Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2011
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2011
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44895
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине – 2010” 27–28 мая 2010, г. Харьков // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 170-220. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-44895
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-448952013-06-07T03:06:36Z Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков 2011 Article Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине – 2010” 27–28 мая 2010, г. Харьков // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 170-220. — рос., англ. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44895 ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
format	Article
title	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
spellingShingle	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
title_short	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
title_full	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
title_fullStr	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
title_full_unstemmed	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков
title_sort	тезисы конференции молодых ученых “холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. харьков
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2011
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44895
citation_txt	Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине – 2010” 27–28 мая 2010, г. Харьков // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 170-220. — рос., англ.
first_indexed	2025-07-04T03:28:10Z
last_indexed	2025-07-04T03:28:10Z
_version_	1836685397592113152
fulltext	ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков Богданчикова О.А., Овсянников С.Е., Компаниец А.М. Функциональная полноценность криоконсервированных тромбоцитов в зависимости от режимов замораживания ............................................................................................................................................. Сосимчик И.А., Черкашина Д.В. Фетальные биорегуляторы снижают повреждения печени при гипотермическом хранении....... Пономарева В.Л. Влияние режимов охлаждения и консервирующих сред, содержащих альгинат натрия, на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae........................................................................................................................................... Кучков В.Н. Особенности распределения криопротекторов между вне- и внутриклеточной средой эритроцитов млекопита- ющих...................................................................................................................................................................................................... Розанова С.Л., Нардид О.А. Влияние быстрого и медленного замораживания на антиоксидантные свойства экстрактов плаценты..... Петрик М.А., Мартынюк И.Н. Снижение цитотоксичности мембранотропных криопротекторов до замораживания спермы индюка в присутствии белковых добавок............................................................................................................................................ Давыдова Е.В., Осецкий А.И. Кластерная кристаллизация водных растворов глицерина .............................................................. Маркова К.В., Бондаренко В.А. Связь между изменениями формы эритроцитов при действии модификаторов цитоскелет- мембранного комплекса и хлорпромазина (ХПР) и чувствительностью эритроцитов к холодовому шоку ............................................. Венцковская Е.А. Сон и тиреоидные гормоны у крыс при холодовой акклимации ........................................................................ Чернобай Н.А., Гурина Т.М., Пахомов А.В. Проникающая способность и криозащитная эффективность ряда криопротекторов....... Малюкина М.Ю., Кавок Н.С., Боровой И.А. Влияние криопротекторов ДМСО, 1,2-пропандиола и криовоздействия на чувст- вительность митохондриального потенциала одиночных гепатоцитов к регуляции фенилэфрином при оценке флуоресцентным методом..................................................................................................................................................................................................... Вязовская О.В., Николенко А.В. Корреляционный анализ показателей сохранности эритроцитов до и после замораживания в криозащитных средах различного состава на основе оксиэтилированного метилцеллозольва....................................................... Стриха О.А., Смольянинова Е.И. Определение удельной электрической проводимости ооцитов мыши в растворах сахарозы и проникающих криопротекторов методом импульсной кондуктометрии .......................................................................................... Муценко В.В., Петренко Ю.А. Криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток человека с использованием сахарозы... Михайлова О.А., Зубов П.М., Рязанцев В.В., Бабийчук Л.А. Структурно-функциональное состояние ядросодержащих клеток кордовой крови в процессе криоконсервирования ............................................................................................................................ Говорова Ю.С., Зинченко А.В. Влияние фракций экстрактов плаценты человека на фазовые переходы в клеточных суспензиях эритроцитов и Saccharomyces cerevisiae .............................................................................................................................................. Ляшенко Т.Д. Влияние ДМСО на поведение нервных клеток новорожденных крыс в условиях культивирования in vitro после замораживания-отогрева....................................................................................................................................................................... Димитров А.Ю., Луценко Е.Д., Челомбитько О.В., Останков М.В., Гольцев А.Н. Криоконсервирование как фактор модуляции иммунокорригирующего потенциала клеток фетальной печени....................................................................................................... Дейнеко Т.И., Маркова К.В., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Постгипертонический стресс и осмотические свойства заморо- женных-отогретых эритроцитов................................................................................................................................................................ Лысак Ю.С. Сохранность меристем винограда в процессе низкотемпературного консервирования............................................ Юрчук Т.А., Божок Г.А., Боровой И.А., Гурина Т.М., Бондаренко Т.П. Влияние криоконсервирования на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс................................................................................................................................. Дорофеева Т.В., Пишко О.В. Сохранность клеток микроорганизмов после иммобилизации в различных гелях с последующим замораживанием до –70°С................................................................................................................................................................... Дудецкая Г.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Подбор условий культивирования клеток надпочечников взрослых крыс............ Рогоза Л.А. Спектрофлуориметрические характеристики экстрактов сердца животных.................................................................. Сидоренко О.С., Божок Г.А., Легач Е.И. Экспрессия β-III тубулина в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят..... Бызов Д.В., Сандомирский Б.П. Применение физических факторов при создании девитализированных сосудистых скаффолдов...... Горина О.Л., Моисеева Н.Н., Гулевский А.К. Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на функциональную активность нейтрофилов донорской крови, подвергнутых гипотермическому хранению............................................................... Бабинец О.М. Сравнительное изучение терапевтического действия нативных и криоконсервированных пробиотиков, иммо- билизованных на энтеросорбентах, при экспериментальном дисбиозе ............................................................................................... Шевченко М.В. Экстракт печени оказывает угнетающее действие на нервные клетки новорожденных крыс, культивируемые in vitro.................................................................................................................................................................................................... Порожан Е.А., Останков М.В. Влияние криоконсервированных фетальных нервных клеток на стромальные и цитокин- продуцирующие клетки тимуса при развитии экспериментального аллергического энцефаломиелита....................................... Прокопюк В.Ю. Клинико-экспериментальная оценка эффективности криоконсервированной сыворотки кордовой крови в прегравидарной подготовке при антифосфолипидном синдроме..................................................................................................... Тищенко Ю.О., Кирошка В.В., Бондаренко Т.П. Значение стадии гистогенеза неонатальной овариальной ткани для ее развития в условиях гетеротопической трансплантации...................................................................................................................................... 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 191 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 192 Свидко Е.Н., Демин Ю.А. Экспериментальная модель лимбальной недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия для исследования действия криоконсервированных клеток крови.................................................................................. Кравченко М.А., Бондарович Н.А., Челомбитько О.В., Осецкий А.И., Гольцев А.Н. Влияние криоэкстракта липидов плаценты на структурно-функциональные изменения в региональных лимфоузлах крыс при адъювантном артрите................................ Бабаева А.Г., Чиж Н.А. Сравнительная характеристика ишемического и крионекроза миокарда................................................. Капустянська А.А., Ждан В.М., Шепітько В.І., Челішвілі А.Л. Використання кріоконсервованого екстракту плаценти в комплексному лікуванні подагричного артриту у хворих з ожирінням........................................................................................... Беспалова И.Г., Богатырева Е.О. Пептидный состав кожи крыс при холодовой травме............................................................... Кожина О.Ю., Онасенко Е.С., Бондарович Н.А., Гольцев А.Н. Механизмы формирования противовирусной резистентности после введения препарата “Криоцелл-Гемокорд”.............................................................................................................................. Юхта М.С., Волкова Н.А., Гончарук Е.И., Грищенко В.И. Восстановление дегенеративно измененной хрящевой ткани межпозвонковых дисков после неинъекционного введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток................... Грицай Д.В., Козлова А.О., Лебединский А.С. Трансплантация криоконсервированных клеток фетальной печени, заселенных в макропористые губки, крысам с печеночной недостаточностью...................................................................................................... Гольцев К.А., Кожина О.Ю., Сафранчук О.В., Останков М.В., Гольцев А.Н. Особенности изменения иммунного статуса крыс с острым гнойным перитонитом после лечения препаратом “Криоцелл-Гемокорд”.......................................................................... Abstracts of the Conference of Young Scientists “Cold in Biology and Medicine 2011” May, 18–19th, 2011, Kharkov, Ukraine Bogdanchikova O.A., Ovsyannikov S.Ye., Kompaniets A.M. Functional Value of Cryopreserved Platelets Depending on Freezing Regimens................................................................................................................................................................................................ Sosimchyk I.A., Cherkashina D.V. Fetal Bioregulators Attenuate Liver Damage During Hypothermic Storage....................................... Ponomareva V.L. Effect of Freezing Regimens and Preserving Media Containing Sodium Alginate on Saccharomyces cerevisiae Yeast Cell Viability............................................................................................................................................................................................. Kuchkov V.N. Peculiarities of Cryoprotectant Distribution between Extra- and Intracellular Medium of Mammalian Erythrocytes .... Rozanova S.L., Nardid O.A. Influence of Rapid and Slow Freezing on Antioxidant Properties of Human Placenta Extract.................. Petrik M.A., Martynyuk I.N. Cytotoxicity Reduction of Membrane-Tropic Cryoprotectants Prior to Freezing of Turkey Sperm in Presence of Protein Additives ..................................................................................................................................................................... Davydova E.V., Osetskiy A.I. Cluster Crystallization of Aqueous Glycerol Solutions........................................................................... Markova K.V., Bondarenko V.A. Relationship between Changes of Erythrocyte Shape under Effect of Cytoskeleton-Membrane Complex Modifiers and Chlorpromazine and Erythrocyte Sensitivity to Cold Shock.................................................................................... Ventskovska O.A. Sleep and Thyroid Hormones in Rats during Cold Acclimation................................................................................ Chernobai N.A., Gurina T.M., Pakhomov A.V. Permeability and Cryoprotective Efficiency of Several Cryoprotectants...................... Malyukina M.Yu., Kavok N.S., Borovoy I.A. Influence of DMSO, 1,2-Propanediol Cryoprotectants and Cryoexposure on Sensitivity of Single Hepatocyte Mitochondrial Potential to Regulation with Phenylephrine Assessed by Fluorescent Method............................. Vyazovska O.V., Nikolenko A.V. Correlation Analysis of Erythrocyte Survival Parameters Prior to and After Freezing in Cryoprotec- tive Media of Different Composition Based on Oxyethylated Methyl Cellosolve................................................................................ Strikha О.A., Smolyaninova Е.I. Determination of Mouse Oocyte Specific Electric Conductivity in Solutions of Sucrose and Permeative Cryoprotectants Using Electroporation Method ........................................................................................................................................... Mutsenko V.V., Petrenko I.А. Cryopreservation of Human Mesenchymal Stromal Cells Using Sucrose................................................... Mykhailova O.A., Zubov P.M., Ryazantsev V.V., Babiychuk L.A. Structural and Functional State of Cord Blood Nucleated Cells During Cryopreservation....................................................................................................................................................................................... Govorova Yu.S., Zinchenko A.V. Effect of Human Placental Extracts’ Fractions on Phase Transitions in Cell Suspensions of Erythrocytes and Saccharomyces cerevisiae.................................................................................................................................................................... Lyashenko T.D. DMSO Effect on Behavior of Nerve Cells of New-Born Rats During In Vitro Culturing after Freeze-Thawing............. Dimitrov A.Yu., Lutsenko Ye.D., Chelombitko O.V., Ostankov M.V., Goltsev A.N. Cryopreservation as Modulation Factor for Immune Correcting Potential of Fetal Liver Cells of Different Gestation Terms........................................................................................................ 226 227 228 229 230 231 232 233 234 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 193ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Deyneko T.I., Markova K.V., Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Post-Hypertonic Stress and Osmotic Properties of Frozen-Thawed Erythrocytes................................................................................................................................................................................................. Lysak Yu.S. Survival of Grape Meristems During Low-Temperature Preservation................................................................................ Yurchuk T.A., Bozhok G.A., Borovoy I.A., Gurina T.M., Bondarenko T.P. Cryopreservation Effect on Formation of J-Aggregates in Rat Adrenal Cortex Cells.............................................................................................................................................................................. Dorofeyeva T.V., Pishko O.V. Integrity of Microorganisms’ Cells after Immobilization in Different Gels with Following Freezing Down to –70°C............................................................................................................................................................................................... Dudetskaya G.V., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Selection of Culturing Conditions for Cells of Adult Rat Adrenal Glands.................. Rogoza L.A. Spectrofluorimetric Characteristics of Animal Heart Extracts.............................................................................................. Sidorenko O.S., Bozhok G.A., Legach E.I. Expression of β-III Tubulin in Newborn Piglet Adrenal Cell Culture..................................... Byzov D.V., Sandomirskiy B.P. Application of Physical Factors when Designing Devitalized Vascular Scaffolds................................... Gorina O.L., Moiseyeva N.N., Gulevsky A.K. Influence of Cord Blood Low-Molecular Fraction on Functional Activity of Human Blood Neutrophils after Hypothermic Storage......................................................................................................................................... Babinets O.M. Comparative Studying of Therapeutical Effect of Native and Cryopreserved Probiotics Immobilized on Enterosorbents during Experimental Dysbiosis...................................................................................................................................................................... Shevchenko M.V. Liver Extract Suppress In Vitro Cultured Nerve Cells of Newborn Rats........................................................................ Porozhan Ye.A., Ostankov M.V. Influence of Cryopreserved Fetal Nerve Cells on Stromal and Cytokine-Producing Thymus Cells during Development of Experimental Allergic Encephalomyelitis............................................................................................................. Prokopyuk V.Yu. Clinical and Experimental Assessment of Efficiency of Cryopreserved Cord Blood Serum in Pregnancy Preparing at Anti-Phospholipid Syndrome................................................................................................................................................................... Tischenko Yu.O., Kiroshka V.V., Bondarenko T.P. Importance of Histogenesis Stage of Neonatal Ovarian Tissue for Its Development under Conditions of Heterotopic Transplantation................................................................................................................................... Svidko Ye.N., Demin Yu.A. Experimental Model of Limbal Inefficiency of Cornea Epithelia Regional Stem Cells for Investigation of Cryopreserved Blood Cell Influence......................................................................................................................................................... Kravchenko M.A., Bondarovich N.A., Chelombitko O.V., Osetsky A.I., Goltsev A.N. Influence of Placental Lipid Cryoextract on Structure-Functional Changes in Regional Lymph Nodes of Rats with Adjuvant Arthritis...................................................................... Babayeva A.G., Chizh N.A. Comparative Characteristics of Ischemic Necrosis and Myocardium Cryonecrosis................................... Kapustyanska A.A., Zhdan V.M., Shepitko V.I., Chelishvili A.L. Application of Cryopreserved Placenta Extract in Combined Treatment of Gout Arthritis in Patients with Obesity.................................................................................................................................................. Bespalova I.G., Bogatyreva E.O. Peptide Composition of Rat Skin After Cold Trauma........................................................................ Kozhyna O.Yu., Onasenko Ye.S., Bondarovich N.A., Goltsev A.N. Mechanisms of Antiviral Resistance Formation after Injection of Preparation “Cryocell-Hemocord”............................................................................................................................................................ Iukhta M.S., Volkova N.A., Goncharuk Ye.I., Grischenko V.I. Reparation of Degenerative Changes in Intervertebral Disc Cartilage after Non-Injecting Introduction of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells .............................................................................................. Gritsay D.V., Kozlova A.O., Lebedinsky A.S. Transplantation of Cryopreserved Fetal Liver Cells Immobilized in Macroporous Sponge in Rats with Liver Failure......................................................................................................................................................................... Goltsev K.A., Kozhyna O.Yu., Safranchuk O.V., Ostankov M.V., Goltsev A.N. Peculiarities of Changes of Rats Immune Status with Acute Purulent Peritonitis after Treatment with Preparation “Cryocell-Hemocord”................................................................................ 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 Функциональная полноценность криоконсервированных тромбоцитов в зависимости от режимов замораживания О.А. БОГДАНчИКОВА, С.Е. ОВСЯННИКОВ, А.М. КОМПАНИЕЦ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Functional Value of Cryopreserved Platelets Depending on Freezing Regimens O.A. BOGDANCHIKOVA, S.YE. OVSYANNIKOV, A.M. KOMPANIETS Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 194 В исследованиях по разработке новых криоконсер- вантов для низкотемпературного консервирования тром- боцитов установлен высокий уровень криозащитного действия среды, содержащей комбинацию двух криопро- текторов – диметилацетамида (ДМАц) и оксиэтилиро- ванного глицерина со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn = 5). Цель работы – изучить функциональную полноцен- ность тромбоцитов человека после криоконсервирова- ния с разработанным криоконсервантом в зависимости от режимов замораживания. Тромбоциты получали дифференцированным цент- рифугированием дозы донорской крови человека из лейкотромбоцитарного слоя. Замораживание образцов осуществляли после 30-минутной экспозиции тром- боцитов с криозащитной средой, содержащей 10%-ю суммарную концентрацию ДМАц/ОЭГn = 5 в плазме. Охлаждение контейнеров с суспензией тромбоцитов про- водили с нерегулируемыми скоростями в парах жидкого азота при температуре –40…–45°С (режим 1) и –188… –193°C (режим 2), а также с регулируемой скоростью в камере программного замораживателя (режим 3). ДМСО в наших исследованиях является веществом срав- нения. Функциональную полноценность криоконсер- вированных тромбоцитов оценивали после удаления криопротекторов по следующим показателям: агрега- ция, индуцированная АДФ (200×10−6М) и коллагеном (6,7× 10−3М), реакция на гипотонический шок; ретракция тромбоцитарного сгустка, содержание продуктов пере- кисного окисления липидов мембран тромбоцитов (ос- нования Шиффа и гидроперекиси липидов), содержание антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза). Установлено, что для криоконсерванта ДМАц/ОЭГn = 5 наиболее высокий уровень функциональной полноцен- ности тромбоцитов получен при охлаждении по режиму 2, что, по-видимому, связано с отсутствием переохлажде- ния (не регистрировалось) и быстрым прохождением плато кристаллизации (≈2 мин). Для ДМСО более прием- лемы режимы 1 и 3 с медленными скоростями охлаж- дения. Использование нового криоконсерванта, содержа- щего комбинацию двух криопротекторов, и режима за- мораживания с быстрыми скоростями охлаждения поз- волило получить высокие и стабильные показатели функциональной полноценности криоконсервирован- ных тромбоцитов. Следует подчеркнуть важное значе- ние для результатов криоконсервирования таких факто- ров, как отсутствие переохлаждения внеклеточной среды и непродолжительное (до 2 мин) плато кристаллизации. The investigations on development of novel cryopro- tectant for low temperature preservation of platelets showed a high level of cryoprotective effect for medium, containing combination of two cryoprotectants: dimethyl acetamide (DMAc) and oxyethylated glycerol with polymerization degree of n = 5 (OEGn = 5). The research aim was to study the functional value of human platelets after cryopreservation with developed cryopreservative depending on freezing regimens. The platelets were obtained by differentiated centri- fugation of the sample of human donor blood by leukocyte- platelet layer method. The samples were frozen after 30 mi- nutes of platelets exposure with cryoprotective medium containing 10% total concentration of DMAc/OEGn = 5 in plasma. The containers with suspension of platelets were cooled without rate control in liquid nitrogen vapors under –40…–45°C (regimen 1) and under –188…–193°C (regimen 2), as well as with cotrolled rate in programmable freezer (regimen 3). In our study DMSO was the reference sub- stance. After removing the cryoprotectants the frozen- thawed platelets were evaluated for functional value by the following parameters: ADP (200×10–6М) and collagen (6,7× 10–3М) induced aggregation; hypotonic shock reaction; platelet clot retraction, content of lopid peroxidation pro- ducts in platelet membranes (Schiff’s bases and lipid hydro- peroxides); content of antioxidant enzymes (glutathione pe- roxidase and glutathione reductase). It was established that when using cryopreservative DMAc/OEGn=5 the highest level of platelet functional value was obtained under cooling regimen 2, and this was obvi- ously due to the absence of supercooling (it was not recor- ded) and rapid passing through the crystallization plateau (≈2 min). The regimens 1 and 3 were more admissible for DMSO under slow cooling rate. The application of novel cryopreservative, containing combination of two cryoprotectants, and the freezing regi- men with high cooling rates allowed to obtain a high and stable parameters of functional value of cryopreserved pla- telets. Major contribution in cryopreservation results of such factors as absence of extracellular medium supercool- ing and short (up to 2 min) crystallization plateau should be emphasized. Фетальные биорегуляторы снижают повреждения печени при гипотермическом хранении И.