жизнеспособности фолликулярной фракции. При этом проявлялся криопротекторный эффект сыворотки – увеличение показателя сохранности на 10% по отношению к образцам, криоконсервиро- ванным без сыворотки. Культуры из клеточной фракции имели более низкие значения сохранности клеток по сравнению с фолликулярной (рис. 2). При использовании 10%-го раствора ДМСО в присутствии сыворотки отмече- ны максимальная сохранность (80,45%) и высокий уровень жизнеспособности клеток (89,82%). Добав- ление сыворотки к образцам с 10 и 15%-м ДМСО приводило к некоторому увеличению показателя сохранности по отношению к соответствующей бессывороточной криозащитной среде. Суммируя результаты сохранности и жизнеспо- собности после отогрева криоконсервированных образцов, можно сказать, что наиболее эффектив- ными концентрациями криопротектора для фолли- кулярной фракции являются 15%-й ДМСО и 10– 15%-й ДМСО с 25%-й ФТС – для клеточной. Микроскопически установлено, что в фоллику- лярной фракции после замораживания-отогрева образцов, криоконсервированных в присутствии 15%-го ДМСО, на 3-и сутки субкультивирования конфлюентность монослоя достигала 100%, а так- же были отмечены максимальные показатели со- хранности и жизнеспособности. С ох ра нн ос ть к ле то к, % C el l s ur vi va l, % Ж из не сп ос об но ст ь, % C el l v ia bi lit y, % Рис. 1. Влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1градус/мин в присутствии разных концент- раций ДМСО на сохранность ( ) и жизнеспособность ( ) первичной культуры, полученной из фолликулярной фракции щитовидной железы новорожденных поросят (n = 8). Fig. 1. Cryopreservation effect with the cooling rate of 1 de- gree/min in presence of DMSO different concentrations on survival ( ) and viability ( ) of primary culture, derived from follicular fraction of newborn piglets’ thyroid gland (n = 8). * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Рис. 2. Влияние криоконсервирования со скоростью охлаждения 1 градус/мин в присутствии разных концент- раций ДМСО на сохранность ( ) и жизнеспособность ( ) первичной культуры, полученной из клеточной фракции щитовидной железы новорожденных поросят (n = 8): * – значения достоверны по отношению к образцам, криоконсервированным с соответствующей концентрацией ДМСО без сыворотки (р < 0,05). Fig. 2. Cryopreservation effect with the cooling rate of 1 de- gree/min in presence of DMSO different concentrations on survival ( ) and viability ( ) of primary culture, derived from cellular fraction of newborn piglets’ thyroid gland (n = 8); integrity; viability: ∗ − values are significant in respect of the samples, cryopreserved with corresponding concen- tration of DMSO without serum (p < 0.05) 10% ДМСО 10% DMSO 10% ДМСО+ ФТС 10% DMSO + FCS 15% ДМСО 15% DMSO 15% ДМСО+ ФТС 15% DMSO + FCS 10% ДМСО 10% DMSO 10% ДМСО+ ФТС 10% DMSO + FCS 15% ДМСО 15% DMSO 15% ДМСО+ ФТС 15% DMSO + FCS С ох ра нн ос ть к ле то к, % C el l s ur vi va l, % Ж из не сп ос об но ст ь, % C el l v ia bi lit y, % 72 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 При микроскопическом исследовании первичной культуры тироцитов новорожденных поросят, полученной из фолликулярной фракции, наблю- далось спонтанное фолликулообразование при достижении конфлюентности монослоя как при нулевом, так и при первом пассажах (рис. 3, а, b): видны фолликулоподобные структуры, растущие на подложке клеток щитовидной железы. При субкуль- тивировании криоконсервированных образцов органоспецифическая дифференцировка не наблю- далась (рис. 3, c). Для таких образцов характерен равномерный монослой, представленный крупными клетками полигональной формы, как правило, с двумя ядрышками и широкими межклеточными пространствами. При