А. СОСИМчИК, Д.В. ЧЕРКАШИНА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Fetal Bioregulators Attenuate Liver Damage During Hypothermic Storage I.A. SOSIMCHYK , D.V. CHERKASHINA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 195ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Существующие сегодня консервирующие среды не обеспечивают полной сохранности изолированной пе- чени после долгосрочного гипотермического хранения (ГХ), что может быть связано с отсутствием в них биоло- гически активных соединений, способных регулировать клеточные процессы. Ранее в нашей лаборатории была показана эффективность предварительного введения животным in vivo белковых и пептидных биорегуляторов стволовых и прогениторных клеток в составе цитозоля фетальных тканей (ЦФТ) на модели ГХ и нормотерми- ческой реперфузии (НР). Цель работы – оценить влияние ЦФТ в составе раст- вора хранения на прооксидантно-антиоксидантное, энер- гетическое и функциональное состояние печени после ГХ и последующей НР. Цитозоль мягких тканей мезенхимально-мезодер- мального происхождения плодов крыс 15−16 дней гес- тации получали путём высокоскоростного ультрацентри- фугирования. Печень крыс хранили в течение 24 ч при 4°С в сахарозо-солевом растворе (ССР) с добавлением ЦФТ (100 мкл/100 мл) или без данной добавки, затем реперфузировали 60 мин при 37°С. В качестве контроля использовали свежеизолированную печень. В гомогена- тах печени исследовали: дыхательную активность, содер- жание АТФ, базальный уровень и скорость накопления малонового диальдегида (МДА), активность антиокси- дантных ферментов. Спонтанную продукцию активных форм кислорода (АФК) оценивали по интенсивности флуоресценции дигидрородамина 123. Функцию печени определяли по скорости потока желчи в процессе НР. Хранение и последующая НР печени приводили к разобщению окислительного фосфорилирования, уве- личению спонтанной продукции АФК, базального уровня и скорости накопления МДА, снижению актив- ности антиоксидантных ферментов, уровня АТФ и ско- рости продукции желчи. Присутствие в среде хранения ЦФТ препятствовало нарушению энергетического соп- ряжения, что способствовало практически полному вос- становлению уровня АТФ. При этом после ГХ снижа- лась продукция АФК, после НР – базального уровня МДА, а скорость его накопления была ниже контроля и значений ССР-группы на всех этапах эксперимента. В присутствии ЦФТ также наблюдалось частичное восста- новление активности всех антиоксидантных ферментов, кроме Г6ФДГ. Внесение ЦФТ в ССР сохраняло скорость продукции желчи на уровне свежеизолированного органа. Выраженный защитный эффект фетальных биорегу- ляторов в отношении печени в условиях околонулевых температур определяет перспективность их использова- ния в качестве компонентов растворов для холодового хранения изолированных органов. Up-to-date preservation media do not ensure sufficient integrity of isolated liver after long-term hypothermic storage (HS). It can be due to the solution deprivation of biologically active substances, which are able to regulate cell processes. It was shown in our laboratory that animal pretreatment in vivo with protein and peptide bioregulators of stem and progenitor cells contained in fetal tissue cytosol (FTC) was effective in the model of liver HS and normother- mic reperfusion (NR). The research aim was to investigate the influence of FTC added to storage solution on prooxidant-antioxidant, energetic and functional liver state after HS and following NR. The cytosol was obtained from mesenchymal-meso- dermal tissues of rat fetuses of 15–16 gestation days by high-speed centrifugation. Rat livers were stored during 24 h at 4°С in sucrose-saline solution (SSS) with or without adding of FTC (100 µl/100 ml), then were reperfused for 60 min at 37°C. Freshly isolated livers were used as the control. Res- piratory activity, ATP level, malone dialdehyde (MDA) basal level and accumulation rate, antioxidant enzyme activities were investigated in liver homogenates. Spontaneous production of reactive oxygen species (ROS) was deter- mined by fluorescence intensity of dihydrorhodamine 123. Liver function was determined by bile flow rate during NR. Liver storage and following NR led to the uncoupling of oxidative phosphorylation, to the enhancement of ROS spontaneous production, basal level and accumulation rate of MDA and to the decrease of antioxidant enzyme activity, ATP level and bile production rate. The FTC presence in storage solution prevented the impairment of oxidative phosphorylation coupling degree that promoted almost full recovery of ATP level. At this time ROS production dec- reased after HS and MDA basal level – after NR, but accu- mulation rate was lower than in the control and in SSS- group at all steps of the experiment. The partial recovery of all antioxidant enzyme activity, excepting G6PDG, was also observed in the presence of FTC. Supplementation of SSS with FTC maintained bile production rate similar to freshly isolated organ values. Pronounced protective effect of fetal bioregulators on the liver under conditions of near-zero temperatures indi- cates the prospects of their application as components of solution for isolated organ cold storage. Влияние режимов охлаждения и консервирующих сред, содержащих альгинат натрия, на жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae В.Л. ПОНОМАРЕВА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Freezing Regimens and Preserving Media Containing Sodium Alginate on Saccharomyces cerevisiae Yeast Cell Viability V.L. PONOMAREVA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 196ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Одной из актуальных проблем современной биотех- нологии является использование в производственном процессе иммобилизованных клеток микроорганизмов, являющихся продуцентами ферментов, гормонов, вита- минов и других активных соединений. Иммобилизация микроорганизмов путем их вклю- чения в структуру гелей позволяет достичь высокой плот- ности клеток в биореакторе, что увеличивает продуктив- ность биотехнологических процессов. Кроме того, мик- робные клетки, иммобилизованные в матриксе гидро- геля, в определенной степени защищены от таких небла- гоприятных воздействий окружающей среды, как измене- ния рН и температуры, воздействие органических раст- ворителей и токсических соединений в высокой концент- рации, а также от влияния чужеродной микрофлоры. Это обеспечивает рентабельность любого производст- венного процесса. Поэтому среди актуальных научных и практических задач большое значение на современном этапе имеет криоконсервирование культур микроорганизмов в им- мобилизованном состоянии, обеспечивающее сохране- ние максимального количества жизнеспособных клеток с исходными гено- и фенотипическими свойствами. Целью исследования было изучение влияния защит- ных сред на жизнеспособность клеток дрожжей при охлаждении с разными скоростями. Объектом исследования были дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae (раса получена из РНИИ хлебо- пекарной промышленности, Санкт-Петербург). Дрожжи культивировали в неохмеленном пивном сусле при 30°С с аэрацией до стационарной фазы роста. В качестве за- щитных сред использовали: дистиллированную воду; 1% раствор альгината натрия; 5% ДМСО; 1% раствор аль- гината натрия с добавлением 5% ДМСО. Исследуемые образцы охлаждали со скоростями 1; 5; 10; 15°С/мин до −40°С с последующим погружением в жидкий азот. Отогревали образцы на водяной бане при температуре 37°С. Жизнеспособность дрожжей Saccharomyces cerevi- siaе оценивали чашечным методом Коха. Было установлено, что на сохранность клеток Saccha- romyces cerevisiae в процессе криоконсервирования влияют режимы охлаждения и состав среды криоконсер- вирования. Во всех средах консервирования как без за- щитных компонентов, так и с добавлением криопротек- тора наиболее высокие результаты получены при охлаж- дении со скоростью 1°С/мин. При повышении скорости охлаждения количество жизнеспособных клеток досто- верно уменьшалось. Впервые показан выраженный криозащитный эффект при замораживании дрожжей в альгинатном геле. При замораживании со скоростью 1°С/мин в 1% геле альгината натрия сохранялись жизне- способными 90,8% клеток; в ДМСО – 87,1%; в 1% альгинате натрия с добавлением 5% ДМСО – 86,1%. One of the actual tasks of current biotechnology is ap- plication of immobilized cells of microorganisms, being producers of enzymes, hormones, vitamins and other active compounds in the production process. Immobilization of microorganisms by means of their introduction into gel structure enables to achieve a high cell density in bioreactor, increasing productivity of bio- technological processes. Moreover, microbial cells, immobi- lized in hydrogel matrix are to some extent protected against adverse environmental effects such as pH and temperature changes, the action of highly concentrated organic solvents and toxic substances as well of xenogenic microflora. This provides efficiency of any production stage. Therefore among actual scientific and practical tasks the cryopreservation of microorganism cultures in immo- bilized state, providing preservation of maximum number of viable cells with initial gene- and phenotype properties is nowadays of a great value. The research aim was to study the effect of protective media on yeast cell viability when cooling under different rates. The research objects were yeast cells Saccharomyces cerevisiae (strain was obtained from Russian Institute for Scientific Research of Baking Industry, Saint Petersburg). The yeast were cultured in unhopped wort syrup at 30°C with aeration to stationary growth phase. Distilled water, 1% sodium alginate solution, 5% DMSO solution, 1% sodium alginate solution supplemented with 5% DMSO were used as protective media. The studied samples were cooled with the rates of 1; 5; 10; 15°C/min down to −40°C with further plunging into liquid nitrogen. The samples were thawed on water bath at 37°C. Viability of yeast S. cerevisiae was evaluated by Koch’s plate method. It was established that cooling regimens and cryopre- servation medium composition affected the integrity of S. cerevisiae cells during cryopreservation. In all the cryo- preservation media both without protective components and supplemented with cryoprotectant the highest results were obtained when cooling with the rate of 1°C/min. A number of viable cells significantly decreased when increas- ing the cooling rate. For the first time an expressed cryopro- tective effect was shown when yeast were frozen in alginate gel. After freezing with the rate of 1°C/min in 1% sodium alginate gel 90.8% of cells were viable; when using DMSO we observed 87.1% viability; and application of 1% sodium alginate supplemented with 5% DMSO resulted in 86.1% viability. Особенности распределения криопротекторов между вне- и внутриклеточной средой эритроцитов млекопитающих В.Н. КУчкОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Peculiarities of Cryoprotectant Distribution between Extra- and Intracellular Medium of Mammalian Erythrocytes V.N. KUCHKOV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 197ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Распределение криозащитных веществ между эрит- роцитом и средой представляет собой один из показа- телей взаимодействия этих веществ с клеткой. В криобио- логии исследование распределения криопротекторов между клеткой и средой является важным звеном при создании криозащитных сред и методов удаления крио- протектора из биологической системы после цикла замо- раживания-отогревания. Известно, что трансмембранные потоки вещества и распределение его между клеткой и средой не описы- ваются простыми уравнениями диффузии и количест- венная оценка фракций внутри- и внеклеточного вещест- ва в большинстве случаев может быть получена эмпири- ческим путем. Цель работы – определение коэффициентов распре- деления диметилсульфоксида, 1,2-пропандиола и глице- рина между эритроцитами млекопитающих и внекле- точной средой в условиях диффузионного равновесия и оценка влияния на эти коэффициенты фракции крио- протектора, связанного с клеткой. Коэффициенты распределения оценивали методом рефрактометрии на основании анализа показателей пре- ломления внеклеточных растворов, полученных центри- фугированием суспензий эритроцитов, содержащих крио- протекторы. Установлено, что для эритроцитов быка и лошади в об- ласти низких концентраций криопротектора (до 5% масс.) существует зависимость коэффициентов распределения от концентрации криозащитного вещества. Причиной воз- никновения нелинейности в данном концентрационном диапазоне является существование фракции криопро- тектора, адсорбированной содержимым эритроцита. По количеству фракции связанного с клеткой криопротек- тора исследуемые вещества можно расположить в ряд: ДМСО, глицерин и 1,2-пропандиол, в котором концент- рация адсорбированного криопротектора увеличивается. Экспериментально показано, что многократным (до 7 раз) отмыванием клеток отмывочными растворами невозможно удалить фракцию связанного с клетками криопротектора. Данный факт следует учитывать при оценке токсичности криозащитных веществ и дальней- шем использовании криоконсервированных эритро- цитов в медицинской практике. The distribution of cryoprotective substances between erythrocyte and medium is one of the indices of interaction of these substances with a cell. In cryobiology the inves- tigation of cryoprotectant distribution between cell and medium is an essential link when developing the cryopro- tective media and methods of cryoprotectant removal out of biological system after freeze-thawing cycle. It is known that the transmembrane flows of the sub- stance and its distribution between cell and medium are not described with simple diffusion equations and quantitative assessment of intra- and extracellular substance fractions may be obtained empirically in most cases. The aim of work was the determination of distribution coefficients of dimethyl sulfoxide, 1,2-propane diol and gly- cerol between mammalian erythrocytes and extracellular medium in the conditions of diffusion balance as well as estimation of influence on these coefficients of cell-bound cryoprotectant fraction. The distribution coefficients were assessed by refracto- metry method on the base of analysis of extracellular solution refraction indices obtained by centrifugation of erythrocyte suspension containing cryoprotectants. It was established that the dependence of distribution coefficients on cryoprotective substance concentration occurs for bovine and equine erythrocytes in the range of low cryoprotectant concentrations (up to 5% w/w). Non- linearity appeared in given concentration range is caused by the occurrence of cryoprotectant fraction adsorbed by erythrocyte contents. According to the amount of cell- bound cryoprotectant fraction the investigated substances form the following row: DMSO, glycerol and 1,2-propanediol wherein a concentration of adsorbed cryoprotectant increa- ses. It was experimentally shown that it was impossible to remove the fraction of cell-bound cryoprotectant by multiple (up to 7 times) cell washing with washing solutions. This fact should be taken into account during evaluation of cryo- protective substance toxicity and further application of cryo- preserved erythrocytes in clinics. Влияние быстрого и медленного замораживания на антиоксидантные свойства экстрактов плаценты С.Л. РОЗАНОВА, О.А. НАРДИД Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Influence of Rapid and Slow Freezing on Antioxidant Properties of Human Placenta Extract S.L. ROZANOVA, O.A. NARDID Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 198ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Известно, что экстракты плаценты человека (ЭПЧ) благодаря наличию в них биологически активных ве- ществ обладают различной терапевтической активностью. Считается, что данная активность связана с их антиокси- дантными свойствами. Для увеличения срока хранения препаратов в кли- нической практике используют низкие температуры. Од- нако влияние криоконсервирования на гетерогенные макро- молекулярные соединения, обладающие антиоксидант- ной активностью, в частности ЭПЧ, изучено недостаточно. Таким образом, целью данной работы было изучить влияние замораживания-оттаивания на антиоксидантные свойства экстрактов плаценты человека. Водно-солевые экстракты плаценты получали из го- могената ткани, освобожденной от соединительной тка- ни. Экстракты замораживали до –20 и −196°С со скорос- тями 1−2 и 300 град./мин соответственно. Отогрев осу- ществляли на водяной бане при 20°С. Свежевыделенные и подвергнутые замораживанию-оттаиванию экстракты разделяли методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200. Антиоксидантную активность (АОА) ЭПЧ оценивали по способности восстанавливать ABTS+- радикал, а также хелатировать ионы железа. Кинетика восстановления ABTS+ имеет две фазы: быструю (за 10 с) и медленную (за следующие 390 с). Первая обусловлена низкомолекулярными антиокси- дантами, вторая – молекулами различных молекулярных масс. Медленное замораживание до −20°С приводит к снижению АОА ЭПЧ, что обусловлено снижением ак- тивности антиоксидантов, ответственных за быструю фа- зу, в то время как увеличение активности после быстрого замораживания до −196°С – увеличением активности медленно восстанавливающих антиоксидантов. Исследо- вание отдельных фракций ЭПЧ показало, что практи- чески все фракции обладают АОА и имеют как быстро, так и медленно восстанавливающие центры. Показано, что замораживание-оттаивание ЭПЧ приводит к увели- чению АОА полученных из них фракций с различными молекулярными массами, начиная с 700 кДа. Снижение активности ЭПЧ главным образом происходит из-за ее уменьшения в низкомолекулярных фракциях (менее 5 кДа). Показано, что хелатирующая активность ЭПЧ снижа- ется после медленного замораживания и увеличивается после быстрого. Полученные результаты позволяют пред- положить, что быстрое замораживание ЭПЧ приводит к увеличению их АОА за счет конформационных изме- нений белковых молекул с различными молекулярными массами. Human placenta extract (HPE) appears to possess diffe- rent therapeutical activity due to high concentration of bioactive substances. Such an activity of HPE is believed to be related to its antioxidant properties. Low temperatures are widely used in clinical practice in order to increase preparation shelf life. However, influence of cryopreservation on heterogeneous macromolecule compo-sition which is known to possess antioxidant activity, in particular, on human placenta extract, has been inves- tigated insufficiently. Thus the aim of the present study was to investigate the influence of freeze-thawing on human placenta extract antioxidant properties. Aqueous-saline HPEs were obtained from homogenate of placenta tissues separated from conjunctive tissue. The extracts were frozen down to –20 and to –196°C with 1–2 and 300 deg/min rates, correspondingly. Extracts were thawed on the water bath at 20°С. Fresh and frozen-thawed extracts were separated by the gel-chromatography method using the column with Sephadex G-200. Antioxidant activity of HPEs was estimated by ability to reduce ABTS+ cation radical and by ferrous ions (Fe2+) chelating ability. ABTS+ radical reduction kinetics has two phases: fast (up to 10 sec) and slow (up to 390 sec). First phase is pro- vided by low molecular weight antioxidants, the second one is due to molecules of different molecular weight. Slow freezing down to –20°С leads to lowering of extract anti- radical activity and it is due to decreasing of antioxidants activity responsible for the rapid phase, whereas increasing of this activity due to antioxidants responsible for slow phase has been revealed after rapid freezing down to –196°С. Decolorization assay of separate HPE fractions has shown that almost all the fractions possess antioxidant activity and contain both rapid and slow-reducing centers. Freeze-thawing of HPEs has been shown to lead to increas- ing the antiradical activity in several fractions with different molecular weights starting with 700 kDa. Lowering of HPE antiradical activity occurs mainly due to its decreasing in low-molecular fractions (less than 5 kDa). It has been demonstrated that chelating ability of HPE reduces after freezing down to –20°С while it increases after rapid freezing down to –196°С. Obtained results allow to assume that rapid freezing of HPE leads to the increasing of antioxidant activity due to conformational changes of protein molecules with different molecular weights. Снижение цитотоксичности мембранотропных криопротекторов до замораживания спермы индюка в присутствии белковых добавок М.А. ПЕТРИК1, И.Н. МАРТЫНЮК2 1Харьковский государственный университет им. В.Н. Каразина 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Cytotoxicity Reduction of Membrane-Tropic Cryoprotectants Prior to Freezing of Turkey Sperm in Presence of Protein Additives M.A. PETRIK1, I.N. MARTYNYUK2 1V.N. Karazin Kharkiv National University 2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 199ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Incubation of avian sperm with cryoprotectants (CPs) prior to freezing for a short period induces the increasing of morphologically abnormal cell number, reduces motility and after 3–4 hrs later the contact even under hypothermia conditions (4°C) their complete death is observed. It was found that one of the methods of cytotoxicity reduction for CP with an expressed membrane-tropicity was introduction into cryoprotective medium of protein additives, particularly, albumins. The research aim was to study the cytotoxicity reduction mechanism of membrane-tropic CPs at the stage of preparation to freezing of turkey sperm in presence of protein additives. There was used turkey sperm of “White deep-chested” breed of 10–12-month-old individuals, deriving it by the Askaniya method. To estimate sperm survival the motility (motility vs. time), a number of cells with damaged membrane and morphological abnormalities were determined. There were studied CPs such as: ethylene glycol (EG), 1,2-propane diol (1,2-PD), 2,3-butane diol (BD), formamide (FA), dimethyl formamide (DMFA), dimethyl acetamide (DMAc). The inter- action of CPs with egg albumin (EA) in presence of brom- thymol blue was investigated. Literature data on the mentio- ned problem were analyzed. There is discussed the mechanism of CP cytotoxicity reduction in presence of EA based on the formation of solid complex “EA + CPs”, affecting the distribution of CPs be- tween cell and intercellular medium, therefore not enabling to achieve their critical concentrations, within which their damaging effect starts to be manifested. Hydrophilic FA, EG, 1,2-PD form the complex “EA + CPs” mainly by spe- cific interaction of H-bonds with protein surface. In forma- tion of protein complex with DMFA, DMAc and 2,3-BD, possessing the expressed membrane-tropic properties both specific (H-bond) and non-specific hydrophobic inter- actions with predominant contribution of the latter play a role. A balance in favor of one or another mechanism of albumin interaction with CPs depends on hydrophilic- hydrophobic balance of their molecules. Инкубация спермиев птиц с криопротекторами (КП) до замораживания в течение короткого времени увели- чивает количество морфологически аномальных клеток, снижает подвижность и через 3−4 ч контакта, даже при гипотермии (4°C), наблюдается их полная гибель. Обна- ружено, что одним из способов снижения цитотоксич- ности КП с выраженной мембранотропностью является введение в криозащитную среду белковых добавок, в частности альбуминов. Цель данной работы – исследовать механизм сниже- ния цитотоксичности мембранотропных КП на этапе под- готовки к замораживанию спермы индюка в присутствии белковых добавок. Использовали сперму индюка породы “Белая широ- когрудая” возрастом 10−12 месяцев, получая ее асканийс- ким способом. Для оценки сохранности спермиев опре- деляли подвижность, переживаемость (подвижность во времени), количество клеток с поврежденной мембраной и морфологическими аномалиями. Изучены КП: этилен- гликоль (ЭГ), 1,2-пропандиол (1,2-ПД), 2,3-бутандиол (2,3- БД), формамид (ФА), диметилформамид (ДМФА), диме- тилацетамид (ДМАц). Изучено взаимодействие КП с яичным альбумином (ЯА) в присутствии бромтимолового синего. Проведен анализ литературных данных по ука- занной проблеме. Обсуждается механизм снижения цитотоксичности КП в присутствии ЯА, основанный на образовании проч- ного комплекса “ЯА + КП”, который влияет на распре- деление КП между клеткой и внеклеточной средой и тем самым не позволяет достичь критических значений их концентраций, при которых начинает проявляться пов- реждающее действие. Гидрофильные ФА, ЭГ, 1,2-ПД об- разуют комплекс “ЯА + КП” преимущественно специ- фическим взаимодействием с поверхностью белка Н-свя- зями. В образовании комплекса белка с ДМФА, ДМАц и 2,3-БД, обладающими выраженными мембранотропными свойствами, играют роль как специфические (Н-связь), так и неспецифические гидрофобные взаимодействия с преимущественным вкладом последних. Соотношение в пользу того или другого механизма взаимодействия альбумина с КП зависит от гидрофильно-гидрофобного баланса их молекул. 200 Кластерная кристаллизация водных растворов глицерина Е.В. ДАВЫДОВА, А.И. ОСЕЦКИЙ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Cluster Crystallization of Aqueous Glycerol Solutions E.V. DAVYDOVA, A.I. OSETSKIY Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Ранее были рассмотрены термодинамические ас- пекты кластерной кристаллизации охлаждаемых крио- протекторных растворов и возможные модели образую- щихся кластеров, а также сформулированы принципы учета этого явления при построении соответствующих диаг- рамм состояния [Осецкий А.И., 2009; Осецкий А.