культивировании клеточной фракции про- цесс органоспецифической дифференцировки про- i. e. 10% increase of survival index in respect of the samples cryopreserved without serum. The cultures from cellular fraction had lower cell survival values if compared with the follicular fraction (Fig. 2). When using 10% DMSO with serum the maximum survival (80.45%) and high level of cell via- bility (89.82%) were noted. Addition of serum to the samples with 10 and 15% DMSO resulted in some increasing of survival in respect of appropriate serum- free cryoprotective medium. Summarizing the results on post-thaw survival and viability in the samples, it is possible to conclude that the most effective concentrations of cryoprotectant in the case of follicular fraction is 15% DMSO and for cellular one is 10–15% DMSO with 25% FCS. Microscopical investigations showed that samples of follicular fraction after freeze-thawing with 15% Рис. 3. Первичная культура тироцитов новорожденных поросят (6-е сутки): а – нативный контроль (0 пассаж); b – на- тивный контроль (1 пассаж); c – суб- культивирование после заморажи- вания-отогрева образцов, криоконсер- вированных с использованием 15%-го ДМСО и 25%-й ФТС. Окраска гематок- силином и эозином (c). Фазовый конт- раст (а, b). ×200. Fig. 3. Thyroid primary culture of new- born piglets (6th day): a – native control (0 passage); b – native control (1st passa- ge); c – subculturing after freeze-thawing of samples, cryopreserved with 15% DMSO and 25% FBS. Staining with hae- matoxylin and eosin (c). Phase contrast (a, b). ×200. DMSO gave by the 3rd day of subcul- turing the 100% confluent monolayer, as well as the maximal indices of survival and viability. Microscopic investigation of new- born piglet thyrocyte primary culture obtained from the follicular fraction revealed spontaneous follicle-forma- tion after achieving the monolayer confluency both after zero and first passages (Fig. 3, a, b): the follicle-like structures, growing on substrate of thyroid gland cells were observed. During subculturing of frozen-thawed samples no organospecific differen- tiation was observed (Fig. 3, c). These samples are characterized by homo- genic monolayer, represented by large polygonal-shaped cells, usually with two nucleoli and wide intercellular spaces. During culturing of cellular fraction the organospecific differentiation was Фолликулярная фракция Follicular fraction Клеточная фракция Cellular fraction a b c 73 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 manifested only after zero passage (Fig. 3, a). The culture of the 1st passage is characterized by the solid homogenous monolayer without follicle formation (Fig. 3, b). Subcultured frozen-thawed cultures had spheroid formations with multilayer cell structure and multiply cords, consisting of tightly packed cells (Fig. 3, c). Conclusions 1. Cryopreservation of thyrocyte primary culture, obtained from follicular fraction of thyroid gland, using the cooling rate of 1 degree/min with 15% DMSO both with fetal calf serum and without it enables to achieve the maximal indices of cell survival (95–97%) and viability (65–80%). 2. The optimal condition for cryopreservation of primary culture, obtained from cellular fraction of thyroid gland with the cooling rate of 1 degree/min is the using of 10% DMSO solution supplemented with 25% FBS. являлся только при нулевом пассаже (рис. 3, а). Для культуры первого пассажа характерен плотный однородный монослой без образования фолликулов (рис. 3, б). В субкультивированных криоконсерви- рованных культурах выявлялись сфероподобные образования с многослойной клеточной структурой и многочисленные тяжи, состоящие из плотно упакованных клеток (рис. 3, в). Выводы 1. Криоконсервирование первичной культуры тироцитов, полученной из фолликулярной фракции щитовидной железы, со скоростью охлаждения 1 градус/мин с использованием ДМСО в концент- рации 15%, как в присутствии сыворотки, так и без нее позволяет достичь максимальных показателей сохранности (95–97%) и жизнеспособности (65– 80%) клеток. 2. Оптимальным условием криоконсервиро- вания первичной культуры, полученной из клеточ- ной фракции щитовидной железы со скоростью охлаждения 1 градус/мин, является использование 10%-го ДМСО в присутствии 25% ФТС. Литература Білявська С.Б. Корекція експериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур: Автореф. ... дис. канд. біол. наук.– Харків, 2008.– 20 с. Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., Луговой С.В. Уровень тиреоидных гормонов в плазме крови кроликов после ксенотрансплантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы новорожденных поросят // Проблемы криобиологии.– 2001.– №3.– С. 41–42. Волкова Н.А., Бондаренко Т.П. Функционирование крио- консервированной органной культуры щитовидной железы при экспериментальной аллотрансплантации // Проблеми мед. науки та освіти.– 2002.– №4.– С. 38–47. Легач Е.И., Билявская С.Б., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Гормонопродуцирующий потенциал криоконсервиро- ванной органотипической культуры щитовидной железы при комбинированной ксенотрансплантации // Проблемы криобиологии.– 2007.– Т. 17, №1.– С. 86–92. Луговий С.В. Вплив кріоконсервування на культуру клітин щитовидної залози новонароджених поросят: Автореф. дис. … канд. біол. наук.– Харків, 2003.– 18 с. Поташов Л.В. Перспективы трансплантации клеточных культур для коррекции некоторых эндокринных заболе- ваний // Новые Санкт-Петербург. врачеб. ведомости.– 1999.– №1.– С. 22–24. Третьяк С.И., Хрыщанович В.Я., Горанов В.А., Зомано- вич А.В. Функциональная оценка жизнедеятельности макроинкапсулированного тиреоидного ксенотрансплан- тата после пересадки в сосудистое русло // Белорус. мед. журн.– 2005.– Т. 12, №2.– С. 26–31. Устиченко В. Д. Функціональні властивості надниркових залоз новонароджених поросят при дії різних режимів заморожування: Автореф. дис. … канд. біол. наук.– Харків, 2008.– 20 с. Чуйко В.А., Чупринова С.И. Влияние низкотемпературной консервации на рост клеточной культуры щитовидной железы // Докл. АН УССР (Сер. Б).– 1982.– №10.– С. 77–81. References Bilyavs'ka S.B. Correction of experimental hypotheriosis by combined transplantation of organotypic cultures: Author's Abstract of the Cand. of Biol. Sciences.– Kharkiv, 2008.– 20 p. Bondarenko T.P., Volkova N.A., Lugovoy S.V. Thyroid hormone level in rabbits' blood plasma after xenotransplantation of cryopreserved organ culture of neonatal piglets' thyroid gland // Problems of Cryobiology.– 2001.– N3.– P. 41–42. Volkova N.A., Bondarenko T.P. Functioning of cryopreserved organ culture of thyroid gland at experimental allotrans- plantation// Problemy Med. Nauki ta Osvity.– 2002.– N4.– P. 38–47. Legach Ye.I., Bilyavskaya S.B., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Hormone-producing potential of cryopreserved organotypic culture of thyroid gland during combined xenotransplantation // Problems of Cryobiology.– 2007.– Vol. 17, N1.– P. 86–92. Lugovyy S.V. Cryopreservation effect on thyroid gland cell culture of newborn piglets: Author's Abstract of the Cand. of Biol. Sciences.– Kharkiv, 2003.– 18 p. Potashov L.V. Transplantation perspectives of cell cultures for correction of some endocrine diseases// Novye Sankt- Peterburg. Vracheb. Vedomosti.– 1999.– N1.