И., 2011]. Принципиальное отличие этих диаграмм от традиционно используемых в криобиологии диаграмм эвтектического типа обусловлено введением новой кластерной фазы βc, что впервые позволит объяснить эффект понижения ли- нии солидуса охлаждаемых криопротекторных раст- воров до температуры стеклования и открывать новые воз- можности для трактовки механизмов повреждения крио- консервируемых биообъектов в зонах витрификации. Однако вопрос о закономерностях кластерной кристал- лизации водных растворов различных криопротекторных веществ по-прежнему остается открытым и требует тща- тельного изучения различными экспериментальными методами. Цель работы – исследовать возможность кластерной кристаллизации в водных растворах глицерина методом дифференциальной объемной сканирующей тензодила- тометрии. В результате проведенных исследований обнаружена ярко выраженная особенность кинетики кристаллизации растворов в интервалах исходных весовых концентраций глицерина Cв 58...62%. В растворах этих концентраций не образуются кристаллы льда на этапе охлаждения вплоть до температуры стеклования, но происходит интенсивная кристаллизация воды в процессе последующего отогрева в диапазоне температур −100…−60°С. При этом масса образующихся при отогреве кристаллов льда опреде- ляется только конечной температурой предварительного охлаждения и концентрацией Cв, резко уменьшаясь при ее отклонении в обе стороны от указанного интервала. В отличие от высказанных ранее предположений [Зин- ченко А.В. и др., 1982] кинетика кристаллизации при отогреве практически не зависит от соотношения ско- ростей охлаждения и нагрева в области используемых в криобиологии значений. С точки зрения классических представлений полученные результаты противоречат принципу Ле-Шателье и не находят объяснения в рамках закономерностей эвтектической кристаллизации. В связи с этим проведен анализ данного эффекта с позиций клас- терной кристаллизации, так как исследованные интер- валы температур и концентраций характерны для жидких микрофаз в криоконсервируемых биообъектах к момен- ту реализации в них кластерного образования нанокрис- таллов льда. Показано хорошее совпадение полученных результатов с кластерной моделью кристаллизации, рас- смотрены механизмы повреждения криоконсервиру- емых биообъектов за счет данного явления и сделаны выводы о возможности их ингибирования. Recently there have been considered thermodynamic aspects of cluster crystallization of cooling cryoprotectant solutions and possible models of forming clusters as well as there were specified the principles of consideration this phenomenon during building-in of corresponding state diag- rams [Osetskiy A.I., 2009; Osetskiy A.I., 2011]. Fundamental difference of these diagrams from the traditionally used in cryobiology eutectic diagrams is conditioned by the intro- duction of a new cluster phase βc, which for the first time will allow the explanation of the effect of solidus line lowe- ring in cooling cryoprotectant solutions down to vitrification temperature and open new possibilities for interpreting of cryopreserved bioobject damage mechanisms in vitrification zones. However, the task about the regularities of cluster crystallization of aqueous solutions of different cryopro- tectant substances has still remained open and demands careful studying with various experimental methods. The research aim was to investigate the possibility of cluster crystallization in aqueous glycerol solutions by the method of differential volumetric scanning tenzodilatometry. In the result of carried-out investigations there was de- tected a strongly marked peculiarity of solution crystalli- zation kinetics within the intervals of initial glycerol weight concentrations Cw 58…62%. In the solutions of these con- centrations the ice crystals are not formed at the cooling stage down to the vitrification temperature but intensive water crystallization in the process of following thawing within the temperature range –100°C…–60°C occurs. More- over, the mass of crystals formed during warming is deter- mined only by final temperature of preliminary cooling and by concentration Cw, sharply decreasing during its deviation towards both sides from the mentioned interval. In contrast to the previous suggestions [Zinchenko A.V. et al., 1982] kinetics of crystallization during thawing almost does not depend on ratio of the cooling and thawing rates in the range of values used in cryobiology. According to the classical notions the obtained results contradict Le Chatelier principle and do not find the explanation in the regulations of eutectic crystallization. Therefore there was carried-out the analysis of this effect as for the cluster crystallization since the investigated temperature and concentration inter- vals are characteristic for liquid microphases in cryopreser- ved bioobjects in the moment of occurence of the ice nanocrystal cluster formation. It was shown a good matching of the obtained results with cluster model of crystallization, there were considered the mechanism of damaging of bio- objects to be cryopreserved due to this phenomenon and the possibility of their inhibition was concluded. 201 Связь между изменениями формы эритроцитов при действии модификаторов цитоскелет-мембранного комплекса и хлорпромазина и чувствительностью эритроцитов к холодовому шоку К.В. МАРКОВА1, В.А. БОНДАРЕНКО2 1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Relationship between Changes of Erythrocyte Shape under Effect of Cytoskeleton-Membrane Complex Modifiers and Chlorpromazine and Erythrocyte Sensitivity to Cold Shock K.V. MARKOVA1, V.A. BONDARENKO2 1 Kharkov National University, Kharkov, Ukraine 2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Изменение физико-химических и физиологических параметров клеток под влиянием различных веществ и условий окружающей среды всегда сопровождается из- менением их морфологических характеристик. Одновре- менно часто происходит повышение либо снижение чувствительности клеток к действию различных стрессо- вых факторов. В работе клетки, обработанные модификаторами цитоскелет-мембранного комплекса (парахлормерку- рийбензоат (ПХМБ), иодацетамид (ИАА), ПХМБ/ИАА, N-этилмалеимид (N-ЭМ)), подвергали действию хлор- промазина (ХПР) и холодового шока. Параллельно про- водили морфологические исследования методом световой микроскопии на микроскопе МБИ-15У с фотографической регистрацией формы клеток (увеличение ×200). Хлорпромазин снижал чувствительность эритроцитов к холодовому шоку даже при модификации цитоскелет- мембранного комплекса (обработка ПХМБ, ПХМБ/ИАА, ИАА, N-ЭМ). Однако антигемолитическая активность (АГА) ХПР зависима от вида обработки. При морфоло- гических исследованиях обнаружено, что в присутствии ХПР эритроциты представлены стоматоцитарными фор- мами. При обработке ПХМБ клетки приобретают форму сфероэхиноцитов. В образцах также заметны аканто- циты. Иодацетамид вызывает выраженный эхиноцитоз. При предварительной обработке N-ЭМ большинство эритроцитов имели форму стоматоцитов. При действии ХПР на клетки, модифицированные ПХМБ, форма эритроцитов не изменяется. Возможно, это обусловлено высокой степенью влияния этого моди- фикатора на АГА ХПР. Наибольшее угнетающее дейст- вие на АГА ХПР оказывает комбинированная обработка ПХМБ/ИАА. При такой модификации эритроциты при- обретают форму кодоцитов. При влиянии ХПР на клетки, обработанные таким образом, происходят изменение формы эритроцитов и образование тороцитов. При сов- местном действии на клетки ИАА и ХПР в образцах наб- людаются акантоциты и сфероциты. N-этилмалеимид, в отличие от всех модификаторов цитоскелет-мембран- ного комплекса, приводит к стоматоцитозу. Возможно, это связано с его наименьшим влиянием на АГА ХПР в условиях холодового шока. В образцах клеток, модифи- цированных N-ЭМ, наблюдаются также кодоциты, а при действии ХПР на такие клетки признаки кодоцитоза исче- зают. В образце обнаружены только стоматоцитарные формы эритроцитов. Вероятно, ХПР конкурентно пре- пятствует встраиванию N-ЭМ и тем самым его действию. Использованные в работе вещества оказывают раз- личное влияние на морфологические характеристики клеток, а также повышают чувствительность эритроцитов к стрессу и оказывают угнетающее влияние на АГА ХПР. Changes of physical-chemical and physiological para- meters of cells under the effect of different substances and environmental conditions are always followed by the alte- rations in their morphology. At the same time increase or decrease of cell sensitivity to the effect of different stress fac- tors often occurs. In this work the cells treated with cytoskeleton-memb- rane complex modifiers (parachloromercuribenzoate (PCMB), iodacetamide (IAA), PCMB/IAA, N-ethyl maleimide (N-ЕМ)) were exposed to the effect of chlorpromazine and cold shock. At the same time there were made morphological investi- gations using optical microscopy (microscope “MBI-15U”) with photo recording of cell shape (×200). Chlorpromazine decreased erythrocyte sensitivity to cold shock even if cytoskeleton-membrane complex modi- fiers were used (PCMB, PCMB/ IAA, IAA, N-ЕМ exposure). But chlorpromazine anti-hemolytic activity depended on the treatment type. Morphological studies showed that the erythrocytes were represented by stomatocytes in chlor- promazine presence. After PCMB treatment cells gain a sphere-echinocyte shape. Also some acanthocytes were observed in the samples. Iodacetamide caused a significant echinocytosis. In case of preliminary treatment by N-ЕМ most erythrocytes were stomatocytes. In case of chlorpromazine effect on PCMB-modified cells there were no shape changes in erythrocytes. It can be caused by a high level of effect of this modifier on chlorpro- mazine anti-hemolytic activity. The most inhibiting influence on chlorpromazine anti-hemolytic activity was observed in case of combined PCMB/IAA treatment. In such modifica- tion erythrocytes gain the form of codocytes. Chlorproma- zine effect on these cells is followed by erythrocyte shape changes and torocyte formation. In case of IAA and chlor- promazine combined effect the acanthocytes and sphero- cytes were observed in the samples. In contrast to other cytoskeleton-membrane complex modifiers N-ethyl maleimi- de led to stomatocyte formation. It can be caused by its low influence on chlorpromazine antihemolytic activity under cold shock conditions. In N-ЕМ-modified samples the codo- cytes were also present, but after chlorpromazine treatment the signs of codocytosis disappeared . In the sample we observed only stomatocyte shaped erythrocytes. Probably, chlorpromazine competitively prevents N-ЕМ integration and thereby prevents its action. The substances used in this work differently affected cell morphology, increased erythrocyte stress sensitivity and inhibited chlorpromazine anti-hemolytic activity. Сон и тиреоидные гормоны у крыс при холодовой акклимации Е.А. ВЕНЦКОВСКАЯ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Sleep and Thyroid Hormones in Rats during Cold Acclimation O.A. VENTSKOVSKA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 202ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Повышение устойчивости организма к холоду дости- гается за счет значительного напряжения функции ти- реоидной системы и связанного с этим увеличением общих расходов энергии. Общепринятым также счита- ется, что в процессе эволюции у млекопитающих выра- ботались специфические механизмы эффективного под- держания энергетического баланса и экономии энерго- трат, одним из которых является цикл бодрствование- сон. Изменения временных характеристик цикла бодрст- вование-сон и роль сна в снижении уровня энергети- ческих затрат организма при холодовой акклимации изучены недостаточно. Цель работы – изучить взаимосвязь между уровнем активации тиреоидной системы в процессе различных видов холодовой акклимации и сопутствующими изме- нениями цикла бодрствование-сон у крыс. Эксперименты одобрены комитетом по биоэтике при ИПКиК НАН Украины и проведены на 7–8-месяч- ных крысах-самцах линии Вистар (220–250 г). Для форми- рования долговременной акклимации (ДА) животных содержали в течение 30 дней в условиях с пониженной температурой окружающей среды (4°С). Для кратко- временной акклимации (КА) животных подвергали в течение 2-х дней в светлое время суток 2-м сериям из 9 охлаждений по 15 мин при температуре 10 или –12°С с интервалами по 45 мин при комнатной температуре 23°С. Концентрации тиреоидных гормонов (общего 3,5,3’– трийодтиронина (Т3) и общего тироксина (Т4)) в сыво- ротке крови определяли с помощью радиоиммуно- логического анализа. Длительную регистрацию био- электрической активности мозга и последующее опреде- ление начала и окончания стадий сна осуществляли по общепринятым критериям. Долговременная акклимация приводила к увеличе- нию длительности сна как медленноволнового (МВС) (с 54,8 ± 2,7 до 72,5 ± 4,6%), так и парадоксального (ПС) сна (с 7 ± 1,1 до 10,6 ± 0,6%) за счет уменьшения количества бодрствования (с 38,2 ± 3 до 16,9 ± 6%), происходящего на фоне значительного увеличения уровня Т4 в сыворот- ке крови (с 84,3 ± 7,3 до 157,1 ± 23,7 нмоль/л). При КА (–12°С) тиреоидная система активировалась менее выра- жено: концентрация Т4 возрастала с 84,3 ± 7,3 до 125,8 ± 9,8 нмоль/л, при этом достоверно увеличивалась дли- тельность только ПС (с 6,4 ± 2,6 до 10,8 ± 5,6%) за счет уменьшения количества бодрствования с 42,9 ± 8,9 до 28,4 ± 7,7%. После КА(10°С) увеличивалась длительность МВС (с 56,5 ± 4,9 до 84,5 ± 6,1%) в светлое время суток на фоне тенденции к увеличению активности тиреоидной системы. Содержание Т3 в ходе формирования КА и ДА достоверно не изменялось. Следовательно, по мере повышения нагрузки на тиреоидную систему в процессе холодовой акклимации увеличивается длительность сна, что подтверждает предположение о его роли в процессе поддержания энергетического баланса и экономии энерготрат при холодовой акклимации. The increasing of cold resistance of an organism is achieved through the significant increase in thyroid system activity and is associated with overall energy expenditure increase. Moreover, it is commonly believed that during mammal evolution the specific mechanisms for effective maintenance of energy balance and energy expenditure savings were formed, and one of these mechanisms is sleep- wake cycle. Changes of sleep-wake cycle temporal chara- cteristics and the role of sleep in the reducing of energy consumption during cold acclimation have been studied insufficiently. Thus, the aim of the work was the study of interrelation between level of thyroid system activation during different types of cold acclimation and related sleep-wake cycle chan- ges in rats. The experiments were performed in 7–8-month-old Wistar rats (220–250 g body weight) and were approved by the Committee of Bioethics at IPC&C of the NAS of Ukraine. Long-term acclimation (LTA) was achieved by keeping rats at 4°C for 30 days with food and water ad libitum. For short-term acclimation (STA) the animals were exposed to the temperature of –12 or 10°C for 15 min every hour during the day, for a total nine exposures. This procedure was re- peated next day. Concentrations of thyroid hormones (total serum 3,5,3’- triiodothyronine (T3) and total thyroxine (T4)) were determined by radioimmunoassay. Long-term records of brain bioelectrical activity were manually stage scored as REM sleep, slow-wave sleep (SWS) or wakefulness in 4-s epochs. Long-term acclimation led to the sleep duration increase, both slow wave sleep (SWS) (from 54.8 ± 2.7 to 72.5 ± 4.6%) and REM sleep (from 7 ± 1.1 to 10.6 ± 0.6%) on account of reducing of the wakefulness amount (from 38.2 ± 3 to 16.9 ± 6%). These changes were observed on the background of significant increase of serum T4 (from 84.3 ± 7.3 to 157.1 ± 23.7 nmol/l). The lower level of thyroid system activation was observed during STA(–12°C): T4 concentration increased from 84.3 ± 7.3 to 125.8 ± 9.8 nmol/l, and only REM sleep amount was significantly increased (from 6.4 ± 2.6 to 10.8 ± 5.6%) on the background of wakefulness amount decrease from 42.9 ± 8.9 to 28.4 ± 7.7%. After STA (10°C) the SWS amount increased in the light period of the day (from 56.5 ± 4.9 tо 84.5 ± 6.1%) on the background of tendency in thyroid system activity increase. No changes were observed in serum T3 concentration during forming of STA either LTA. Thus the results show that the higher thyroid system loading is accompanied by higher sleep duration, that confirms the hypothesis about its role in the maintenance of energy balance and energy expenditure saving during cold acclimation. Проникающая способность и криозащитная эффективность ряда криопротекторов Н.А. ЧЕРНОБАЙ, Т.М. ГУРИНА, А.В. ПАХОМОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Permeability and Cryoprotective Efficiency of Several Cryoprotectants N.A. CHERNOBAI, T.M. GURINA, A.V. PAKHOMOV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 203ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 С использованием метода волюмометрии и моди- фицированной физико-математической модели Кедем- Качальского [Гордиенко Е.А., 1994] определены коэффи- циенты проницаемости плазматических мембран клеток интерстиция тестисов (КИТ) и надпочечников для мо- лекул глицерина, ДМСО, ЭГ и ДМФА при температурах 35, 20 и 5°С. Рассчитаны значения энергий активации (ЕА) процессов переноса веществ через мембраны КИТ и клеток надпочечников для молекул изученных крио- протекторов. Показано, что при 5°С проницаемость плазмати- ческих мембран клеток надпочечников для глицерина, ДМСО и ЭГ достоверно не отличается (К1 изменяется от 0,45×10-7 до 0,49×107м/с). При 35°С наибольшей про- ницаемостью в ряду этих криопротекторов через мемб- раны клеток надпочечников характеризуется ЭГ (К1= 24,37×10-7м/с), наименьшей – глицерин (К1=2,52×10-7м/с). Значение коэффициента проницаемости мембран клеток надпочечников для молекул ДМФА при 5°С сос- тавляет 233,0×10-7м/с, при более высокой температуре его проницаемость сравнима с проницаемостью моле- кул воды. Значения коэффициентов проницаемости мембран клеток интерстиция тестисов для глицерина, ДМСО и ЭГ в интервале температур от 35 до 5°С отличаются незначи- тельно и лежат в диапазонах 0,38÷1,05×10-7, 1,99÷2,67×10-7 и 6,75÷9,32×10-7м/с при 5, 20 и 35°С соответственно. Исключение составляет ДМФА, значение коэффициента проницаемости которого при 20°С составляет 24,45×10-7 м/с, при 5°С – 4,41×10-7 м/с. Установлено, что наименьшим значением энергии активации процессов переноса веществ через мембра- ны клеток надпочечников характеризуется глицерин (ЕА = 40,80 кДж/моль), наибольшим – ЭГ (ЕА = 93,74 кДж/моль); через мембраны клеток интерстиция тестисов наимень- шим значением энергии активации обладает глицерин (ЕА= 46,92 кДж/моль), наибольшим – ДМФА (ЕА = 62,99 кДж/моль). Оценена сохранность КИТ после криоконсервиро- вания с растворами глицерина (7%), ДМСО (10%), ЭГ (7%) и ДМФА (5%) с использованием скоростей охлажде- ния 1, 5 и 10 град./мин до –40°С с последующим погру- жением образцов в жидкий азот. Применение глицерина в качестве криопротектора обеспечило 75%-ю сохран- ность клеток при всех указанных режимах заморажива- ния. При использовании других криопротекторов со- хранность клеток повышалась (с 56 до 83%) при увеличе- нии скорости охлаждения от 1 до 10 град./мин. Более низкую сохранность КИТ в присутствии ДМФА при низ- ких скоростях можно объяснить поступлением криопро- тектора в клетки в процессе замораживания, обуслов- ленным его высокой проникающей способностью. Using the method of volumometry and the modified physical-mathematical model of Kedem-Katchalsky [Gor- diyenko E.A., 1994] the permeability coefficients for testes interstitium and adrenal cortex cell plasmatic membranes for glycerol, Me2SO, EG, and Me2FA at 35, 20 and 5°C were determined. The values of activation energy (ЕА) of the processes of substance transfer through testes and adrenal cortex cell membranes for molecules of the investigated cryoprotectants were calculated. It was noted that at 5°C the permeability of adrenal cortex cell membranes for glycerol, Me2SO and EG did not signifi- cantly differ (К1 varied from 0.45×10-7 to 0.49×10-7m/s). The highest permeability at 35°C for these cryoprotectants through adrenal cortex cell membranes was characteristic for EG (К1 = 24.37×10-7 m/s), the lowest one was for glycerol (К1 = 2.52×10-7 m/s). The permeability coefficient of adrenal cortex cell membranes for Me2FA molecules at 5°C was 233.0×10-7 m/s, at higher temperature its permeability was comparable with the one for water molecules. The permeability coefficients of testes interstitium cell membranes for molecules of glycerol, Me2SO and EG within the temperature range from 35 down to 5°C differed slightly and were within 0.38÷1.05×10-7, 1.99÷2.67×10-7 and 6.75÷9.32×10 7m/s at 5, 20 and 35°С, respectively. Me2FA was an exception, its permeability coefficient at 20°С was 24.45×10-7m/s, and at 5°С was 4.41×10-7m/s. The obtained results showed that the lowest value of activation energy of the processes of substance transfer through the adrenal cortex cell membranes was characteristic for glycerol (ЕА = 40.80 kJ/mol), the highest for EG (ЕА = 93.74 kJ/mol); through the testes interstitium cell membranes the lowest value of activation energy was characteristic for glycerol (ЕА = 46.92 kJ/mol), the highest for Me2FA (ЕА = 62.99 kJ/mol). The survival of testes interstitium cells after cryopre- servation with glycerol (7%), Me2SO (10%), EG (7%) and Me2FA (5%) solutions using the cooling rates of 1, 5 and 10 deg/min down to –40°С with the following plunging into a liquid nitrogen has been estimated. Application of glycerol as a cryoprotectant provided 75% cell survival in all studied freezing conditions. Cell survival increased (from 56 up to 83%) with a rise in cooling rate from 1 up to 10 deg/min when using other cryoprotectants. Lower testes cell survival in the case of Me2FA and low cooling rates could be caused by an extra flux of cryoprotectant into cells during freezing due to extremely higher permeability of Me2FA. Влияние криопротекторов ДМСО, 1,2-пропандиола и криовоздействия на чувствительность митохондриального потенциала одиночных гепатоцитов к регуляции фенилэфрином при оценке флуоресцентным методом М.Ю. МАЛЮКИНА, Н.С. КАВОК, И.А. БОРОВОЙ Институт сцинтилляционных материалов НАН Украины, г. Харьков Influence of DMSO, 1,2-Propanediol Cryoprotectants and Cryoexposure on Sensitivity of Single Hepatocyte Mitochondrial Potential to Regulation with Phenylephrine Assessed by Fluorescent Method M.YU. MALYUKINA, N.S. KAVOK, I.A. BOROVOY Institute for Scintillation Materials of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 204ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Методом микрофлуориметрии одиночных клеток по интенсивности флуоресценции агрегатов зонда JС-1 оценивали агонист-индуцированные изменения транс- мембранного потенциала митохондрий гепатоцитов крыс до и после криовоздействия. Криоконсервацию клеток осуществляли методом ступенчатого замораживания в жидком азоте в присутствии 10% ДМСО или 10% 1,2-про- пандиола. Было показано, что низкомолекулярные криопротекторы в данных концентрациях не оказывают влияния на митохондриальный потенциал при кратковре- менной инкубации с клетками (1 ч) с последующей их отмывкой. Однако после криовоздействия отмечалось снижение потенциала митохондрий гепатоцитов (80 ± 6% от контроля) при использовании ДМСО в качестве криопротектора, в клетках, криоконсервированных с 1,2- пропандиолом, агрегаты красителя не обнаруживались. Согласно данным литературы и результатам собст- венных исследований воздействие криозащитных ве- ществ в более низких концентрациях (менее 10%) может приводить к изменениям в механизмах регуляции транс- мембранных потенциалов клетки. В настоящем исследо- вании было установлено, что кратковременная инкуба- ция изолированных гепатоцитов в присутствии 2 и 8% ДМСО с последующим отмыванием криопротектора не влияет на митохондриальный потенциал. Однако, в отли- чие от контроля, быстрый (к 15 мин эксперимента) сти- мулирующий эффект фенилэфрина (10−5 М) на образо- вание j-агрегатов (гормон-индуцируемое повышение интенсивности флуоресценции агрегатов на 30%) в мито- хондриях гепатоцитов на фоне воздействия криопро- тектора не обнаруживался. Тест на чувствительность по- тенциала к регуляции фенилэфрином был также исполь- зован для оценки восстановления митохондриальной функции в гепатоцитах после криовоздействия. Ответ на краткосрочное гормональное воздействие также не ре- гистрировался. Полученные данные указывают, что, по- видимому, после воздействия криопротектора и крио- консервации для полного восстановления клеточных функций и чувствительности к регуляторным воздейст- виям необходим определенный лаг-период. Agonist-induced changes of rat hepatocyte trans- membrane mitochondrial potential prior to and after the cryo- exposure were evaluated by fluorescence intensiveness of JC-1 probe aggregates obtained with single cell microfluo- rimetry method. The cells were cryopreserved by stepwise freezing in liquid nitrogen with either 10% DMSO or 10% 1,2-propane diol. It was shown that low-molecular cryo- protectants in these concentrations did not affect the mitochondrial potential after short-term incubation with cells (1 hour) and their following washing. However, after cryoexposure we observed the decrease of hepatocyte mitochondrial potential (80 ± 6% of the control) if using DMSO as cryoprotectant, and in the cells cryopreserved with 1,2-propane diol no dye aggregates were found. According to the literature data and the results of our own investigations the effect of cryoprotective substances in lower concentrations (below 10%) may lead to the chan- ges in regulation mechanisms of transmembrane cell poten- tials. This investigation allowed to establish that a short- term incubation of isolated hepatocytes with 2 and 8% DMSO with the following removing of cryoprotectant did not affect the mitochondrial potential. However, in contrast to the control, a rapid (to the 15th minute of experiment) stimulating effect of phenylephrine (10-5 M) on the formation of j-aggregates (hormone-induced increase of aggregate fluorescence intensiveness by 30%) in hepatocyte mito- chondria on the background of cryoprotectant exposure was not found. Test for sensitivity of potential to the regulation by phenylephrine was also used for assessment of mitochondrial function restoration in hepatocytes after cryoexposure. The response to a short-term hormonal effect was not observed too. The obtained data point that the occurrence of certain lag period after influence of cryopro- tectant and cryopreservation is obviously necessary for a complete restoration of cell functions and their sensitivity to the regulatory effects. Корреляционный анализ показателей сохранности эритроцитов до и после замораживания в криозащитных средах различного состава на основе оксиэтилированного метилцеллозольва О.В. ВЯЗОВСКАЯ, А.В. НИКОЛЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Correlation Analysis of Erythrocyte Survival Parameters Prior to and After Freezing in Cryoprotective Media of Different Composition Based on Oxyethylated Methyl Cellosolve O.V. VYAZOVSKA, A.V. NIKOLENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 205ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Для изучения сохранности эритроцитов при исполь- зовании криозащитных сред разного состава важна комп- лексная оценка функционального состояния эритро- цитов, характеризующая их устойчивость к заморажи- ванию. Исследовали содержание ионов К+ и Nа+ в эритро- цитах, их корреляционную связь с показателями гемато- крита и осмотической хрупкости в зависимости от состава криозащитных сред на основе оксиэтилированного метилцеллозольва (ОЭМЦ). Использовали среды: 20 и 30% ОЭМЦ, приготовлен- ные на 50 мM и 150 мM растворах NaCl, 20% ОЭМЦ − на 100 мM NaCl с добавлением 3% сахарозы, 20% ОЭМЦ − на 50 мM NaCl с 5% глюкозой, 20% ОЭМЦ − на 50 мM NaCl с 5% маннитом. Эритроциты с криозащитными сре- дами замораживали путем погружения в жидкий азот. Исследуемые образцы отогревали на водяной бане при температуре 40−42°С. Содержание внутриклеточного ка- лия и натрия измеряли в эритроцитах до и после замора- живания на пламенном фотометре ПАЖ-1. Гематокрит определяли в капиллярах с использованием микроцентри- фуги МГЦ-8. Осмотическую хрупкость измеряли спектро- фотометрическим методом при длине волны 540 нм и рассчитывали относительно 100%-го гемолиза. Криозащитные среды на основе непроникающего криопротектора ОЭМЦ на этапе экспозиции вызывали разную степень дегидратации клеток, что отражалось на показателях гематокрита и сохранности криоконсер- вированных эритроцитов. Установлена положительная корреляция гематокрита с сохранностью внутрикле- точного калия (k = 0,82, p < 0,03) и отрицательная – со значениями осмотической хрупкости эритроцитов после замораживания (k = −0,88, p < 0,01), т. е. чем ниже пока- затели гематокрита после экспозиции эритроцитов с криозащитными средами, тем выше их осмотическая хрупкость и, как следствие повреждения клеточных мембран, − большая потеря клетками калия. Осмотическая хрупкость после замораживания отрицательно коррели- ровала с содержанием внутриклеточного калия (k = −0,94, p = 0,001) и положительно – с содержанием внутрикле- точного натрия (k = 0,9, p < 0,006). Анализ полученных результатов показал, что сохран- ность эритроцитов определялась составом криозащит- ных сред: содержанием электролита (NaCl) и неэлектро- литов (криопротектора и углеводов). Снижение в криоза- щитных средах на основе ОЭМЦ концентрации криопро- тектора с 30 до 20%, содержания соли (NaCl) с 150 до 50 мМ и добавление углеводов (сахарозы, маннита, глюкозы) способствовали повышению сохранности эритроцитов после замораживания-отогрева по всем исследуемым показателям. To study the erythrocyte survival after application of cryoprotective media with different composition the inte- grated assessment of functional state, characterising eryth- rocyte resistance to freezing is important. The content of K+ and Na+ in erythrocytes was studied as well as their correlation with hematocrit and osmotic fragility depending on the cryoprotective medium composi- tions based on oxyethylated methyl cellosolve (OEMC). The following media were used: 20% and 30% OEMC prepared with 50 mM and 150 mM NaCl solutions, 20% OEMC in 100 mM NaCl solution supplemented with 3% sucrose, 20% OEMC in 50 mM NaCl with 5% glucose, 20% OEMC in 50 mM NaCl with 5% mannitol. Erythrocytes were frozen in the cryoprotective media by plunging into liquid nitrogen. The experimental samples were thawed in water bath at 40– 42°C. The intracellular potassium and sodium content was measured in erythrocytes prior to and after freezing using a flame photometer PAG-1. Hematocrit was examined in capil- laries using a microcentrifuge GCM-8. Osmotic fragility was determined by a spectrophotometric method at 540 nm and calculated vs. 100% hemolysis. The cryoprotective media based on the non-penetrating cryoprotectant OEMC during exposure caused different rate of cell dehydration, which affected hematocrit and indices of erythrocyte survival. There were found the positive correlation of hematocrit with the intracellular potassium content (k = 0.82, p < 0.03) and negative correlation with the post-thaw erythrocyte osmotic fragility values (k = –0.88, p < 0.01); i. e. the lower was hematocrit of erythrocytes after exposure with cryoprotective media, the higher was their osmotic fragility, and, as a consequence of cell membranes damage, the higher loss of cell potassium. Osmotic fragility after freezing negatively correlated with intracellular potas- sium content (k = –0.94; p = 0.001) and positively correlated with intracellular sodium content (k = 0.9, p < 0.006). Analysis of the obtained results showed that erythrocyte survival was determined by the cryoprotective media composition: content of electrolyte (NaCl) and non-electro- lytes (cryoprotectant and carbohydrates). Decrease of the cryoprotectant concentration from 30% to 20% in the cryo- protective media composition based on OEMC, reduction of NaCl content from 150 mM to 50 mM and addition of car- bohydrates (sucrose, mannitol, glucose) improved erythro- cyte survival after freeze-thawing by all the studied parame- ters. Определение удельной электрической проводимости ооцитов мыши в растворах сахарозы и проникающих криопротекторов методом импульсной кондуктометрии О.А. СТРИХА, Е.И. СМОЛЬЯНИНОВА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Determination of Mouse Oocyte Specific Electric Conductivity in Solutions of Sucrose and Permeative Cryoprotectants Using Electroporation Method О.A. STRIKHA, Е.I. SMOLYANINOVA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 206ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 19, 2009, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, №2 Оптимизация программ криоконсервирования ооци- тов млекопитающих тесно связана с поиском эффектив- ных криопротекторов и уменьшения их токсичного влия- ния на клетки. Эффективность криопротекторов, как правило, определяется после цикла низкотемпературного криоконсервирования по оценке сохранности морфоло- гии гамет и их способности к дальнейшему развитию. Широкое применение в криобиологической практике получили исследование осмотического поведения кле- ток и определение биофизических параметров их плаз- матических мембран в условиях, моделирующих различ- ные криобиологические ситуации. Однако такие иссле- дования не отвечают на вопрос: почему вещества, обла- дающие сходной проникающей способностью, оказы- вают различное по эффективности криозащитное дейст- вие? Наряду с осмотическим фактором свой вклад в ток- сичность вносит непосредственное химическое воз- действие криопротектора на клеточные и, прежде всего, мембранные структуры. Попытка разделить эти два фак- тора требует использования дополнительных методи- ческих подходов и расширения спектра изучаемых кле- точных параметров. Цель работы – изучение влияния криопротекторов, принадлежащих к различным классам химических ве- ществ, на электрическую проводимость ооцитов мыши. Ооциты мыши на стадии МII мейоза получали стан- дартным методом. Методом импульсной кондуктомет- рии (электропорации) определяли зависимость элект- рической проводимости отдельных ооцитов в процессе их экспозиции в изотоническом растворе сахарозы (0,3 М) и 1,0 М растворах этиленгликоля (ЭГ), ацетамида (АЦ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), диметилсульфоксида (ДМСО) от напряженности приложенного электрического поля. Растворы криопротекторов готовили на растворе сахаро- зы с конечной концентрацией 0,3 М. Показано, что исследуемые растворы криопротек- торов оказывают различное влияние на устойчивость ооцитов мыши к действию электрического импульса. В растворах АЦ и сахарозы электрическая проводимость ооцитов мыши характеризуется относительно неболь- шими значениями и незначительной скоростью роста ее зависимости от напряженности поля вплоть до необра- тимого электрического пробоя, который наблюдали при напряженности поля около 3 кВ/см. В растворах ЭГ, ДМСО и 1,2-ПД необратимого электрического пробоя ооцитов не наблюдали, что свидетельствует о стабили- зирующем действии этих криопротекторов на плазмати- ческие мембраны ооцитов. Таким образом, импульсная кондуктометрия является перспективным эксперимен- тальным методом изучения влияния физико-химических факторов криоповреждения на сохранность клеток. Optimization of mammalian oocyte cryopreservation protocols is tightly connected with searching of effective cryoprotectants and decreasing their toxic influence on cells. As a rule, the cryoprotectant efficiency is assessed after the low-temperature preservation cycle by estimation of gametes’ morphology and their ability to further develop- ment. The investigations of cell osmotic behavior and the determination of their plasma membrane biophysical parameters under the conditions that simulate several cryo- biological situations are widely used in cryobiological prac- tice. However, such investigations do not answer the ques- tion: why substances of similar permeability possess diffe- rent efficiency of cryoprotective action? The direct chemical influence on cell membranes and cytoplasmic structures as well as osmotic factor contributes to cryoprotectant toxicity. The attempt of separating these two factors demands addi- tional methodical approaches and widening the spectrum of the studied cell parameters. The aim of this investigation was to study the effect of permeative cryoprotectants which belong to different classes of chemical substances on specific electric conductivity of mouse oocytes. Mouse MII oocytes were derived by a standard method. Using the techniques of electroporation the dependences of specific electric conductivities of mouse oocytes during their exposure in isotonic sucrose solution (0.3 M) and 1.0 М ethylene glycol (EG), acetamide (AA), 1,2-propanediol (1,2- PD), dimethyl sulfoxide (DMSO) solutions vs. the applied electric field intensity have been studied. The cryoprotec- tant solutions were prepared on the base of sucrose solution with final concentration of 0.3 М. It was shown that the investigated cryoprotectant solutions differently affected mouse oocytes stability to the action of electric impulse. In AA and sucrose solutions the specific electric conductivity of mouse oocytes was characterized by relatively small values and insignificant growth rate of its dependence on the external electric field intensity until irreversible electric breakdown occurence, which was observed at 3 kV/cm intensity. The irreversible electric breakdown of mouse oocytes in EG, DMSO and 1,2-PD solutions was not observed, that testified to stabili- zing effect of these cryoprotectants on oocyte plasma membranes. Thus, the method of impulse conductometry is a perspective experimental approach to study the influence of physical-chemical factors of cryoinjury on the cell survival. Криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток человека с использованием сахарозы В.В. МУЦЕНКО1, Ю.А. ПЕТРЕНКО2 1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Cryopreservation of Human Mesenchymal Stromal Cells Using Sucrose V.V. MUTSENKO1, YU.А. PETRENKO2 1V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov 2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 207ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 For the cryopreservation of mesenchymal stromal cells (MSC) the cryoprotective solutions, containing 10% Me2SO and xenogeneic fetal serum are usually applied. To remove these components before infusion the additional technolo- gical step, which often leads to significant cell loss is needed. Sucrose is often used for cells cryopreservation as a non- permeant, osmotically active component. In this study some approaches of sucrose application for the reduction of Me2SO concentration during MSC cryopreservation were inves- tigated. MSC, used in this study were obtained after a written donor’s informed consent with further culturing during 4–7 passages. Sucrose, in concentrations 0.1; 0.15 and 0.2 M was used for the pre-treatment of cells prior to cryopreser- vation and as an additive into the cryoprotective solution. Pre-treatment was performed by one day culturing of cells with indicated sucrose concentrations. MSCs were cryopre- served using the cooling rate 1°C/min down to –80°C, and following plunging into liquid nitrogen. Cell survival was determined by trypan blue staining. Metabolic activity of cells was assessed by MTT and Alamar Blue (AB) redox indicators. Cryopreservation of MSC in culture medium without Me2SO, sucrose and serum resulted in the death of more than 90% cells. Pre-treatment of cells with sucrose or its addition into the freezing medium did not visibly affect the viability of cells. At the same time, the significant amount (about 50%) of pre-treated cells, cryopreserved in the pre- sence of sucrose preserved their survival and metabolic activity, assessed by MTT and AB-tests after thawing. Du- ring monolayer culture, cryopreserved cells were able to attach and proliferate. Additional inclusion of just 1% of Me2SO into sucrose-containing cryoprotective medium after cells pre-treatment resulted in the increase of survival, me- tabolic and proliferative activity of cells up to 65% that is similar to the data, obtained after cryopreservation of MSC with 10% Me2SO in the serum presence. Further investi- gation of the mechanism of the sucrose cryoprotective effect could serve as a basis for the development of the effective cryopreservation methods, which exclude the application of toxic concentrations of cryoprotectants and xenogeneic serum. Для криоконсервирования мезенхимальных стро- мальных клеток (МСК) обычно используются криоза- щитные среды, включающие 10% ДМСО и эмбрио- нальную сыворотку ксеногенного происхождения, кото- рые приходится удалять перед введением, что вносит дополнительный технологический этап, часто приводя- щий к значительной потере клеток. Сахароза часто исполь- зуется при криоконсервировании клеток в качестве непро- никающего нетоксичного осмотически активного ком- понента. В данной работе исследовали некоторые подхо- ды использования сахарозы для снижения концентрации ДМСО при криоконсервировании МСК человека. В работе использовали МСК, полученные с письмен- ного согласия информированных доноров, культивиро- ванные в течение 4–7 пассажей. Сахарозу в концентра- циях 0,1; 0,15 и 0,2 М использовали для предобработки клеток до криоконсервирования, а также в качестве до- бавки в криозащитную среду. Предобработку проводили путем культивирования клеток в течение суток с указан- ными концентрациями сахарозы. Криоконсервирование МСК осуществляли со скоростью 1°С/мин до –80°С, пос- ле чего образцы погружали в жидкий азот. Сохранность клеток определяли путем окрашивания трипановым синим. Метаболическую активность оценивали с исполь- зованием редокс-индикаторов МТТ и Alamar Blue (AB). Криоконсервирование МСК в культуральной среде при отсутствии ДМСО, сахарозы и сыворотки приводило к гибели более 90% клеток. Предобработка клеток саха- розой или ее добавление в эту среду замораживания практически не влияли на жизнеспособность клеток. Вместе с тем значительное количество (около 50%) пред- обработанных клеток, криоконсервированных в присутст- вии сахарозы, после отогрева сохраняли жизнеспособность и метаболическую активность, оцененную по МТТ- и АВ-тестам. В условиях монослойного культивирования криоконсервированные клетки были способны к адгезии и пролиферации. Дополнительное введение всего 1% ДМСО в сахарозосодержащую криозащитную среду после предварительной обработки клеток приводило к повышению жизнеспособности, метаболической и про- лиферативной активности клеток до 65%, что сопостави- мо с результатами, полученными при криоконсерви- ровании МСК под защитой 10% ДМСО в присутствии сыворотки. Дальнейшее изучение механизма криозащит- ного действия сахарозы может послужить основой для разработки эффективных методов криоконсервирования, исключающих использование токсичных концентраций криопротекторов и ксеногенной сыворотки. Структурно-функциональное состояние ядросодержащих клеток кордовой крови в процессе криоконсервирования О.А. МИХАЙЛОВА, П.М. ЗУБОВ, В.В. РЯЗАНЦЕВ, Л.А. БАБИЙчуК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Structural and Functional State of Cord Blood Nucleated Cells During Cryopreservation O.A. MYKHAILOVA, P.M. ZUBOV, V.V. RYAZANTSEV, L.A. BABIYCHUK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 208ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 В последнее время при лечении многих заболеваний используют криоконсервированную суспензию ядро- содержащих клеток (ЯСК) кордовой крови (КК) в качестве препарата, содержащего гемопоэтические стволовые клетки (ГСК). Эффективность их применения во многом определяется сохранением структурно-функциональ- ной полноценности ЯСК после размораживания. В связи с этим целью данной работы было исследование сохран- ности и жизнеспособности ЯСК КК, состояния их анти- оксидантной системы (АОС), а также изменений липид- ной асимметрии мембран клеток на всех этапах криокон- сервирования по разработанному нами методу. Выделение фракции ЯСК из цельной КК человека производили с использованием декстрана (м.м. 60000). Замораживали клетки под защитой 5% ДМСО по разработанной нами программе. Фенотипирование ЯСК (CD45+) КК проводилось на проточном цитофлуоримет- ре FACS Calibur с использованием реагентов BD. Жизне- способность (7AAD), нарушение липидной асимметрии мембран (AnnexinV) и продукцию активных форм кислорода (АФК) (DCFH2-DA) ЯСК оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Было показано, что при выделении и обработке ЯСК ДМСО сохранность и жизнеспособность клеток снижались. Анализ измене- ний липидной асимметрии мембран с помощью Anne- xinV (маркера начальной стадии апоптоза) не показал увеличение количества AnnexinV+-клеток по сравнению с цельной КК. Интенсивность флуоресценции DCF (IDCF) ЯСК после процедуры выделения существенно не отли- чалась от показателей в цельной КК, а обработка клеток ДМСО приводила к повышению уровня внутрикле- точных АФК, о чем свидетельствует прирост IDCF. Добав- ление экзогенной Н2О2 как к выделенным, так и к обрабо- танным ДМСО ЯСК не влияло на временную динамику IDCF по сравнению с клетками цельной КК, что свидетель- ствует о сохранении АОС клеток в состоянии, сходном с нативным в цельной КК. Дальнейшая процедура замораживания-отогрева позволяла получить до 80% ЯСК с сохранением высоко- го уровня их жизнеспособности (81,3±2,5% CD45+7AAD−). При этом количество AnnexinV+-клеток составляло 7,35± 1,25%, что свидетельствует о сохранении структурной полноценности ЯСК. IDCF после криоконсервирования ЯСК существенно не изменялась, однако при добавлении экзогенной Н2О2 временная динамика IDCF отличалась от показателей до замораживания, но с течением времени данные различия нивелировались, что говорит об отсут- ствии существенных изменений в работе АОС клеток после размораживания. Таким образом, полученные результаты свидетельст- вуют о том, что криоконсервирование ЯСК КК по раз- работанному нами методу позволяет сохранять струк- турно-функциональную полноценность и жизнеспособ- ность клеток на достаточно высоком уровне. Nowadays the treatment of many diseases is performed with cryopreserved suspension of cord blood (CB) nuclea- ted cells (NC), as a preparation containing hematopoietic stem cells (HSC). Efficiency of their application is mainly determined by the preservation of structural and functional integrity of NC after thawing. In this context, the research aim was to investigate the integrity and viability of CB NC, the state of their antioxidant system (AOS), as well as the changes of lipid asymmetry in cell membranes at all the stages of cryopreservation method developed by us. NC fraction was isolated from the whole cord blood using dextran (m.m. 60,000). Cells were frozen under protec- tion of 5% DMSO by designed by us program. Phenotyping of CB NC (CD45+) was carried out by means of flow cytome- ter FACS Calibur using BD reagents. The viability (7AAD), disorder of lipid membrane asymmetry (AnnexinV) and production of reactive oxygen species (ROS) (DCFH2-DA) of the NC was evaluated by the method of flow cytometry. It was shown that during NC isolation and their treatment by DMSO the survival and viability decreased. The analysis of membrane lipid asymmetry changes with AnnexinV (the marker of initial apoptosis stage) did not show the increase of AnnexinV+ cells comparing with the data of untreated whole cord blood. The DCF fluorescence intensity (IDCF) in NC after isolation did not differ significantly from the indices of the whole CB, and the treatment of cells with DMSO led to the rise of intracellular ROS level, testified by the increased IDCF. The addition of exogenous H2O2 to the isolated as well as to the treated by DMSO cells did not affect the temporal dynamics of IDCF comparing with the cells of the untreated whole CB testifying to the preservation of AOS in the state similar with native one in the whole CB. Further freeze-thawing allowed to obtain up to 80% of NC with a high viability level (81.3 ± 2.5% CD45+7AAD–). Moreover, the number of AnnexinV+ cells was 7.35 ± 1.25%, that testified to the preservation of structural integrity of NC. IDCF after NC cryopreservation was not changed signi- ficantly, however, after the addition of exogenous H2O2 the temporal dynamics of IDCF differed from the indices before the freezing but in due time these differences were neutra- lized that may testify to the absence of significant changes in the function of AOS cells after thawing. Thus, the obtained results testify to the fact that cryo- preservation of CB NC according the method developed by allows to preserve structural-functional integrity and viability of cells at quite a high level. Влияние фракций экстрактов плаценты человека на фазовые переходы в клеточных суспензиях эритроцитов и Saccharomyces cerevisiae Ю.С. ГОВОРОВА, А.В. ЗИНчЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Human Placental Extracts’ Fractions on Phase Transitions in Cell Suspensions of Erythrocytes and Saccharomyces cerevisiae YU.S. GOVOROVA, A.V. ZINCHENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 209ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Водно-солевые экстракты плаценты содержат прак- тически весь спектр биологически активных веществ, поэтому экстракты находят широкое применение в меди- цине. Вместе с тем, благодаря взаимодействию белков экстрактов с клетками, экстракты могут быть использо- ваны в качестве добавок в многокомпонентных защитных средах при низкотемпературном консервировании. Изу- чение влияния отдельных фракций, входящих в состав экстрактов, на различные биосистемы в процессе терми- ческого воздействия является актуальным, так как низко- температурное консервирование сопровождается рядом физических процессов, способных вызывать определен- ные повреждения биосистем. В настоящей работе прове- дено исследование фазовых переходов во фракциях экстрактов с молекулярной массой белков до 5, 50−70 и 750 кДа, в клеточных суспензиях эритроцитов, Saccharo- myces cerevisiae и в суспензиях клеток в присутствии фракций экстрактов. Эксперименты выполнены на диф- ференциальном сканирующем калориметре, разрабо- танном и изготовленном в Институте проблем криобио- логии и криомедицины НАН Украины. Образцы охлаж- дали погружением в жидкий азот вне калориметричес- кого блока. Скорость охлаждения образцов составляла 3,3(3)°С/с, затем их помещали в предварительно охлаж- денный до −130°С калориметрический блок. Термограм- мы регистрировали при нагреве по линейному закону со скоростью 8,3(3)×10−3°С/с в температурном диапазоне − 130…0°С. На термограмме ДСК для фракций с молекулярной массой белков до 5 кДа из свежеполученного экстракта плаценты зарегистрирован ряд термических эффектов: 1 − узкий экзотермический пик при температуре −85,5°С отображает, вероятнее всего, инверсию молекул, име- ющих углерод-углеродные связи (для данного эффекта в литературе употребляется термин “обращение конфи- гурации”, связанный с процессом изомеризации); 2 − уз- кий интенсивный эндотермический пик соответствует плавлению эвтектических составов при −21°С, представ- ляющих собой механическую смесь кристаллов NaCl и воды; 3 − плавление всей системы. Замораживание экстрактов и хранение их при −20°С не приводят к значительным изменениям интенсивности инверсии на термограммах. Плавление эвтектики и плав- ление системы остаются неизменными. Смешение в соот- ношении 1:1 суспензий как эритроцитов, так и Saccharo- myces cerevisiae со свежеприготовленными, а также фрак- циями экстракта, предварительно хранившегося при −20°С в течение 2,5 месяцев, приводит к значительному сни- жению интенсивности пика инверсии и пика плавления эвтектики. В смесях, возможно, происходит связывание определенной части молекул воды с органическими ком- понентами фракций экстрактов, и в образовании эвтек- тических составов вода уже не принимает участия. Aqeous-saline placental extracts contain almost all the spectrum of biologically active substances, that is why the extracts are widely used in medicine. Moreover, due to the interaction of extract proteins and cells, they can be used as additives in multicomponent protective media during low- temperature preservation. The studies of the effect of separate fractions of the extracts on various biological sys- tems under thermal exposure are relevant, since freeze- thawing is accompanied by a number of physical processes that can cause a certain damage of biosystems. This study deals with the phase transitions in fractions of extracts with a molecular mass of proteins up to 5 kDa, 50–70 kDa and 750 kDa, in suspensions of red blood cells, Saccharomyces cerevisiae, and in the mixtures of cell suspensions and fractions of extracts. The experiments were performed with a differential scanning calorimeter, designed and manufactured at the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine. The samples were cooled by immersion in liquid nitrogen outside the calorimetric block. The cooling rate of the samples was 3.3(3)°C/s, and then they were placed into the calorimetric block pre-cooled down to –130°C. The thermograms were recorded under linear heating with the rate of 8.3(3)×10-3 °C/s within the temperature range –130...0°C. DSC thermograms of the fractions with a molecular mass of proteins up to 5 kDa from fresh placental extract comprised following thermal transitions: 1– narrow exothermic peak at –85.5°C, that is likely associated with the inversion of mole- cules possessing carbon-carbon bonds (this effect is des- cribed usually with the term ‘configuration conversion’, that is associated with the process of isomerization); 2 – narrow intensive endothermic peak, that corresponds to the melting of the eutectic composition at –21°C, represent- ing a mechanical mixture of NaCl crystals and water, and 3 – melting of the whole system. Freezing and storage of extracts at –20°C did not lead to the significant changes in the intensity of inversion in the thermograms. Eutectic melting and melting of the system remain unchanged. The 1:1 mixture, both of erythrocytes and Saccharomyces cerevisiae suspensions with fresh extracts as well as with the fractions of the extract stored at –20°C for 2.5 months led to a significant reduction in the intensity of the inversion and the eutectic melting peaks. Probably the binding of a certain part of water molecules with organic components of extracts’ fractions has been occured in mixtures and as a result water was not involved into the formation of eutectic compositions. Влияние ДМСО на поведение нервных клеток новорожденных крыс в условиях культивирования in vitro после замораживания-отогрева Т.Д. ЛЯШЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков DMSO Effect on Behavior of Nerve Cells of New-Born Rats During In Vitro Culturing after Freeze-Thawing T.D. LYASHENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 210ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 The research aim was to study the effect of various DMSO concentrations as well as blood serum on the pre- servation of post-natal nerve cells (NCs) after freeze-thaw- ing. Nerve cells were isolated from brain tissue of new-born rats. The viability of cells was estimated on the exclusion of 0.4% trypan blue. Freezing was performed for the concent- ration of 20×106 cells/ml under protection of 2.5, 5, 7.5, 10 and 12.5% DMSO in presence or absence of 10% rat blood serum with the rate of 1°C/min down to –80°C. Afterwards the cells were transfered into liquid nitrogen. NCs (2×106 cells/ml) were cultured in DMEM/F12 with 10% rat serum. The cells were stained to reveal beta-tubulin III, nestin and vimentin. Freeze-thawing of NCs without DMSO both in presence and absence of the serum leads to the reduction of viability and death of significant amount of cells. DMSO prevents NCs from the damage during their cryopreservation, which is manifested by the increased viability of cells after thawing. Maximum integrity of NCs was observed after freeze-thawing with 5 or 7.5% DMSO. Herewith the presence of serum in cryopreservation medium had no effect on the integrity and viability of NCs. Culturing of NCs cryopreserved with DMSO with no serum as well as in its presence and with 2.5% DMSO is characterized by the formation of small, loosen and shape- less aggregates, not adhered to the substrate. Herewith small amount of single cells adhered to the substrate, but their flattening was not observed. Culturing of NCs cryopreserved in the presence of serum and 5, 7.5, 10 and 12.5% DMSO resulted in the formation of aggregates, which adhered, and their cells migrated, differen- tiated and proliferated. Herewith, initially the glial cell monolayer was formed, then beta-tubulin positive cells of neuroblast morphology and colonies of nestin and vimentin positive cells appeared. Maximum number of neuroblasts and colonies of stem/progenitor cells appeared during culturing of NCs, frozen-thawed with 7.5 and 10% DMSO. During culturing of NCs frozen-thawed with 5 and 12.5% DMSO neuroblasts and colonies of nerve stem/progenitor cells appeared later and their number was significantly lower. Thus nerve stem/progenitor cells of newborn rats pre- serve the ability to proliferation and differentiation after freeze-thawing. Herewith, the highest results of cryopreser- vation of newborn rat NCs are achieved when using 7.5 or 10% DMSO solutions supplemented with 10% blood serum. Целью исследования явилось изучение действия раз- личных концентраций ДМСО, а также сыворотки крови на сохранение постнатальных нервных клеток (НК) после замораживания-отогрева. Нервные клетки изолировали из ткани мозга ново- рожденных крыс. Жизнеспособность клеток оценивали по исключению 0,4% трипанового синего. Заморажива- ние проводили в концентрации 20×106 млн клеток/мл под защитой 2,5; 5; 7,5; 10 и 12,5% ДМСО при наличии и отсутст- вии 10% сыворотки крыс со скоростью 1°С/мин до –80°С. Далее клетки переносили в жидкий азот. 2×106 млн/мл НК культивировали в среде DMEM/F12 с 10% сыворотки крыс. Клетки окрашивали на β-тубулин III, нестин и виментин. Замораживание-отогрев НК без ДМСО как при на- личии, так и при отсутствии сыворотки приводит к па- дению жизнеспособности и гибели значительной части клеток. ДМСО предохраняет НК от повреждения в про- цессе их криоконсервирования, что выражается в уве- личении сохранности клеток после отогрева. Максималь- ная сохранность НК наблюдалась при криоконсер- вировании их с 5 и 7,5% ДМСО. При этом наличие сыво- ротки в среде криоконсервирования на сохранность и жизнеспособность НК влияния не оказывало. Культивирование НК, криоконсервированных с ДМСО при отсутствии сыворотки, а также при наличии сыво- ротки и 2,5% ДМСО, характеризуется формированием мелких, рыхлых и бесформенных агрегатов, которые к подложке не прикрепляются. При этом к подложке прик- репляется небольшое количество единичных клеток, од- нако их распластывания не наблюдалось. Культивирование НК, криоконсервированных при на- личии сыворотки и 5; 7,5; 10 и 12,5% ДМСО, приводило к формированию агрегатов, которые прикреплялись, а их клетки мигрировали, дифференцировались и проли- ферировали. При этом вначале происходило формиро- вание монослоя клеток глии, затем появлялись β-тубу- лин-III − положительные клетки с морфологией нейро- бластов и колонии нестин- и виментин-положительных клеток. Максимальное количество нейробластов и ко- лоний стволовых/прогениторных клеток появлялось при культивировании НК, криоконсервированных с 7,5 и 10% ДМСО. При культивировании НК, криоконсервирован- ных с 5 и 12,5% ДМСО, нейробласты и колонии нервных стволовых/прогениторных клеток появлялись позже и количество их было значительно меньшим. Таким образом, нервные стволовые/прогениторные клетки новорожденных крыс сохраняют способность к пролиферации и дифференциации после заморажи- вания. При этом наилучшие результаты криоконсер- вирования НК новорожденных крыс достигаются при использовании 7,5 и 10% ДМСО и 10% сыворотки крови. Криоконсервирование как фактор модуляции иммунокорригирующего потенциала клеток фетальной печени А.Ю. ДИМИТРОВ, Е.Д. ЛУЦЕНКО, О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО, М.В. ОСТАНКОВ, А.Н. ГОЛЬЦЕВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Cryopreservation as Modulation Factor for Immune Correcting Potential of Fetal Liver Cells of Different Gestation Terms A.YU. DIMITROV, YE.D. LUTSENKO, O.V. CHELOMBITKO, M.V. OSTANKOV, A.N. GOLTSEV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 211ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Применение фетального материала получило широ- кое распространение в лечении аутоиммунных заболе- ваний (АИЗ). Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) фетальной печени (ФП) благодаря уникальной иммуно- модулирующей активности заняли ключевое место в кле- точной терапии. Одним из механизмов влияния МСК на иммунные клетки реципиента является синтез фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). Криоконсервирова- ние позволяет не только сохранить биообъект, но и пере- вести его в качественно новое состояние с характерными изменениями на транскрипционном уровне. Известно, что иммуномодулирующая активность клеток ФП (КФП) после воздействия ультранизких температур изменяется и может даже превышать активность нативных клеток. Данные факты обусловили необходимость изучения изменений на молекулярно-генетическом уровне в МСК после процедуры замораживания КФП, что поможет усовершенствовать программы терапевтической аппли- кации данного материала после криоконсервирования. Цель исследования – изучение функциональной ак- тивности гена Ido в КФП разных сроков гестации после криоконсервирования для оценки их терапевтической эффективности при лечении АИЗ. Объектом исследования были КФП мышей линии СВА/Н. Суспензию клеток получали методом гомогени- зации в среде 199 КФП плодов мышей 14 и 18 суток гестации. Криоконсервировали КФП под защитой 10% ДМСО со скоростью замораживания 1°С/мин до –25°С и с последующим погружением в жидкий азот на прог- раммном замораживателе УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины). Оттаивание проводили на водяной бане при 37°С. Экспрессию гена Ido в общей суспензии КФП, а также в выделенных на магнитном сортере фракциях CD105– и CD105+ (МСК) определяли методом ОТ-ПЦР, детекцию продуктов амплификации проводили на биоанализаторе Agilent 2100 (USA). Установлены отличия содержания транскриптов гена Ido в нативных КФП 15 и 18 суток гестации. Фракция CD105+ КФП ранних сроков развития характеризовалась значительно большим содержанием мРНК Ido по сравнению с общей суспензией КФП, фракцией CD105−, а также с фракциями КФП поздних сроков развития. После криоконсервирования наблюдались изменения в активности транскрипции гена Ido. Установлен факт повышения экспрессии гена Ido в криоконсервирован- ных КФП поздних сроков гестации. Таким образом, крио- консервирование в зависимости от срока гестации может дифференцированно активировать в МСК ФП экспрес- сию гена Ido. Подобные исследования позволят повы- сить эффективность лечения АИЗ трансплантацией крио- консервированных МСК. Application of fetal material is widely used for treatment of autoimmune diseases (AID). Fetal liver (FL) mesenchymal stem cells (MSC) play a key role in cell therapy due to their unique immunomodulatory activity. Indolamine 2,3-dioxy- genase (IDO) synthesis is one of the possible mechanisms how MSC influence the recipient’s immune cells. Cryopre- servation allows not only to store biological material but to transfer it in qualitatively new state with typical changes at transcriptional level. It is known that immune modulating activity of FL cells (FLC) changes after the influence of ul- tralow temperatures and can even exceed the activity of untreated cells. These data have stipulated the necessity to study the molecular-genetic changes in MSCs after the cryopreservation of FLC, that might help to improve the programs for therapeutic application of the given material after its cryopreservation. The research aim was to study the functional activity of Ido gene in FLC of different gestation terms after cryo- preservation to estimate their therapeutic efficiency during AID treatment. The research object were FLC of CBA/H mice. Cell sus- pension was obtained by homogenization of murine fetuses of the 14th and 18th gestation day in medium 199. FLC were cryopreserved under protection of 10% DMSO in the pro- grammable freezer according to the following program: cooling with the rate of 1°C/min down to –25° with following plunging into liquid nitrogen. Thawing was carried-out at 37°C in water bath. Expression of Ido gene in total FLC suspension as well as CD105– and CD105+ (MSC) fractions separated by immunomagnetic sorting were examined by RT-PCR method, the amplification products were detected using bioanalyzer Agilent 2100 (USA). Differences of Ido gene transcript content of the 14th and 18th gestation day native FLCs were found. CD105+ fraction of FLC of early gestation terms had significantly higher Ido mRNA content comparing to total FLC suspen- sion, CD105– fraction and the fraction of FLC of later ges- tation terms. After cryopreservation the changes in the acti- vity of Ido gene transcription were observed. The fact of increased Ido expression in cryopreserved FLCs of later gestation terms was established. Thus depending on the gestation term cryopreservation can differentially activate Ido gene expression in FL MSC. Such studies will allow the improvement of AID treatment efficiency using cryopre- served MSC transplantation. Постгипертонический стресс и осмотические свойства замороженных-отогретых эритроцитов Т.И. ДЕЙНЕКО1, К.В. МАРКОВА2, В.В. РАМАЗАНОВ1, В.А. БОНДАРЕНКО1 1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков 2Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина Post-Hypertonic Stress and Osmotic Properties of Frozen-Thawed Erythrocytes T.I. DEYNEKO1, K.V. MARKOVA2, V.V. RAMAZANOV1, V.A. BONDARENKO1 1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 2V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, Ukraine 212ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 При быстром замораживании-отогреве образцов клеток с высокой концентрацией (погружение в жидкий азот и отогрев на водяной бане при 40°С) значительный вклад в повреждение вносит постгипертонический стресс, которому подвергаются клетки на конечной стадии быстрого отогрева. В связи с этим возникает вопрос поиска подходов повышения устойчивости кле- ток к данному повреждающему фактору. В эритроцитах, отмытых после замораживания в сре- де с декстраном, выявляются значительные изменения осмотических свойств по сравнению с интактными клет- ками. Наблюдается повышение осмотической устойчи- вости эритроцитов в гипотонической области концентра- ции NaCl (0,09−0,4%), которая усиливается при повыше- нии концентрации декстрана в среде замораживания от 5 до 20%. В интервале концентрации NaCl 0,45−0,9% отмечается снижение осмотической устойчивости эрит- роцитов, которая не зависит от концентрации декстрана в среде замораживания. Кроме того, выявляется значи- тельное снижение содержания глутатиона в клетках пос- ле их отмывания от криоконсерванта. Включение в среду замораживания проникающего криопротектора ДМСО в концентрации 5% уменьшает выраженность изменений указанных осмотических свойств и предотвращает поте- рю барьерной функции мембран для глутатиона. На основе полученных результатов можно предпо- ложить, что образование гипотонической устойчивости замороженных-отогретых эритроцитов при концентра- ции NaCl 0,09−0,4% связано с концентрированием декс- трана при замораживании, тогда как повышение осмо- тической хрупкости эритроцитов при концентрации NaCl 0,45−0,9% определяется общим повреждающим воздей- ствием при замораживании-отогреве, включая гиперто- ническое и постгипертоническое воздействия. Включе- ние в криоконсервант ДМСО и поступление его в клетки обеспечивают предупреждение их значительной дегид- ратации и ослабление повреждающего действия кон- центрационного градиента декстрана и гипертоничес- кого стресса при охлаждении. В результате эритроциты, замороженные в среде с декстраном и ДМСО, по срав- нению со средой, содержащей только декстран, являются более устойчивыми к постгипертоническому стрессу при отогреве и сохраняют свои осмотические свойства. Rapid freeze-thawing of highly concentrated cell samp- les (plunging into liquid nitrogen and thawing in water bath at 40°C) results in cell damage, which is mainly caused by post-hypertonic stress occured in the cells during final stage of rapid thawing. In this regard the searching of approaches to increase the cell resistance to this damaging factor ap- pears. Significant changes of osmotic properties if compared with the intact cells are revealed in erythrocytes washed after freeze-thawing in the medium with dextran. The increas- ing of erythrocyte osmotic resistance is observed in hypo- tonic NaCl concentration (0.09–0.4%) with following rise after increasing the dextran concentration in freezing me- dium from 5 to 20%. Within the range of 0.45–0.9% NaCl concentration the reduction of erythrocyte osmotic resistan- ce is observed, and no dependence on dextran concentration in freezing medium is found. Moreover, a significant reduction of glutathione content in the cells after removing the cryo- protectant is found. Introduction into freezing medium of 5% penetrating cryoprotectant DMSO decreases the inten- sity of changes in the mentioned osmotic properties and prevents the loss of barrier membrane function in respect of glutathione. Based on the obtained results we may suggest that for- mation of hypotonic resistance of frozen-thawed erythrocy- tes in 0.09–0.4% NaCl concentration range is associated with dextran concentrating during freezing. Whereas the increasing of erythrocyte osmotic fragility in 0.45–0.9% NaCl concentration range is determined by total damaging effect during freeze-thawing, including hypertonic and post- hypertonic effects. Introduction of DMSO into cryopreser- vative and its entering into the cells provides the prevention of their significant dehydration and weakening of damaging effect of concentration gradient of dextran and hypertonic stress during cooling. Finally, the erythrocytes frozen in the medium with dextran are more resistant to post-hyper- tonic stress during thawing and preserve their osmotic properties. Сохранность меристем винограда в процессе низкотемпературного консервирования Ю.С. ЛЫСАК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Integrity of Grape Meristems During Low-Temperature Preservation YU.S. LYSAK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 213ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Данное исследование направлено на разработку ме- тодов низкотемпературного консервирования меристем винограда с использованием быстрых режимов заморажи- вания и витрифицирующих криозащитных сред на ос- нове криопротекторов ряда диолов, полиолов и их смесей. Для исследования токсического действия криопро- текторов на меристемы их помещали в растворы крио- протекторов на 30 мин, затем отмывали путем 2-кратной смены среды 1/2 MS в течение 40 мин. Сохранность ме- ристем винограда оценивали на 5-й день культивиро- вания путем подсчета количества живых меристем к об- щему их количеству. Исследовали следующие криозащитные среды: 1 М раствор 1,2-пропандиола (1,2-ПД) на среде 1/2 MS; 7%-й раствор поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 24000 на среде 1/2 MS; раствор 1,2-ПД в концент- рации 1 М и ПВП в концентрации 3,5% на среде 1/2 MS; раствор 1,2-ПД в концентрации 1 М и ПВП в концент- рации 7% на среде 1/2 MS; раствор этиленгликоля в кон- центрации 1 М и ПВП в концентрации 3,5% на среде 1/2 MS. Криоконсервирование осуществляли следующим способом: меристемы в течение 30 мин насыщали крио- протекторами, далее помещали их в пленочные тонко- стенные контейнеры, изготовленные на основе фторо- пласта, и замораживали прямым погружением в жид- кий азот. Отогрев проводили на водяной бане с темпера- турой воды 35°С в течение 5−10 с. После отогрева мери- стемы отмывали от криопротекторов, помещали на среду 1/2 MS и выдерживали в темноте в течение 24 ч. Затем их переносили в фитотрон для дальнейшего куль- тивирования, на 5-й день определяли сохранность. Жи- выми считались меристемы, проявляющие тенденцию к росту и приобретающие зеленую окраску. Из исследованных криопротекторов наиболее эффек- тивным и наименее токсичным оказался 1,2 ПД (90% сох- ранности), тогда как применение ПВП дало 55% сохран- ных меристем на этапе экспозиции. После заморажи- вания-отогрева сохранность меристем для 1,2-ПД и ПВП составила 45 и 10% соответственно. При использовании смесей криопротекторов в криозащитных средах наи- более эффективной оказалась комбинация 1 М раствора 1,2 ПД и 7% раствора ПВП (сохранность меристем после размораживания составила 80%). Результаты проведенных исследований свидетельст- вуют о том, что использование смесей криопротекторов в криозащитных средах для замораживания меристем ви- нограда является более эффективным по сравнению с при- менением отдельных криопротекторов. This research is directed to development of low-tempera- ture preservation methods of grape meristems using rapid regimens of freezing and cryoprotective vitrifying media based on cryoprotectants of diol and polyol series and their mixtures. In order to study the cryoprotectant toxic effect on meristems they were placed into cryoprotectant solutions for 30 min, then washed by 2-fold change of medium 1/2 MS during 40 min. Survival of grape meristems was evaluated to the 5th day of culturing by calculation of a number of vital meristems in relation to their total number. We studied the following cryoprotective media: 1 M solu- tion of 1,2-propane diol (1,2-PD) in the medium 1/2 MS; 7% polyvinyl pyrrolidone (PVP) of 24,000 molecular mass in the medium 1/2 MS; solution of 1 M 1,2-PD and 3.5% PVP in the medium 1/2 MS; solution of 1 M 1,2-PD and 7% PVP in the medium 1/2 MS; ethylene glycol of 1 M concentration and 3.5% PVP in the medium 1/2 MS. Cryopreservation was performed by the following method: meristems were saturated with cryoprotectants during 30 min, then placed into plastic thin-walled containers made of fluoroplasts, and frozen by direct plunging into liquid nitrogen. The thawing was carried-out in water bath under temperature of 35°C during 5–10 sec. After thawing the meristems were washed to remove cryoprotectants, placed into the medium 1/2 MS and kept in the darkness for 24 hrs. Then they were transfered into phytotron for further cultur- ing and by the 5th day the survival was assessed. Meristems manifesting tendency to growth and colored green were considered as viable ones. Among the investigated cryoprotectants the most effective and the least toxic was 1,2-PD (90% survival), whereas the application of PVP resulted in 55% survival after exposure stage. After freeze-thawing the survival of meristems in the cases with 1,2-PD and PVP made 45 and 10%, accordingly. When using mixed cryoprotective media the most effective was the combination of 1 M 1,2-PD and 7% PVP (survival of meristems after freeze-thawing was 80%). The results of performed researches testify to the fact that the using of cryoprotectant mixtures in cryoprotective media for freezing of grape meristems is more effective if compared with application of single cryoprotectants. Влияние криоконсервирования на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс Т.А. ЮРчУК1, Г.А. БОЖОК2, И.А. БОРОВОЙ3, Т.М. ГУРИНА2, Т.П. БОНДАРЕНКО2 1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков 3Институт сцинтилляционных материалов НАН Украины, г. Харьков Cryopreservation Effect on Formation of J-Aggregates in Rat Adrenal Cortex Cell T.A. YURCHUK1, G.A. BOZHOK2, I.A. BOROVOY3, T.M. GURINA2, T.P. BONDARENKO2 1V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, Ukraine 2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 3Institute for Scintillation Materials of the National Academy of Sciences of Ukraine 214ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 Одним из способов коррекции гипокортицизма явля- ется трансплантация клеток коры надпочечников (ККН), а криоконсервирование решает вопрос хранения биоло- гического материала. Однако остается проблема сохра- нения гормон-продуцирующей активности ККН. Для обеспечения этой функции необходимо наличие элект- рохимического градиента (ЭХГ) на митохондриях ККН. ЭХГ можно оценить, используя катионный флуорес- центный краситель JC-1. Цель работы – изучение влияния криоконсервиро- вания в криозащитных средах с различным содержанием ДМСО и эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) на ЭХГ митохондрий ККН крыс с помощью флуоресцент- ного красителя JC-1. Клетки коры надпочечников получали ферментатив- ным способом из коры надпочечников половозрелых крыс. Для получения криозащитных сред использовали концентрации ДМСО 5; 7; 10 и 15%. Часть сред, кроме ДМСО, содержала добавку в виде 25% ЭТС. Токсичность различных концентраций криопротектора определяли путем оценки жизнеспособности и сохранности ККН после 30 мин инкубации в криозащитных средах. Показа- тели жизнеспособности во всех пробах колебались в сред- нем от 70 до 80%, а сохранность оставалась на уровне контроля в пробах с концентрацией 7 и 10% ДМСО с ЭТС и в 10% ДМСО без ЭТС (р < 0,05). Эти показатели оцени- вали также после отогрева и установили, что жизне- способность ККН после криоконсервирования с 7 и 10% ДМСО с ЭТС составила 70%, тогда как с этими же кон- центрациями ДМСО, но без ЭТС в криозащитных сре- дах – 50% (р < 0,05). Самая высокая сохранность наблю- далась в суспензии, криоконсервированной с 7% ДМСО и ЭТС (80%). После размораживания клетки садили на планшет с коллагеновой подложкой и культивировали в течение суток при 37°С и 5% СО2. После этого клетки окрашивали JC-1, отмывали, подсчитывали количество клеток, содер- жащих j-агрегаты. Клетки, криоконсервированные в криозащитной среде с 7% ДМСО, содержали наиболь- шее количество j-агрегатов – 40%, а с концентрациями ДМСО 5; 10 и 15% их количество колебалось в пределах 10–20% по сравнению с 5% в нативной суспензии. Коли- чество j-агрегатов в клетках, криоконсервированных в сре- дах с комбинацией ДМСО/ЭТС, не отличалось от натив- ной суспензии. Таким образом, в ККН, криоконсервированных в крио- защитной среде только с ДМСО, после отогрева форми- руется больше j-агрегатов по сравнению с клетками, крио- консервированными в средах с комбинацией ДМСО/ ЭТС. The transplantation of adrenal cortex cells (ACC) is one of efficient approaches in hypocorticism treatment, and cryopreservation solves the problem of storage of biolo- gical materials. However, there have been remained the prob- lems of preserving hormone-producing activity in ACC. Providing of this function requires the electrochemical gradient (ECG) on ACC mitochondria. ECG can be estimated by using the cationic fluorescent dye JC-1. The research aim was to study the effect of cryopreser- vation with the cryoprotective media with various DMSO concentrations and fetal calf serum (FCS) on rat ACC mito- chondria ECG by fluorescent dye JC-1. Adrenal cortex cells were obtained by enzymatic method from the adrenal cortex of adult rats. We used several con- centrations of DMSO (5, 7, 10 and 15%) to obtain the cryo- protective media. The part of the media were supplemented with 25% FCS. The toxicity of different concentrations of cryoprotectants was determined by assessing the viability and survival of ACC 30 min later the incubation in cryo- protective media. The viability in all the samples ranged from 70 to 80%, and the survival remained at the control level in the samples with 7 and 10% DMSO solutions supplemented with FCS and in 10% DMSO solutions with- out FCS (p < 0.05). These indices were also evaluated after thawing and there was found that the viability of ACC after cryopreservation in 7 and 10% DMSO solutions supplemen- ted with FCS was 70%, whereas with the same concentra- tions of DMSO, but without FCS in the cryoprotective media it made 50% (p < 0.05 ). The highest survival was observed in the cell suspension cryopreserved with 7% DMSO and FCS and made 80%. Cells were placed in the plate with the collagen substrate after thawing and cultured overnight at 37°C and 5% CO2. Afterwards they were stained with JC-1, washed, the amount of cells containing j-aggregates was counted. The cells, frozen-thawed in cryoprotective medium with 7% DMSO, contained the highest number of j-aggregates (40%), with concentrations of DMSO 5; 10 and 15% their number varied between 10–20% if compared to 5% in native suspension. The number of j-aggregates did not differ from the native suspension in the cells frozen-thawed with DMSO/FCS com- bination. Thus, ACC frozen-thawed in cryoprotective medium with solely DMSO contained more j-aggregates after thawing if compared with the cells frozen-thawed in the media with a combination of DMSO/FCS. Сохранность клеток микроорганизмов после иммобилизации в различных гелях с последующим замораживанием до –70°С Т.