– P. 22–24. Tret'yak S.I., Khryschanovich V.Ya., Goranov V.A., Zomano- vich A.V. Activity functional assessment of macroencapsu- lated thyroid xenotransplant after implantation into blood stream // Belorus. Med. Zhurn.– 2005.– Vol. 12, N2.– P. 26– 31. Ustichenko V.D. Functional peculiarities of adrenal glands of newborn piglets under effect of different freezing regimens: Author's Abstract of the Cand. of Biol. Sciences.– Kharkiv, 2008.– 20 p. Chuyko V.A., Chuprinova S.I. Effect of low temperature pre- servation on growth of thyroid gland cell culture // Doklady AN USSR. Ser. B.– 1982.– N10.– P. 77–81. Cameron D.E., Othberg A.J., Borlogan C.V. et al. Post-thaw viability and functionality of cryopreserved rat fetal cells cocu- ltured with Sertoli cells // Cell Transpl.– 1997.– Vol. 6, N2.– P. 185–189. Lafferty K.J., Bootes A., Dart G. et al. Effect of organ culture on the survival of thyroid allografts in mice // Transplantation.– 1976.– Vol. 22, N2.– P. 138–149. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 74 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 Cameron D.E., Othberg A.J., Borlogan C.V. et al. Post-thaw viability and functionality of cryopreserved rat fetal cells cocultured with Sertoli cells // Cell Transpl.– 1997.– Vol. 6, N2.– P. 185–189. Lafferty K.J., Bootes A., Dart G. et al. Effect of organ culture on the survival of thyroid allografts in mice // Transplantation.– 1976.– Vol. 22, N2.– P. 138–149. Lakey J.R., Aspinwall C.A., Cavanagh T.J. et al. Secretion from islets and single islets following cryopeservation // Cell Transpl.– 1999.– Vol. 8, N6.– P. 691–698. Lakey J.R., Rajotte R.V., Fedorov C.A. et al. Islet cryopreser- vation using intracellular preservation solutions// Cell Transpl.– 2001.– Vol. 10, N7.– P. 583–589. McGann L.E., Walterson M.L. Cryoprotection by dimethyl sulfoxide and dimethyl sulfone // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24, N1.– P. 11–16. Sandler S., Andersson A. The significance of culture for successful cryopreservation of isolated pancreatic islets of langerhans // Cryobiology.– 1984.– Vol. 21, N5.– P. 503–510. Taylor M.J., Bank H.L. Function of lymphocytes and macro- phages after cryopreservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity // Cryo- biology.– 1988.– Vol. 25, N1.– P. 1–17. Taylor M.J., Bank H.L., Benton M.J. Selective killing of leuco- cytes by freezing: potential for reducing the immunogenicity of pancreatic islets // Diabetes Res.– 1987.– Vol. 5, N2.– Р. 99–103. Поступила 28.09.2010 Рецензент И.В. Белочкина Lakey J.R., Aspinwall C.A., Cavanagh T.J. et al. Secretion from islets and single islets following cryopeservation // Cell Transpl.– 1999.– Vol. 8, N6.– P. 691–698. Lakey J.R., Rajotte R.V., Fedorov C.A. et al. Islet cryopreser- vation using intracellular preservation solutions// Cell Transpl.– 2001.– Vol. 10, N7.– P. 583–589. McGann L.E., Walterson M.L. Cryoprotection by dimethyl sulfoxide and dimethyl sulfone // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24, N1.– P. 11–16. Sandler S., Andersson A. The significance of culture for successful cryopreservation of isolated pancreatic islets of langerhans // Cryobiology.– 1984.– Vol. 21, N5.– P. 503–510. Taylor M.J., Bank H.L. Function of lymphocytes and macro- phages after cryopreservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity // Cryo- biology.– 1988.– Vol. 25, N1.– P. 1–17. Taylor M.J., Bank H.L., Benton M.J. Selective killing of leuco- cytes by freezing: potential for reducing the immunogenicity of pancreatic islets // Diabetes Res.– 1987.– Vol. 5, N2.– Р. 99–103. Accepted in 28.09.2010 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Криоконсервирование первичной культуры тироцитов новорожденных поросят

Репозитарії

Схожі ресурси