В. ДОРОФЕЕВА, О.В. ПИШКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Integrity of Microorganisms’ Cells after Immobilization in Different Gels with Following Freezing Down to –70°C T.V. DOROFEYEVA, O.V. PISHKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 215 В связи с развитием современных биотехнологи- ческих производств возрос интерес к проблеме иммоби- лизации клеток микроорганизмов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов-продуцентов биологически ак- тивных веществ имеют ряд преимуществ в технологичес- ких процессах перед свободными клетками – более вы- сокую продуктивность, экономичность, биологическую безопасность, чистоту конечного продукта и др. Пред- полагается, что рядом преимуществ будут обладать и медицинские препараты иммобилизованных микроор- ганизмов. В зависимости от задач применяют три вида иммобилизации клеток микроорганизмов – на поверх- ности носителей, изоляция биологическими мембрана- ми, в материале носителя. Последний способ иммобили- зации, на наш взгляд, может представлять интерес и с точки зрения повышения сохранности микробных клеток в процессе хранения при различных температурах. Цель работы − изучение сохранности микроорганиз- мов-эубиотиков после иммобилизации в различные гели и кратковременного замораживания до −70°С в этих гелях. Объектом исследования были микроорганизмы Sac- charomyces cerevisiae, Bifidobacterium bifidum, Esche- richia coli, вегетативные формы Bacillus subtilis. Мик- роорганизмы включали в гели альгината кальция, каррагинана, агарозы, в предварительно полимеризо- ванный линейный полиакриламид. Иммобилизацию клеток проводили в соответствии с методиками, описан- ными в руководстве под редакцией J. Woodward (1988). Клетки, иммобилизованные в блоках гелей объемом 5 мл, замораживали в пенициллиновых флаконах в парах азота при −70°С. Через 3-е суток отогревали на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность микроорганизмов оп- ределяли по способности к колониеобразованию. Было установлено, что иммобилизация в гелях альги- ната кальция, каррагинана и агарозы не приводит к ги- бели микробных клеток. Иммобилизация в полиакрил- амидном геле приводит к достоверной гибели части кле- ток. При замораживании до −70°С наиболее низкая выжи- ваемость была также в образцах с полиакриламидным гелем. Due to the development of contemporary biotechno- logical technologies the interest to the problem of microor- ganism cell immobilization has increased. Immobilized cells of microorganism-producers of biologically active substan- ces have some advantages in technological processes if compared with ‘free’ cells, i.e. they are of higher produc- tivity, cost effectiveness, biological safety, purity of final product etc. It is supposed that some advantages will be inherent to medical preparations of immobilized microorga- nisms. Depending on the tasks there are applied three types of microorganism cell immobilization: on a surface of carriers; isolation by biological membranes; on the carrier material. The latter, from our point of view, may be of interest as for increasing the integrity of microbial cells during storage at different temperatures. The research aim was to study the integrity of micro- organisms-eubiotics after immobilization into different gels and short-term freezing down to –70°C in these gels. The research objects were microorganisms Saccharomy- ces cerevisae, Bifidobacterium bifidum, Escherichia coli and vegetative forms of Bacillus subtilis. The microorga- nisms were introduced into gels of calcium alginate, carra- geenan, agarose, into preliminary polymerized linear polyac- rylamide. The cells were immobilized in the accordance with the methods described in the guidance edited by J. Wood- ward (1988). The cells immobilized in 5 ml gel blocks were frozen in penicillin flasks by placing into nitrogen vapors at –70°C. In 3 days they were thawed on water bath at 37°C. Viability of microorganisms was examined on the ability to colony formation. It has been established that immobilization in gels of calcium alginate, carrageenan and agarose does not lead to the death of microbial cells. Immobilization in polyacryl- amide gel results in significant death of the part of cells. During freezing down to –70°C the lowest survival was also in the samples with polyacrylamide gel. Подбор условий культивирования клеток надпочечников взрослых крыс Г.В. ДУДЕЦКАЯ, Г.А. БОЖОК, Т.П. БОНДАРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Selection of Culturing Conditions for Cells of Adult Rat Adrenal Glands G.V. DUDETSKAYA, G.A. BOZHOK, T.P. BONDARENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 216 Культивирование является одним из способов оценки жизнеспособности и функциональной активности как нативных, так и криоконсервированных клеток. Поэтому подбор оптимальных условий культивирования для на- тивных клеток является целесообразным. Цель работы − сравнить эффективность использо- вания различных подложек (покровное стекло, пластик или коллаген тип I) и сред культивирования различного состава. Суспензию клеток получали из надпочечников взрослых крыс. Жизнеспособность суспензии составила 90%. Средами для культивирования были: среда 199+5% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) (среда 1), среда 199+5% ЭТС+ФРН (фактор роста нервов) (среда 2), среда 199+10% ЭТС (среда 3), среда 199+15% ЭТС (среда 4). При культивировании клеток на покровных стеклах состав среды не имел решающего значения, так как клет- ки не прикреплялись к стеклу и оставались в суспензии. В надосадке при окрашивании трипановым синим опре- делялись как жизнеспособные, так и мертвые клетки. При использовании пластиковой подложки и всех сред на 3-и сутки прикреплялось 70% клеток. Клетки были разных размеров, распределены по всей поверхности, имели ок- руглую форму, подобную нативной суспензии, наблю- дались агрегаты клеток. На 7-е сутки количество клеток сохранялось, также наблюдалось небольшое количество распластанных клеток. Однако уже на 11-е сутки при при- менении сред 1, 2 и 3 количество клеток значительно снизилось. В образцах, где была использована среда 4, клетки сохранялись прикрепленными и распластанными, тем не менее склонность к образованию монослоя не отмечалась. К 14-м суткам культивирования во всех образ- цах прослеживалась деградация клеток. Применение ча- шек Петри, покрытых коллагеном, показало, что на 3-и сутки культивирования было прикреплено 90% клеток при использовании всех сред культивирования. Липидо- содержащие клетки распределялись по всей поверхности, большая часть из них распластывалась. Также были клет- ки округлой и фибробластоподобной формы. К 7-м сут- кам культивирования в средах 2 и 4 местами наблюдалась тенденция к образованию монослоя. На 11-е сутки куль- тивирования при использовании среды 1 клетки вновь стали округляться и их количество уменьшилось. При применении сред 2, 3 и 4 клетки образовывали небольшие участки монослоя. На 14-е сутки при использовании среды 1 на поверхности подложки сохранялись единичные клетки. При культивировании в среде 3 наряду с рас- пластыванием у части клеток культуры наблюдались явления деградации. Применение сред 2 и 4 позволило получить наибольшее количество прикрепленных и распластанных клеток, а также сохранить участки моно- слоя. Установлено, что из 4-х апробированных вариантов сред наиболее эффективными оказались среды 2 и 4 в сочетании с коллагеновой подложкой, которые способ- ствовали переживанию клеток в культуре до 14 суток. Culturing is one of the ways to assess the viability and functional activity of both native and cryopreserved cells. Therefore the selection of optimal culturing conditions for native cells is an expedient one. The research aim was to compare the efficiency of the use of different substrates (cover glass, plastic or collagen type I) and culturing media of different composition. Cell suspension was derived from adult rat adrenal glands. Viability of the suspension was 90%. The media for cultu- ring were as follows: medium 199 + 5% FCS (fetal calf serum) (medium 1), medium 199 + 5% FCS + NGF (nerve growth fac- tor) (medium 2), medium 199 + 10% FCS (medium 3), medium 199 + 15% FCS (medium 4). During cell culturing on cover glasses the medium com- position had no decisive value, since the cells did not adhere to glass and remained in the suspension. When staining with trypan blue there were found both viable and dead cells in the supernatant. To the 3rd day 70% of cells were adhered when using plastic embedding in all the media. The cells were of different dimensions, distributed over the whole surface, were of round shape, similar to native sus- pension, there were observed cell aggregates. To the 7th day the number of cells was the same, and there was found a small amount of flattened cells too. However, to the 11th day when using the media 1, 2 and 3 the number of cells was significantly reduced. In the samples where the medium 4 was used the cells remained adhered and flattened, ne- vertheless, no tendency to monolayer formation was noted. To the 14th culturing day in all the samples there was observed the cell degradation. Use of Petri dishes coated with collagen has shown that to the 3rd day of culturing 90% of cells were adhered with applying all culturing media. Lipid-containing cells were distributed over the whole surface, the most of them was flattened. In addition there were the cells of round and fibroblast-like shapes. To the 7th culturing day when using the media 2 and 4 in some regions we observed the tendency of monolayer formation. To the 11th culturing day when using the medium 1 the cells again became round and their number decreased. When using media 2, 3 and 4 the cells formed small sites of monolayer. To the 14th day when using the medium 1 only single cells were preserved on the surface of the substrate. When using the medium 3 the cases of degradation were found along with flattening of the part of the culture cells. The using of media 2 and 4 allowed the obtaining of the highest amount of adhered and flattened cells, as well as preservation of monolayer sites. It has been established that among 4 tested variants of the media the most effective occurred to be the media 2 and 4 in combination with collagen embedding, contributing to the survival of cells in the culture up to 14 days. Спектрофлуориметрические характеристики экстрактов сердца животных Л.А. РОГОЗА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Spectrofluorimetric Characteristics of Animal Heart Extracts L.A. ROGOZA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 217 Существуют убедительные клинические данные, подтверждающие наличие в волокнах Пуркинье, пучке Гиса, перегородке, предсердиях, желудочках райониро- вания интенсивности (неравномерности) ревитализации, управляемого специфическими пептидами. Пептидные биорегуляторы также могут быть ростовыми дифферен- цирующими факторами как для стволовых, так и сома- тических клеток. В настоящее время установлена специфичность про- цессов образования таких пептидов в органах и тканях, а также уникальность органоспецифического набора пеп- тидов, получаемого in vivo (в норме и, возможно, при соот- ветствующих патологических состояниях). Цель работы − изучить спектрофлуориметрические характеристики экстрактов замороженных-отогретых фрагментов сердца половозрелых свиней и новорож- денных поросят, а также фрагментов сердца молодых и взрослых крыс. Эксперименты проведены в соответствии с “Общими принципами экспериментов на животных”, одобрен- ными III Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2007 г.) и согласованными с положениями “Европейской Конвенции о защите позвоночных живот- ных, которые используются в экспериментальных и дру- гих научных целях” (Страсбург, 1986 г.). Экстракт получали из криоконсервированных фраг- ментов сердца свиней и поросят и фрагментов сердца крыс путем их инкубирования в физиологическом раст- воре 60 мин. Полученные экстракты фильтровали и осво- бождали от термолабильных белков. Спектры флуорес- ценции измеряли на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse (Австралия). Спектры флуоресценции экстрактов находятся в об- ласти 290–450 нм. При возбуждении светом с длиной волны 280 нм максимум спектров флуоресценции нахо- дится в области 340–354 нм, что может свидетельствовать о наличии в экстрактах доступных растворителю или на- ходящихся в свободном состоянии остатков триптофана. Наблюдаемые отличия в спектрах флуоресценции экстрактов свидетельствуют о том, что их состав зависит от источника получения, и они включают в себя пептиды, различающиеся как по своему количественному соотно- шению, так и по аминокислотному составу. Получены также синхронные спектры экстрактов, ко- торые могут быть использованы для идентификации и стандартизации экстрактов при изучении их биологичес- кой активности. There are the clinical data that Purkinje fibers, bundle of His, interseptum, atria, ventricles possess zoning of intensity (non-uniformity) of revitalization, controlled by specific peptides. Peptide bioregulators also may be growth differen- tiation factors for both stem and somatic cells. Noadays the specificity of the formation processes of these peptides in organs and tissues is established as well as the fact that the obtained in vivo set of molecules represents a unique organ specific (in the norm and likely in corres- ponding pathological states) peptide complex. The research aim was to study spectrofluorimetric cha- racteristics of extracts of frozen-thawed heart fragments of adult pigs and new-born piglets, as well as those of young and adult rats. The experiments were carried-out in accordance with General principles of the experiments in animals, approved by the 3rd National Congress on Bioethics (Kiev, Ukraine, 2007) and coordinated with the statements of European convention on the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes (Strasbourg, 1986). The extract was derived from frozen-thawed fragments of pig and piglet hearts, as well as from rat hearts by means of incubation in physiological solution during 60 min. The obtained extracts were filtered and creared from thermolabile proteins. Fluorescence spectra were measured with spectro- fluorimeter Varian Cary Eclipse (Australia). Fluorescence spectra of extracts are within the range of 290–450 nm. At light excitation with 280 nm wave length the maximum of fluorescence spectra are within the range of 340– 354 nm, testifying to the presence of available for solvent or being in a free state tryptophan residues in the extracts. The observed differences in fluorescence spectra of ext- racts testify to the fact that their composition depends on the origin and they comprise peptides, varying both in the quantitative ratio and amino acid composition. There were also obtained synchronous spectra of the extracts, which may be used for identification and standar- dizing the extracts when investigating their biological acti- vity. Экспрессия βββββ-III тубулина в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят О.С. СИДОРЕНКО, Г.А. БОЖОК, Е.И. ЛЕГАч Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Expression of Beta-III Tubulin in Newborn Piglet Adrenal Cell Culture O.S. SIDORENKO, G.A. BOZHOK, E.I. LEGACH Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 218 В последнее время все больше внимания уделяется недифференцированным клеткам мозгового вещества надпочечников и рассматривается возможность их ис- пользования в регенеративной медицине. Вместе с сим- патическими нейронами они являются производными клеток нервного гребня, относящимися к симпатоадре- наловой линии, то есть имеют общего предшественника. Развитие клетки-предшественика по эндокринному или нейрональному пути определяется набором специфи- ческих факторов, выделяемых клетками микроокруже- ния. Методика обогащения культуры такими мультипо- тентными клетками включает в себя формирование сферических колоний клеток (хромосфер) в условиях, препятствующих их адгезии к поверхности культивиро- вания. Из клеток медуллы надпочечников быка были по- лучены хромосферы, клетки которых дифференциро- вались в нейроны под действием NGF. Цель работы − получение сферических структур (хро- мосфер) и исследование экспрессии β-III тубулина в культуре клеток надпочечников новорожденных поро- сят. Клетки, полученные из надпочечных желез фермен- тативным методом, культивировали в среде 199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. К 3−4-м суткам об- разовывался монослой, состоящий из крупных фибро- бластоподобных клеток, на котором в дальнейшем фор- мировались сфероподобные структуры. Затем часть кле- ток культивировали в среде с добавлением фактора роста нервов (NGF), остальные − в среде без NGF, и исследовали экспрессию β-III тубулина в обоих случаях. При культивировании сферические колонии увели- чивались в размере, из них выселялись клетки нейронопо- добной морфологии. Местами такие клетки образовыва- ли цепочки, соединенные тяжами, формируя сеть на мо- нослое из фибробластоподобных клеток. Иммуноцито- химическое окрашивание выявило экспрессию β-III тубу- лина в соме и отростках клеток, выселяющихся из сфери- ческих колоний. При этом фибробластоподобные клетки, формирующие монослой, не экспрессировали β-III тубу- лин. Экспрессия β-III тубулина наблюдалась в культурах, выращенных как в среде с NGF, так и без него. Таким образом, в культуре клеток надпочечников но- ворожденных поросят на монослое из фибробласто- подобных клеток формируются сферические клеточные колонии. В дальнейшем из них выселяются клетки нейро- ноподобной структуры, экспрессирующие β-III тубулин. Экспрессия β-III тубулина не зависит от присутствия NGF в среде культивирования. Nowadays more and more attention has been paid to non-differentiated cells of adrenal medulla and the possibi- lity of their application in regenerative medicine has been considered. Along with sympathetic neurons they are deri- vatives of the cells of neural crest referred to sympatho- adrenal line, i. e. have the common progenitor. The develop- ment of progenitor cell according to endocrine or neuronal lineage is determined by the set of specific factors, released by the microenvironment cells. The methods of enriching the culture with these multipotent cells comprise the forma- tion of spherical cell colonies (chromospheres) under the conditions preventing their adhesion to the culturing sur- face. From the cells of bovine adrenal medulla there were obtained chromospheres, the cells which differentiated into neurons under NGF effect. The research aim was to obtain spherical structures (chromospheres) and investigate the expression of beta-III tubulin in culture of newborn piglet adrenal cells. The cells obtained from adrenal glands by enzyme me- thod were cultured in medium 199 with 10% fetal calf serum. To the 3–4th day there was formed the monolayer consisting of large fibroblast-like cells, on which later the sphere-like structures appeared. Then a part of cells was cultured in the medium supplemented with the nerve growth factor (NGF) and the rest of them were cultured without NGF and there was examined the expression of beta-III tubulin in both cases. During culturing the spherical colonies increased, and the cells of neuron-like morphology migrated from them. Somewhere these cells formed the chains, connected with the bundles, forming the net on monolayer of fibroblast- like cells. Immune cytochemical staining revealed the expres- sion of beta-III tubulin in the soma and processes of cells, migrated from spherical colonies. Herewith the fibroblast- like cells forming monolayer did not express beta-III tubulin. The expression of beta-III tubulin was observed in the cul- tures grown both in the medium with NGF and without it. Consequently, spherical cell colonies are formed in adre- nal cell culture of newborn piglets on the monolayer of fib- roblast-like cells. Thereafter the cells of neuron-like structure migrate from them, and express beta-III tubulin. Expression of beta-III tubulin does not depend on the presence of NGF in culture medium. Применение физических факторов при создании девитализированных сосудистых скаффолдов Д.В. БЫЗОВ, Б.П. САНДОМИРСКИЙ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Application of Physical Factors when Designing Devitalized Vascular Scaffolds D.V. BYZOV, B.P. SANDOMIRSKIY Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 219 Существующие методы протезирования артерий ма- лого диаметра (d ≈ 6 мм) имеют ряд существенных недос- татков. Количество аутологичных сосудистых протезов ограничено, их выделение увеличивает длительность и травматичность оперативного вмешательства. Аллоген- ные протезы склонны к отторжению и тромбозам. Син- тетические графты непригодны для такого рода протези- рования. Технологии создания биологических протезов на основе ксеногенных сосудов до настоящего времени не эффективны. Концепция данного исследования базируется на ис- пользовании низких температур и ионизирующего облу- чения с целью девитализации ксеногенных артерий при сохранении их прочностных характеристик. Объектом исследования служили внутригрудные арте- рии половозрелых свиней, выделенные при соблюдении биоэтических правил. Заготовленные сосуды подвергали охлаждению до −196°С и последующему ионизирующе- му облучению в дозах, обеспечивающих стерилизацию образцов. Ультраструктуру артерий изучали с помощью оптической и электронной микроскопии. Механические параметры сосудов исследовали путем определения плас- тичности артериальной стенки. Также проводились гис- тологические исследования сосудистых скаффолдов пос- ле ксеногенной трансплантации под кожу и в системный кровоток в качестве протеза брюшной аорты. Замораживание до −196°С и последующее отогре- вание артерий свиньи приводили к очаговой десква- мации эндотелия. При этом коллагеновые и эластические волокна сосудистой стенки не имели грубых структур- ных нарушений. После облучения выявлены глубокие деструктивные изменения всех клеточных компонентов сосудистой стенки. В структуре медии эластические и коллагеновые волокна в основном сохранялись. Имплан- тация под кожу крысам артерий после замораживания продемонстрировала снижение выраженности иммун- ного ответа на ксеноткань. Не отмечено каких-либо реак- ций иммунного воспаления на артерии после заморажи- вания и облучения на всех сроках наблюдения. К 8-й неде- ле выявлено равномерное заселение импланта фибро- бластами реципиента. При имплантации в системный кровоток показано адекватное функционирование девита- лизированных артерий в течение 5 месяцев. Применение низких температур в сочетании с иони- зирующим облучением позволяет сохранить соедини- тельнотканную структуру нативных артерий, воздейст- вуя на основные носители иммуногенности – клетки. Пред- лагаемый метод девитализации позволяет создать полно- ценно функционирующие биологические сосудистые про- тезы и может быть альтернативой при выборе графтов для протезирования артерий малого диаметра, в том числе аортокоронарного шунтирования. Existing methods of prosthesis of small diameter (d ≈ 6 mm) arteries have certain short-comings. The number of autolo- gical vascular prostheses is limited, their isolation prolongs the duration and traumaticity of surgery. Allogeneic pros- theses are inclined to rejections and thrombosis. Synthetic grafts are not suitable for such prosthesis. The technologies of designing the biological prostheses based on xenogeneic vessels have not been effective till now. This research conceptual design is based on the use of low temperatures and ionizing irradiation aimed at devita- lization of xenogeneic arteries preserving their strength parameters. The research objects were intrathoracic arteries of matu- re pigs, isolated with meeting of the bioethical rules. The procured vessels were frozen down to –196°C and then were subjected to ionizing irradiation in the doses, providing sterilization of the samples. Ultrastructure of arteries were studied by means of optical and electron microcopies. Me- chanical parameters of vessels were investigated by deter- mining the plasticity of arterial wall. As well there were carried-out histological studies of vascular scaffolds after xenogeneic transplantation under the skin and into system blood flow as the prosthesis of abdominal aorta. Freezing down to –196°C and following thawing of pig arteries led to a focal desquamation of endothelium. Here- with collagen and elastic fibers of vascular wall had no strong structural impairments. Structure of arteries after irra- diation was characterized with deep destructive changes in cell components of vascular wall. In the structure of media the elastic and collagen fibers were basically kept. The imp- lantation of arteries under the rat skin after freeze-thawing demonstrated the reduced manifestation of immune res- ponse to the xenotissue. No immune inflammation reactions to arteries after freezing and irradiation at all the observation terms were found. To the 8th week there was revealed an even population of the implant with fibroblasts of a recipient. During implantation into system blood flow an adequate functioning of devitalized arteries during 5 months was shown. The application of low temperatures in combination with ionizing irradiation enables the preservation of connective- tissue structure of native arteries affecting the main carriers of immunogeneity, the cells. The proposed method of devita- lization allows the creation of integrally functioning bio- logical vascular prostheses and may be an alternative when selecting the grafts for prostheses of small diameter arteries, including the coronary artery by-pass. Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на функциональную активность нейтрофилов донорской крови, подвергнутых гипотермическому хранению О.Л. ГОРИНА, Н.Н. МОИСЕЕВА, А.К. ГУЛЕВСКИЙ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Influence of Cord Blood Low-Molecular Fraction on Functional Activity of Human Blood Neutrophils after Hypothermic Storage O.L. GORINA, N.N. MOISEYEVA, A.K. GULEVSKY Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 220 Хранение лейкоцитов в условиях гипотермии (4°С) является одним из доступных и простых методов для ши- рокого применения в трансфузиологии. Накопленный опыт свидетельствует о том, что функциональная актив- ность лейкоцитов в условиях положительных температур сохраняется лишь до 24 ч. Такой непродолжительный срок хранения обусловлен быстрым истощением энерге- тического потенциала нейтрофилов, что, в свою очередь, проявляется в ингибировании их основной функции (способности к хемотаксису и фагоцитозу), снижающей эффективность использования концентратов лейкоцитов в медицинской практике. Цель работы – изучить влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота (ФКК) и препарата сравнения Актовегина на фаго- цитарную и метаболическую активность нейтрофилов лейкоцитарной массы после гипотермического хранения в течение 24 ч. Установлено, что практически все изучаемые показа- тели фагоцитарной активности нейтрофилов, подверг- нутых гипотермическому хранению, достоверно (р < 0,05) снижаются по сравнению с анализируемыми показа- телями нативных клеток, что согласуется с данными лите- ратуры. Результаты наших исследований свидетельст- вуют о том, что инкубация лейкоцитов с ФКК в течение 45 мин повышала показатель фагоцитарного числа (ФЧ) нейтрофилов после гипотермического хранения в 1,7 ра- за по сравнению с контролем. Коэффициент завершен- ности фагоцитоза (КФЧ) нейтрофилов после инкубации с ФКК в оптимальной концентрации увеличивался в 1,8 раза. Инкубация лейкоцитов с Актовегином также стиму- лировала поглотительную (ФЧ) и переваривающую (КФЧ) способность фагоцитов, но в значительно большей кон- центрации препарата по сравнению с ФКК. Исследова- ние влияния ФКК и Актовегина на количество фагоцити- рующих нейтрофилов не выявило достоверных (р < 0,05) изменений данного показателя. Установлено, что после гипотермического хранения лейкоцитов показатель НСТ- теста достоверно (р < 0,05) не отличался от соответству- ющего показателя нативных клеток. Однако количество НСТ-положительных нейтрофилов после инкубации лей- коцитарной массы с ФКК достоверно (р < 0,05) превыша- ло значение в контроле. При внесении в среду инкуба- ции Актовегина достоверного (р < 0,05) повышения ис- следуемого показателя не отмечено. Таким образом, полученные результаты обосновы- вают перспективу включения низкомолекулярной фрак- ции кордовой крови и Актовегина в состав восстанавли- вающих сред после гипотермического хранения лейкоци- тов для повышения их функциональной активности. Storage of leukocytes under hypothermia (4°C) is an afferdable and simple method for wide application in trans- fusiology. The gained experience attests to the fact that functional activity of leukocytes at positive temperature remains unchanged only for 24 hrs. Such a short-term sto- rage is attributed to rapid depletion of neutrophil energy po- tential, which, in its turn, shows as inhibition of their prin- cipal functions (capacity for chemotaxis and phagocytosis) reducing the efficiency of usage of leukocyte concentrates in medicine. The research aim was the investigation of the influence of the cattle cord blood low-molecular (below 5 kDa) fraction (CBF) and the comparator agent Actovegin on phagocytic and metabolic activities of neutrophils after 24-hour hypo- thermic storage of white-cell-rich suspension. We ascertained all the studied indices of neutrophil pha- gocytic activity after hypothermic storage significantly (p < 0.05) decreased as compared to the indices of native cells, conforming to the results of other researchers. We observed the 1.7-fold increase in phagocytic number (PN) of neutrophils induced by 45-min incubation of leukocytes with CBF after hypothermic storage in comparison with the control. The index of phagocytosis completeness (IPC) of neutrophils after incubation with CBF at the optimal concen- tration was 1.8-fold risen. Actovegin also simulated engul- fing (PN) and digesting (IPC) capacities of phagocytes, but it was required at a much higher concentration. Studies of the effect of SBF and Actovegin on the number of phago- cyting neutrophils did not reveal statistically significant (p < 0.05) changes of this index. After hypothermic storage the number of NBT-positive neutrophils did not differ significantly (p < 0.05) from that of native cells. However, the number of NBT-positive neut- rophils after incubation of white-cell-rich suspension with CBF significantly (p < 0.05) exceeded the control value. Acto- vegin had no significant (p < 0.05) effect on this parameter. Thus the data obtained substantiate the prospect of introduction of the cord blood low-molecular fraction and Actovegin in rehabilitating media for leukocytes after hypo- thermic storage for the purpose of enhancing their functional activity. Сравнительное изучение терапевтического действия нативных и криоконсервированных пробиотиков, иммобилизованных на энтеросорбентах, при экспериментальном дисбиозе О.М. БАБИНЕЦ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Comparative Studying of Therapeutical Effect of Native and Cryopreserved Probiotics Immobilized on Enterosorbents During Experimental Dysbiosis O.M. BABINETS Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 221 В современной медицинской практике значительное внимание уделяют коррекции микробиоты при дисбио- зах с помощью пробиотиков, пребиотиков, синбиотиков и энтеросорбентов. Одним из осложнений дисбиоза ки- шечника является транслокация кишечной микрофлоры во внутренние органы. В этом случае дополнительно наз- начают антибиотикотерапию и антисептические меро- приятия. В ИПКиК НАН Украины проводятся исследования по созданию экспериментальных препаратов пробио- тиков, иммобилизованных на энтеросорбентах. Эффек- тивным методом их долгосрочного хранения является криоконсервирование. Целью исследования являлось сравнительное изуче- ние восстановления кишечной микрофлоры и эрадика- ции внутренних органов у животных с эксперименталь- ным дисбиозом, осложненным транслокацией кишеч- ной микрофлоры, после курса терапии нативными и крио- консервированными иммобилизованными пробиоти- ками (ИП). Эксперименты проводили на белых лабораторных крысах. Дисбиоз кишечника воспроизводили перораль- ным введением 15 мг ампициллина и 10 мг метрони- дазола. В качестве ИП использовали Saccharomyces bou- lardii и Bifidobacterium bifidum, иммобилизованные на энтеросорбентах Сорбекс и СУМС-1. Криоконсерви- ровали ИП через 30 мин после начала адсорбции. В группах сравнения вводили свободные пробиотики, энте- росорбенты и смеси энтеросорбентов и пробиотиков. Установлено, что пристеночная микрофлора толсто- го кишечника наиболее быстро и в полном объеме вос- станавливается после приема ИП. Достоверные разли- чия в терапевтическом эффекте нативных и криоконсер- вированных ИП не установлены. Положительным мо- ментом являлось то, что S. boulardii, который является транзиторным микроорганизмом ЖКТ, после приема ИП выделяли из кишечника животных в течение 7−10 суток, а в группах сравнения – в течение 2−5 суток. Эрадикация кишечной микрофлоры из печени, селе- зенки и мезентериальных лимфоузлов наиболее быстро происходила в группах животных, принимавших натив- ные, криоконсервированные ИП и смеси пробиотиков и энтеросорбентов. Current medical practice pays a considerable attention to the correction of microbiota during dysbiosis by means of probiotics, prebiotics, sinbiotics and enterosorbents. One of the bowel dysbiosis complications is the translocation of intestine organisms into the internals. In this case anti- biotic therapy and antiseptic measures are prescribed. At the IPC&C of the NAS of Ukraine there have been carried-out the investigations for developing of experimental probiotic preparations immobilized on enterosorbents. Cryo- preservation is an effective method of their long-term sto- rage. The research aim was a comparative studying of intes- tine organism restoration and internal eradication in animals with experimental dysbiosis complicated by translocation of bowel microflora after therapy with native and cryopre- served immobilized probiotics (IP). The experiments were carried-out in white laboratory rats. Bowel dysbiosis was simulated by peroral injection of 15 mg Ampicillin and 10 mg Metronidazol. Saccharomyces boulardii and Bifidobacterium bifidum immobilized on Sorbex and SUMS-1 enterosorbents were used as IPs. IPs were cryopreserved 30 min later the adsorption. Free pro- biotics, enterosorbents and mixtures of enterosorbents and probiotics were injected in the reference groups. The most rapid and complete restoration of large intes- tine parietal microflora has been established after IP re- ceiving. No significant differences in therapeutic effect of native and cryopreserved IPs were found. The positive mo- ment was the fact that S. boulardii, the transitory micro- organism of gastrointestinal tract, was found in animal bowel after IP introduction within 7–10 days and in the reference groups it was found within 2–5 days. Eradication of intestinal microflora from liver, spleen and mesenteric lymph nodes occurred most rapidly in the groups of animals received native, cryopreserved IPs and mixtures of probiotics and enterosorbents. Экстракт печени оказывает угнетающее действие на нервные клетки новорожденных крыс, культивируемые in vitro М.В. ШЕВчЕНКО Харьковский национальный педагогический университет им. Г.С. Сковороды Liver Extract Affects Suppressively In Vitro Cultured Nerve Cells of Newborn Rats M.V. SHEVCHENKO G.S. Skovoroda Kharkov National Pedagogical University, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 222 Изучение действия экстрактов, полученных из раз- личных тканей, на изолированные клетки, с одной сто- роны, позволяет исследовать in vitro влияние различного микроокружения на трансплантированные клетки, а с другой – изучать специфичность действия на различные клетки факторов, продуцируемых в различных тканях. Поэтому целью работы явилось изучение особенностей действия экстрактов тканей мозга и печени на нервные клетки новорожденных крыс in vitro. Экстракты мозга (ЭМ) и печени (ЭП) получали гомо- генизацией тканей мозга и печени новорожденных крыс с последующим их центрифугированием. Нервные клетки (НК) получали из мозга новорож- денных крыс, отмывали и культивировали в концент- рации 2×106 клеток/мл в среде DMEM/F12, обогащенной 10% сыворотки крыс. Экстракты добавляли в концент- рациях 0,3 мг белка/мл среды. В процессе культивирования как в присутствии, так и без ЭМ и ЭП большинство НК образуют агрегаты, ко- торые отличаются по размеру, структуре и форме. В про- цессе культивирования изменяются структура и форма агрегатов. Упаковка клеток в некоторых агрегатах стано- вится плотнее, что приводит к превращению агрегатов в сфероиды, поведение которых в процессе культивиро- вания сходно с поведением нейросфер. Они могут расти, а после прикрепления к подложке составляющие их клет- ки мигрируют и дифференцируются в нейроны и клетки глии. Часть агрегатов сливается. Клетки, сформировав- шие мелкие рыхлые агрегаты, в процессе культивиро- вания погибают. В процессе культивирования наблюдает- ся увеличение жизнеспособности НК, сформировавших агрегаты, более чем в 2 раза уже через 1 сутки после культивирования. Культивирование НК в присутствии ЭМ не оказывает достоверного влияния на образование агрегатов и их структурные изменения по сравнению с контрольными клетками. Присутствие в среде культивирования ЭП ока- зывает ингибирующее действие на агрегацию НК. Агре- гатов образуется меньше, структурно они мелкие и рых- лые, уплотнение клеток агрегатов и их слияние в процессе культивирования наблюдаются позже по сравнению с контролем и ЭМ. Также отмечается замедление скорости прикрепления агрегатов к подложке. Экстракт мозга оказывает стимулирующее, а экстракт печени угнетающее влияние на формирование монослоя клетками глии и образование нейробластов и колоний стволовых/прогениторных клеток. Таким образом, можно заключить, что регуляторные факторы в ЭМ активируют, а в ЭП – угнетают адгезию клеток, глиогенез, нейрогенез и пролиферацию стволо- вых/прогениторных клеток. The studying of effect of the extracts, derived from different tissues, on isolated cells on the one hand enables to investigate in vitro the effect of various microenviro- nment on transplanted cells, and on the other hand to examine the effect specificity on different cells of the factors, produced in various tissues. Therefore the research aim was to study peculiarities of brain and liver extracts effect on behavior of newborn rat nerve cells in vitro. Brain (BE) and liver (LE) extracts were derived by homo- genization of newborn rat brain and liver tissues with their further centrifugation. Nerve cells (NCs) were derived from newborn rat brain, washed and cultured in concentration of 2×106 cells/ml in DMEM/F12 enriched with 10% rat blood serum. The extracts were added in concentration of 0.3 mg protein/ml of medium. During culturing both in absence and presence of BE and LE most of NCs form aggregates differing in size, structure and shape. During culturing the structure and aggregate shape are changed. Cell packing in some aggregates beco- mes more compact, that results in the transformation of aggregates to spheroids, which act like neurospheres during culturing. They can grow and after attachment to a substrate the cells comprising them migrate and differentiate into neurons and glial cells. A part of aggregates merges. The cells, forming small spongy aggregates, die during culturing. During culturing the viability of NCs, forming aggregates, increases more then twice already after the 1st day of culturing. NC culturing in presence of BE does not significantly affect the aggregate formation and their structural changes if compared with the control cells. The presence of LE in culturing medium has an inhibiting effect on NC aggre- gation. The number of formed aggregates is lower, they are structurally small and spongy, during culturing the packing of cell aggregates and their mergence are observed later if compared with the control and cultures with BE. In addition the reduction of rate of aggregate attachment to substrate is observed. Brain extract has stimulating effect and liver extract has suppressing effect on formation of glial cell monolayer and the of neuroblasts and colonies of stem/progenitor cells. Thus, we may conclude that regulatory factors of BE activate, and LE factors suppress cell adhesion, glyoge- nesis, neurogenesis and proliferation of stem/progenitor cells. Влияние криоконсервированных фетальных нервных клеток на стромальные и цитокин-продуцирующие клетки тимуса при развитии экспериментального аллергического энцефаломиелита Е.А. ПОРОЖАН, М.В. ОСТАНКОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Influence of Cryopreserved Fetal Nerve Cells on Stromal and Cytokine-Producing Thymus Cells during Development of Experimental Allergic Encephalomyelitis YE.A. POROZHAN, M.V. OSTANKOV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 223 Важным звеном кооперации и координации деятель- ности нервной, эндокринной и иммунной систем явля- ется тимус. Это не только центральный орган имму- нитета, но и центр регуляции гормонального профиля орга- низма независимо от того, участвует ли он непосредствен- но в образовании этих гормонов или только контролирует реализацию их активности. В реализации этих механизмов активное участие принимает эпителиальная строма ти- муса, продуцирующая различные гуморальные факто- ры, IFN-γ, IL-10, ТGF-β и др. Гормоны тимуса в этих слож- ных каскадных взаимодействиях выступают также в роли посредников взаимодействия тимуса и структур нервной системы, функционирование которых нарушается при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЭАЭ). Поэтому для лечения целесообразно использо- вать модуляторы надсистемного воздействия, комплекс- но влияющие на механизмы иммунного ответа, напри- мер фетальные нервные клетки (ФНК). Цель исследования − изучить стромальные и цитокин- продуцирующие клетки тимуса в динамике развития ЭАЭ после применения криоконсервированных по раз- ным режимам ФНК (кФНК). Эксперименты на крысах проведены в соответствии с правилами “Европейской Конвенции о защите позво- ночных животных, используемых для эксперименталь- ных и других научных целей” (Страсбург, 1986 г.). ЭАЭ индуцировали у крыс по методу Давыдовой (1976 г.). Суспензию ФНК из мозга эмбрионов крыс 11 суток гес- тации криоконсервировали по двум режимам (Р1 и Р2). Суспензию кФНК крыс вводили внутрибрюшинно на 14-е сутки развития ЭАЭ. Методом проточной цитофлуори- метрии (FACS Calibur, BD, США) на 7–35-е сутки развития патологии определяли DC+-, Ia+-, IFN-γ+ –, IL-10+ – клетки с использованием соответствующих МАТ (ВD). Методом ELISA определяли уровень тимозина β4 (Abcam) и TGF-β (ВD). Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Полученные данные продемонстрировали волно- образное изменение изучаемых показателей в тимусе при развитии ЭАЭ. Введенные кФНК обеспечивали кор- рекцию клеток соединительнотканной стромы тимуса. Содержание Ia+- и DC+-клеток коррелировало с концент- рацией IL-10+ – клеток и к 35-м суткам развития патологии снижалось. Результаты показали, что кФНК достоверно повышали содержание IFN-γ+ – клеток, концентрацию ТGF-β и тимозина β4 в тимусе крыс с ЭАЭ. Более выра- женное корригирующее влияние оказывали кФНК (Р2), о чем свидетельствовала суммарная степень отклоне- ний. Таким образом, продемонстрирована способность кФНК воздействовать на стромальные элементы тимуса (DC+-, Ia+-клетки) животных с ЭАЭ, нормализуя содер- жание IFN-γ+ –, IL-10+ – клеток, а также концентрацию ТGF-β и тимозина β4. Thymus is an important link for the cooperation and coordination of nervous, endocrine and immune systems activity. It is not just a central organ of immunity but a cen- ter of body hormonal profile regulation as well regardless of the fact if it is directly involved in the production of the- se hormones or only controls the implementation of their activity. Thymus epithelial stroma actively participates in the implementation of these mechanisms by producing various humoral factors, IFN-γ, IL-10, ТGF-β etc. In these complex cascade interactions thymus hormones also act as mediators of interactions between thymus and structures of nervous system which functions are impaired during experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Therefore for the treatment one should use modulators with suprasystem effect which have complex influence on the immune respon- se mechanisms, for example, fetal nerve cells (FNC). The research aim was to investigate stromal and cyto- kine-producing thymus cells during EAE development after administration of FNC cryopreserved according different regimens (cFNC). The experiments in rats have been performed according to the regulations of European Convention on the Protec- tion of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). EAE was induced in rats by Davydova’s method (1976). FNC suspension ob- tained from the brain of rat embryos of 11 gestation days was cryopreserved according two regimens (R1 and R2). Rat cFNC suspension was injected intraperitoneally to the day 14 of EAE development. DC+, Ia+, IFN-γ+, IL-10+ cells were examined by flow cytometry method (FACS Calibur, BD, USA) to the days 7–35 using appropriate monoclonal antibodies (BD). Levels of thymosine β4 (Abcam) and TGF-β (ВD) were determined by ELISA method. Statistical processing of the results was performed with Mann-Whitney criterion. The obtained data demonstrated a wave-like change of the studied parameters in the thymus during EAE deve- lopment. Injected cFNC provided the correction of the thy- mus connective tissue stromal cells. The level of Ia+ and DC+ cells decreased to the day 35, that correlated with the concentration of IL-10+ cells. The results showed that cFNC significantly increased the number of IFN-γ+ cells, concen- tration of ТGF-β and thymosine β4 in the thymus of rats with EAE. More pronounced correction influence was rendered by cFNC (R2) which was indicated by cumulative degree of deviations. Consequently, we demonstrated an ability of cFNC to influence thymus stromal elements (DC+ and Ia+ cells) of EAE animals normalizing the level of IFN-γ+, IL-10+ cells as well as ТGF-β and thymosine β4 concentrations. Клинико-экспериментальная оценка эффективности криоконсервированной сыворотки кордовой крови в прегравидарной подготовке при антифосфолипидном синдроме В.Ю. ПРОКОПЮК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков ГП «МНЦ криобиологии и криомедицины НАН, АМН, МОЗ Украины», г. Харьков Clinical and Experimental Estimation of Efficiency of Cryopreserved Cord Blood Serum in Pregnancy Preparing at Anti-Phospholipid Syndrome V.YU. PROKOPYUK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Interdepartmental Centre of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences, Academy of Medical Sciences, Ministry of Health Care of Ukraine Акушерский антифосфолипидный синдром (АФС) – патология, начинающаяся с взаимодействия антифосфо- липидных антител с эндометрием, эмбрионом, приводит к микротромбозам в спиральных артериях и таким ослож- нениям беременности, как невынашивание, плацентар- ная недостаточность, синдром задержки развития плода. Лечение АФС, как правило, начинается уже в разгаре са- мого заболевания. Целью работы была экспериментальная и клиничес- кая оценка эффективности прегравидарной подготовки и лечения АФС с использованием криоконсервирован- ного препарата сыворотки кордовой крови “Криоцелл- Криокорд” и традиционного лечения аспирином и гепа- рином. Антифосфолипидный синдром моделировали введе- нием кардиолипинового антигена самкам мышей линии BALB/c в общей дозе 120 мкг на 1 животное. Сравнивали эффективность прегравидарной подготовки с традицион- ным лечением и применением комплекса из двух мето- дов. Оценивали репродуктивные показатели, состояние плацент. Проводили прегравидарную подготовку с ис- пользованием “Криоцелл-Криокорда” женщинам с АФС, планирующим беременность и имеющим репродуктив- ные потери, по 1,8 мл в/м 1 раз в 2 дня (№5). Наблюдали течение беременности, родов, состояние новорожденных по утверждённым протоколам. Показано, что применение как прегравидарной под- готовки, так и традиционной терапии у животных со- кращает количество грубых изменений в плаценте и исключает мёртворождения (прерывание беременности в поздние сроки), сокращает количество резорбций (результат прерывания беременности в ранние сроки) с 75 до 20−30%. В то же время применение прегравидарной подготовки совместно с лечением во время беременности позволяет избежать репродуктивных потерь. Исполь- зование прегравидарной подготовки с применением “Криоцелл-Криокорда” у женщин с АФС позволяет улучшить кровоснабжение и предымплантационную готовность эндометрия, снизить количество осложнений беременности с 72 до 45%. Прогностическим критерием при АФС могут являться индексы резистентности в маточных сосудах ниже 0,9, артериях пуповины ниже 0,7, снижение титров антифосфолипидных антител в 1,5−2 раза, нормализация показателей коагулограммы. Прегравидарная подготовка женщин, страдающих АФС, с помощью препарата “Криоцелл-Криокорд” улучшает течение и результат беременности. Obstetric anti-phospholipid syndrome (APS) is the pathology, beginning with the interaction of antiphospho- lipid antibodies with endometrium and embryo, leads to microthromboses in spiral arteries and such complications of pregnancy as miscarriage, placental insufficiency, fetal growth retardation syndrome. APS treatment as a rule starts just in the height of disease. The research aim was to experimentally and clinically estimate the efficiency of pregnancy preparing and treat- ment of APS using cryopreserved preparation of cord blood serum “Cryocell-Cryocord” as well as traditional treatment by Aspirin and Heparin . Anti-phospholipid syndrome was modelled by intro- duction of cardiolipin antigen to female BALB/c mice in total dose of 120 мg per one animal. The efficiencies of pre- paring to pregnancy with traditional treatment and appli- cation of the combination of two methods were compared. There were assessed reproductive indices, state of placen- tas. There was performed the preparing to pregnancy using “Cryocell-Cryocord” to women with APS planning the preg- nancy and having reproductive losses by 1.8 ml intramus- cularly once during 2 days (totally 5 doses). There was observed the course of pregnancy, labours, state of new- borns according to the approved protocols. It has been shown that both application of preparing to pregnancy and traditional therapy in animals reduce the number of rough changes in placenta and exclude the dead birth (termination of pregnancy at late terms), decrease the number of resorptions (result of pregnancy termination at early terms) from 75% to 20–30%. At the same time the ap- plication of preparing to pregnancy together with the treat- ment during pregnancy allows the avoiding of reproductive losses. The use of preparing to pregnancy jointly with “Cryocell-Cryocord” in the women with APS allows the improvement of blood supply and preimplantation readiness of endometrium, the reduction of the number of pregnancy complications from 72 to 45%. Prognostic criteria at APS may be the indices of resistance in uterine vessels (below 0.9), arteries of umbilical cord (below 0.7), reduction of the titres of antiphospholipid antibodies in 1.5–2 times, norma- lization of indices of coagulograms. Preparing to pregnancy of the women suffering from APS with the help of preparation “Cryocell-Cryocord” improves the pregnancy course and result. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 224 Значение стадии гистогенеза неонатальной овариальной ткани для ее развития в условиях гетеротопической трансплантации Ю.О. ТИЩЕНКО, В.В. КИРОШКА, Т.П. БОНДАРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Importance of Histogenesis Stage of Neonatal Ovarian Tissue for Its Development under Conditions of Heterotopic Transplantation YU.O. TISCHENKO, V.V. KIROSHKA, T.P. BONDARENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine В настоящее время предполагается, что одной из стра- тегий сохранения репродуктивной функции женщин при патологиях яичников различного генеза может быть транс- плантация фетальной овариальной ткани, содержащей максимальный пул половых клеток. Ранее получены проти- воречивые данные о возможности развития фетальной ова- риальной ткани в организме половозрелого реципиента в условиях гетеротопической трансплантации. В связи с этим целью данной работы было изучить зна- чение стадии гистогенеза неонатальной овариальной тка- ни для ее роста, развития и функционирования при гете- ротопической трансплантации. Для достижения постав- ленной цели проводили аллотрансплантацию яичников 1-, 3- или 10-го дня постнатального развития (группы 1, 2 и 3 соответственно) под капсулу левой почки оварио- эктомированным животным-реципиентам. На 30-, 60- и 100-е сутки осуществляли гистологический анализ транс- плантатов и измеряли концентрацию половых гормонов. Показано, что на 30-е сутки наблюдения морфология трансплантатов овариальной ткани была представлена фолликулами различной степени зрелости, желтыми те- лами, а также фолликулярными кистами во всех экспери- ментальных группах. При этом у животных 2- и 3-й групп количество фолликулов на единицу объема транс- плантата (1 мм3) было в 4-6 раз больше по сравнению с таковым в 1-й группе. При увеличении сроков наблюде- ния у животных 1-й группы отмечалось склерозиро- вание ткани трансплантата, тогда как в других экспери- ментальных группах были выявлены значительные участки ткани, морфологически соответствующие поло- возрелым яичникам. Анализ уровня эстрадиола и про- гестерона показал достоверное их повышение во всех экспериментальных группах относительно кастрирован- ных животных на 30-е сутки. Восстановление концент- рации половых гормонов до физиологических значений наблюдалось только у животных 3-й группы к 60-м суткам наблюдения. Таким образом, можно сделать вывод, что развитие и эндокринная функция трансплантатов неонатальной ова- риальной ткани определяются стадией ее гистогенеза. Так, трансплантация яичников 1-х суток постнатального раз- вития приводит к ее атипичному развитию, при этом стероидогенная функция наблюдается только на ранних этапах наблюдения (30 суток). При трансплантации ова- риальной ткани 3- и 10-х суток постнатального развития происходят ее развитие до половозрелой стадии и досто- верное повышение уровня половых гормонов на длитель- ных этапах наблюдения. Nowadays there is the supposition that one of the stra- tegies to preserve reproductive function of women with ovarian pathologies of different genesis may be the trans- plantation of fetal ovarian tissue, containing maximum pool of sexual cells. Previously there were obtained contradictory findings on the possibility of the development of fetal ova- rian tissue in an organism of mature recipient under the conditions of heterotopic transplantation. In this connection the aim of this work was to study the importance of histogenesis stage of neonatal ovarian tissue for its growth, development and functioning at heterotopic transplantation. To achieve the set aim there were transplanted the ovaries of the 1st, 3rd or 10th day of post-natal development (group 1, 2, 3, correspondingly) under the capsule of left kidney to ovary-ectomized recipient animals. To the 30th, 60th and 100th days there were done histological analysis of the grafts and measurement of the sexual hormones con- centration. It has been shown that to the 30th observation day the morphology of ovarian tissue grafts was repre- sented by the follicles of different maturity extent, yellow bodies, as well as by follicular cysts in all the experimental groups. Herewith in the animals of the 2nd and 3rd groups the number of follicles per graft volume unit (1 mm3) was 4–6 times higher if compared with that in the 1st group. With the increase of observation terms in the animals of group 1 the- re was noted the graft tissue sclerozation. Meanwhile in other experimental groups there were revealed significant sites of the tissue, morphologically corresponding to mature ovaries. Analysis of estradiol and progesterone level has shown their statistically significant rise in all the experimental groups as for the castrated animals to the 30th day. The restoration of sexual hormone concentration up to physio- logical values was observed only in the animals of the third group to the 60th observation day. Thus we can conclude that the development and endo- crine function of the grafts of neonatal ovarian tissue are determined by the stage of its histogenesis. So, transplan- tation of the ovaries of the first day of postnatal develop- ment results in its atypical development, herewith the ste- roid function is observed only at early observation stages (30 days). During transplantation of ovarian tissue of the 3rd and 10th days of postnatal development it develops till mature stage and there is statistically significant rise of the level of sexual hormones at long-term observation stages. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 225 Экспериментальная модель лимбальной недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия для исследования действия криоконсервированных клеток крови Е.Н. СВИДКО, Ю.А. ДЕМИН Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Experimental Model of Limbal Inefficiency of Cornea Epithelia Regional Stem Cells for Investigation of Cryopreserved Blood Cell Influence YE.N. SVIDKO, YU.A. DEMIN Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Наиболее оправданной моделью лимбальной недос- таточности региональных стволовых клеток является мо- дель с использованием аппликации 0,04% ММС на область лимба. Однако известно, что ММС обладает цито- статическим действием на клетки роговицы и криокон- сервированные клетки крови. Поэтому для исследования необходимо знать время выведения препарата из рого- вицы животного, адаптировать данную модель для полу- чения наиболее достоверных результатов и предотвра- щения его цитостатического действия на вводимые пре- параты. Для разработки модели были взяты 3 кролика (6 глаз). По результатам измерения роговицы штангенциркулем были отобраны кролики с одинаковым диаметром рого- вицы, который составил 10 мм. Каждому животному бы- ла выполнена пахиметрия на ультразвуковом пахиметре Ocuscan фирмы Alcon. Затем смоделирована дистрофия роговицы. Для приготовления исходного испытуемого раствора использовали флакон препарата, содержащий 2 мг митомицина С. Содержимое флакона растворяли в 5 мл воды очищенной (концентрация митомицина С – 0,04%). Экспонирование на роговице глаза кружка фильтровальной бумаги проводили с различ-ными интервалами времени: 0,5; 1, 2, 3, 4 или 5 мин. Пос-ле экспонирования кружок помещали в виалку обьемом 20 мл и герметично закрывали резиновой пробкой. В каждую виалку одной пипеткой 1 класса добавляли 2 мл мети- лового спирта. Затем виалки помещали на 5 мин на УЗ баню. Количественное определение митомицина С в образцах проводили, используя жидкостную хромато- графию с диодноматричной детекцией. В качестве разде- ляющей колонки использовали колонку с октадецилси- лильной привитой фазой, имеющей 3-кратное эндкипи- рование. В качестве аналитической длины волны исполь- зовали максимум поглощения митомицина С при 360 нм, что обеспечило достаточно высокую селективность сиг- нала в сочетании с низким порогом обнаружения ве- щества в пробах. Элюирование пробы проводили, исполь- зуя градиентный режим для двух фаз – ацетонитрила и фосфатного буферного раствора (рН 3,0) с концентра- цией ион-парной добавки – гептансульфоната натрия – 0,01 М. Скорость диффузии (v) составила 19,98 мкг в ми- нуту. Таким образом, время выведения митомицина С составит 26,2 ч. Можно сделать вывод, что применение криоконсер- вированных клеток пуповинной крови оправдано при окончании данного периода времени. The most reasonable model of limbal insufficiency of regional stem cells is the model with the use of 0.04% MMC application to the limb area. However it is known that MMC cytostatically affects the cornea cells and cryopreserved blood cells. So for investigation it is necessary to know the time of removal of the preparation from animal cornea, to adapt this model for the obtaining of the most significant results and for prevention of its cytostatically influence on the injected preparations. To develop the model 3 rabbits (6 eyes) were used. According to the results of the cornea measurements with the caliper there were selected the rabbits with the same 10 mm diameter of cornea. Also each one underwent the pachy- metry with ultrasonic pachymeter Ocuscan (Alcon). Later the cornea dystrophy was simulated. For the preparation of an initial experimented solution the flask of preparation containing 2 mg of mitomycin C was used. The content of flask was dissolved in 5 ml of purified water (mitomycin C concentration was 0.04%). The exposure of filtrated paper circle was carried-out on the cornea within different time intervals, 30 sec, 1, 2, 3, 4 and 5 min. After the exposure the circle was placed into the 20 ml vial and closed hermetically with a rubber plug. 2 ml of methyl alcohol was added with the same pipette of the first class into each vial. Later the vials were placed into the ultrasonic bath for 5 min. The quan- titative determination of mitomycin C in the samples was carried-out by means of the liquid chromatography with the single diode-matrix detection. Octadecylsilic bonded phase having the 3-fold endotyping was used as the di- viding column. The maximal absorption of mitomycin C at 360 nm was used as the analytical wave length that provided quite a high signal selectivity with the low detection limit of the substance in the samples. The sample elution was performed with the gradient regimen for two phases, ace- tonitrile and phosphate buffer solution having pH 3.0 with the concentration of ion-pair addition of 0.01 M sodium heptanesulfonate. The diffusion speed (v) was 19.98 µg per min. Thus the removal time of mitomycin C was 26.2 hrs. It may be concluded that the application of umbilical blood cryopreserved cells is expedient at the end of the given time period. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 226 Влияние криоэкстракта липидов плаценты на структурно-функциональные изменения в региональных лимфоузлах крыс при адъювантном артрите М.А. КРАВчЕНКО, Н.А. БОНДАРОВИч, О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО, А.И. ОСЕЦКИЙ, А.Н. ГОЛЬЦЕВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Influence of Placental Lipid Cryoextract on Structure-Functional Changes in Regional Lymph Nodes of Rats with Adjuvant Arthritis M.A. KRAVCHENKO, N.A. BONDAROVICH, O.V. CHELOMBITKO, A.I. OSETSKY, A.N. GOLTSEV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Известный факт иммуномодулирующей активности субстанций липидной природы делает актуальным раз- работку технологий их получения из биологически актив- ного тканевого сырья, в частности ткани плаценты, ли- пидный состав которой обуславливает один из механиз- мов ее иммуносупрессивной активности. Использова- ние для этих целей криотехнологий, в частности методов криоэкстракции, позволяет минимизировать влияние ряда повреждающих факторов на биологический мате- риал, а также дифференцированно выделить липидную фракцию плаценты (ЛФП). В основе одного из механиз- мов реализации ее антиартритической активности может лежать способность липидных биомолекул выступать в роли эндогенных лигандов ядерных рецепторов Т-клеток и таким образом влиять на процессы периферической дифференцировки эффекторных CD4+CD25− − Т-клеток с образованием индуцированных CD4+CD25+ − Т-регуля- торных клеток (Т-рег). Таким образом, целью данной ра- боты было изучить содержание CD4+CD25+ − Т-клеток в региональных лимфатических узлах крыс с адъювант- ным артритом (АА) до и после введения ЛФП. Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Вистар. Адьювантный артрит индуцировали субплантар- ным введением полного адъюванта Фрейнда. Линейную фракцию плаценты получали методом криогенного мо- лекулярного фракционирования (КМФ) из тканей пла- центы свиньи и вводили с 14-х по 28-е сутки развития АА через день внутримышечно в дозе 100 мг/кг. На 7, 14, 21, 28, 35 и 42-е сутки развития АА проводилось опре- деление массы и общего количества клеток в подко- ленных лимфатических узлах, а также содержания среди них CD4+CD25+ − клеток (Т-рег) методом прямой имму- нофлюоресценции с использованием мАт (BD) к струк- турам CD4 (PE) и CD25 (FITC) на проточном цитофлю- ориметре (FACS Calibur, BD). Показано волнообразное изменение изученных по- казателей в динамике развития АА, при этом, если для массы и общего количества клеток максимальные изме- нения наблюдались в опытных подколенных лимфати- ческих узлах, то изменение содержания CD4+CD25+-кле- ток имело максимальную выраженность с контрлате- ральной стороны. В группе лечения, получавшей ЛФП, содержание CD4+CD25+-клеток и их концентрация в об- щей популяции CD4+-клеток в опытных лимфатических узлах приближались к контрольным показателям к 42-м суткам развития АА. Таким образом, показано, что ЛФП способна корри- гировать содержание Т-регуляторных клеток в регио- нальных лимфатических узлах при развитии АА, что мо- жет объяснить один из механизмов реализации ее анти- артритической активности. The known fact of immune modulating activity pos- sessed by substances of lipid origin makes it topical to de- velop the technologies for obtaining such substances from biologically active tissue raw material, particularly, placental tissues. Lipid composition of placenta determines one of the mechanisms of placental immunosuppressive activity. The use of cryotechnologies, particularly, the methods of cryo- extraction, allows to minimize the influence of the number of damaging factors on the biological material and isolate the placental lipid fraction (PLF). One of the mechanisms of its anti-arthritic activity can be based on the ability of lipid biomolecules to act as endogenous ligands for T-cell nuclear receptors and thereby to influence peripheral differentiation of effector CD4+CD25- T-cells with generation of inducible CD4+CD25+ T-regulatory (T-reg) cells. Thus the aim of this work was to study CD4+CD25+ T-cell content in regional lymph nodes of rats with adjuvant arthritis (AA) prior to and after administration of PLF. The experiments were performed in Wistar male rats. Adjuvant arthritis was induced by subplantar injection of complete Freund’s adjuvant. Placental lipid fraction was obtained with the use of cryogenic molecular fractionation (CMF) method from pig placental tissues and it was admi- nistered from the 14th to the 28th days of AA development each other day intramuscularly in the dose of 100 mg/kg. Mass and total amount of cells in popliteal lymph nodes were determi- ned to the 7th, 14th, 21st, 28th, 35th and the 42nd day of AA, as well as CD4+CD25+ (T-reg) content by direct immunofluo- rescence method with the use of mAb (BD) to CD4+ (PE) and CD25+ (FITC) structures with flow cytometer (FACS Calibur, BD). It has been shown that the change of the studied para- meters had an undulating pattern with maximum changes of mass and total cell amount in the popliteal lymph nodes of adjuvant treated paws while changes of CD4+CD25+ content were more pronounced in the contralateral lymph nodes. In the treatment group received PLF the CD4+CD25+ content and their concentration in the total CD4+ population in expe- rimental lymph nodes approached the control parameters to the 42nd day of AA. Thus, it was shown that PLF was capable to correct the content of T-reg cells in the regional lymph nodes during AA development and this fact can explain one of the mecha- nisms of its anti-arthritic activity. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 227 Сравнительная характеристика ишемического и крионекроза миокарда А.Г. БАБАЕВА, Н.А. ЧИЖ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Comparative Characteristics of Ischemic Necrosis and Myocardium Cryonecrosis A.G. BABAYEVA, N.A. CHIZH Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Изучение патогенетических механизмов инфаркта миокарда и создание на этой основе современных мето- дов лечения невозможны без адекватной эксперименталь- ной модели. Цель работы − сравнительный анализ некроза мио- карда, полученного путем перевязки левой коронарной артерии и методом локальной криодеструкции сердца. Работа проведена на 90 беспородных крысах массой 180–250 г. Ишемический некроз миокарда (НМ) модели- ровали путем механической перевязки левой коронарной артерии. Криовоздействие на стенку левого желудочка производили криоинструментом с диаметром апплика- тора 3 мм при температуре рабочей поверхности –195°С в течение 15 и 30 с. Электрокардиограммы (ЭКГ) регист- рировали и анализировали на аппаратно-программном комплексе “Полиспектр-12”. Прижизненную микроско- пическую картину сердца оценивали с помощью кон- тактного микроскопа ЛЮМАМ К-1. Гистологические исследования миокарда проведены на 1, 7, 14 и 30-е сутки. По данным ЭКГ исследования на 1-е сутки после пе- ревязки левой коронарной артерии и криовоздействия на сердце в течение 30 с выявили наличие Q зубца с эле- вацией сегмента ST в I и avL отведениях, что свидетельст- вует о формировании у животных переднебокового транс- мурального некроза миокарда. При 15-секундном крио- воздействии на сердце регистрировали Q зубец и отрица- тельный зубец Т в I и avL отведениях, что указывает на наличие субэпикардиального некроза в тех же топографи- ческих областях сердца. Область и степень деструктивно-воспалительных из- менений в миокарде при моделировании различными способами НМ подтверждались при исследовании гисто- логических препаратов. При этом формирование соеди- нительнотканного рубца после криодеструкции сердца происходило на 5–7 суток быстрее, чем после перевязки коронарной артерии. Впервые применена прижизненная микроскопия миокарда для оценки зоны некроза, состояния погранич- ных зон и участков сердца, удаленных от места повреж- дения. Перевязка левой коронарной артерии приводит к фор- мированию у животных переднебокового трансмураль- ного некроза миокарда. Криохирургический метод моде- лирования позволяет достаточно надежно прогнозиро- вать зону и степень повреждения сердечной мышцы при заданных параметрах криовоздействия с формирова- нием как субэпикардиального, так и трансмурального нек- роза миокарда. При криохирургическом методе модели- рования формирование зоны некроза и соединительно- тканного рубца происходит в более ранние сроки. The studying of pathogenetic mechanisms of myocardial infarction and development of current methods of treatment on the base of this studies are impossible without adequate experimental model. The research aim was a comparative analysis of myocar- dial necrosis, obtained by ligature of left coronary artery and cardiac local cryodestruction method. The work was carried-out in 90 breedless rats of 180– 250 g. Myocardial ischemic necrosis (MN) was modeled by mechanical ligature of left coronary artery. Cryoeffect on left ventricular wall was performed with cryoinstrument of 3 mm applicator diameter under operating surface tempera- ture −195°C for 15 and 30 sec. Electrocardiograms (ECG) were recorded and analyzed with hardware and software complex “Polispektr-12”. Vital microscopic cardiac pattern was estimated with contact microscope LYUMAM K-1. Histological examinations of myocardium were carried- out by the 1, 7, 14 and 30th days. According to the data of ECG by the 1st day after ligature of left coronary artery and cryoeffect on heart for 30 sec we revealed the presence of Q deflection with a rise of ST segment in I and avL leads testifying to the formation of anteriolateral transmural necrosis of myocardium in animals. Under 15th-second cryoeffect on heart Q deflection and negative T deflection in I and avL leads pointing to the presence of sub-epicardial nec-rosis in the same topographic cardial regions were recorded. Region and level of destructive-inflammatory changes in myocardium during MN modeling with different methods were verified by analysis of histological preparations. It was shown that the formation of connective tissue cicatrix after cardiac cryodestruction took place in 5–7 days more rapid than after ligature of coronary artery. In our study firstly was applied vital microscopy of myo- cardium to estimate necrosis zone, state of boundary zones and cardiac areas distant from injury. Ligature of left coronary artery results in the formation of anteriolateral transmural necrosis of myocardium in ani- mals. Cryosurgical modeling method enables quite reliable predicting of zone and injury rate of myocardium at certain parameters of cryoeffect with formation as sub-epicardial and transmural necrosis of myocardium. At cryosurgical modeling method the formation of necrosis zone and connective-tissue cicatrix takes place in earlier terms. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 228 Використання кріоконсервованого екстракту плаценти в комплексному лікуванні подагричного артриту у хворих з ожирінням А.А. КАПУСТЯНСЬКА, В.М. ЖДАН, В.І. ШЕПІТЬКО, А.Л. ЧЕЛІШВІЛІ Вищий державний навчальний заклад України «Українська медична стоматологічна академія», м. Полтава Application of Cryopreserved Placenta Extract in Combined Treatment of Gout Arthritis in Patients with Obesity A.A. KAPUSTYANSKA, V.M. ZHDAN, V.I. SHEPITKO, A.L. CHELISHVILI Ukrainian Medical Stomatological Academy, Poltava, Ukraine Успішний розвиток клітинних технологій в світі дає підстави розраховувати на появу в майбутньому нових ефективних методів для лікування різних захворювань [Рябинин В.Е., 2010]. Наші дослідження проводились на базі поліклінічного відділення Полтавської обласної клінічної лікарні та Полтавської філії ДП “МНЦ кріобіології і кріомедицини НАН, АМН та МОЗ України”. Під спостереженням знахо- дилось 107 чоловіків, хворих на подагричний артрит з ожирінням, віком від 32 до 73 років включно. Всі пацієнти були розподілені на дві групи. Першу групу склали 52 хворих на подагричний артрит з ожирінням, яким крім базисної терапії додатково вводили “Кріоцелл – Кріоекс- тракт плаценти” (ККЕП). Препарат ККЕП являє собою рідку фракцію з плаценти (об’єм 1,8 мл), виготовлений в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків). Препарат в асептичних умовах вво- дили внутрішньом’язово в дозі 1,8 мл 1 раз на добу, через день, тричі. До другої групи, яким проводили виключно базисну фармакотерапію, ввійшли 55 хворих на подаг- ричний артрит з ожирінням. Всім пацієнтам після тканин- ної і клітинної терапії рекомендовано дотримуватися дієти №6–8 за Певзнером. Для визначення ефективності лікування оцінювали клінічні дані та результати лабора- торних методів дослідження. Спостереження засвідчили, що комплексне лікування із застосуванням ККЕП має суттєві переваги в порівнянні з традиційним, а саме: серед хворих 1 групи позитивний клінічний ефект досягнуто у 97,2 % випадках, а серед хворих 2 групи, яким проводили стандартну терапію – у 94,8% випадках. Клінічне покращення у хворих на подаг- ричний артрит проявлялось зменшенням деформації та дефігурації суглобів, відновленням м’язової сили, змен- шенням болю в суглобах, що оцінювали за шкалою ВАШ. В результаті комплексного лікування із застосуванням ККЕП у 19,23% хворих відновлена нормальна маса тіла, а 80,77% хворих досягли її стабілізації. Разом із клінічним покращенням зафіксовано позитивну динаміку лабора- торних показників активності процесу. А саме, у хворих 1 групи вже після другого внутрішньом’язового введення препарату ККЕП спостерігалось більш стрімке зниження рівня сечової кислоти, порівняно з показниками у хворих 2 групи. Водночас із зниженням рівня сечової кислоти досягли коригування андрогенного дисбалансу шляхом нормалізації показника рівня тестостерону крові. Встановлено, що комплексне лікування загострення подагричного артриту у хворих з ожирінням при вико- ристанні препарату ККЕП достовірно призводить до коригування андрогенного дисбалансу шляхом норма- лізації рівня тестостерону крові, більш динамічного зменшення рівня сечової кислоти забезпечує значне поліпшення функціональної активності суглобів, досто- вірну стабілізацію маси з наступною її нормалізацією. Successful development of cell technologies in the world provides the conditions for appearance in future of new ef- fective methods to treat different diseases [Ryabinin V.E., 2010]. Our studies were performed at the base of Polyclinical Department of Poltava Regional Clinical Hospital and Pol- tava Branch of State Enterprise “Interdepartmental Scientific Center for Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences, Academy of Medical Sciences and Ministry of Health Care of Ukraine”. Under monitoring there were 107 men, suffered from gout arthritis with obesity, aged from 32 to 73 years inclusive. All the patients were divided into two groups. The first one comprised 52 patients with gout arthritis with obesity, who were additionally to basic therapy introduced with “Cryocell – Placental Cryoextract” (CPCE). The CPCE preparation is the liquid fraction from placenta of 1.8 ml volume, produced at the Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov. The preparation under aseptic conditions was intramuscularly injected in a dose of 1.8 ml once within 24 hrs, in a day, thrice. Another group with just traditional basic pharmacotherapy comprised 55 patients with gout arthritis and obesity. All the patients after tissue and cell therapy were recommended to keep the Pevzner diet N6–8. To examine the efficiency of treatment there were assessed clinical data and results of laboratory methods of investigation. The observations have shown that the combined treat- ment with CPCE has significant advantages if compared with traditional ones, namely among the patients of the 1st group a positive clinical effect was achieved in 97.2% cases, and in 94.8% among the patients of the group 2 with the standard therapy. Clinical improvement in the patients with gout arthritis was manifested in a reduced deformation and defiguration of joints, recovery of muscular strength, decreased pain in joints, assessed according to the VAS scale. As a re- sult of complex treatment using CPCE in 19.23% of patients there was recovered a normal body mass and 80.77% of pa- tients stabilized it. Together with clinical improvement there was fixed a positive dynamics of laboratory indices of the process activity. Namely, in the patients of the group 1 alrea- dy after the second intramuscular injection of CPCE prepara- tion there was observed more rapid decrease of the level of uric acid if compared with the indices for the patients of group 2. Simultaneously with the reduction of the level of uric acid we achieved the correction of androgenic misba- lance by means of normalization of testosterone level in blood. It has been established that complex treatment of aggra- vation of gout arthritis in the patients with obesity using CPCE preparation statistically and significantly leads to the correction of androgenic misbalance by normalizing the tes- tosterone level in blood, more dynamic reduction in the level of uric acid, provides a significant improvement of functional activity of joints, statistically significant stabi- lization of the mass with its following normalization. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 229 Пептидный состав кожи крыс при холодовой травме И.Г. БЕСПАЛОВА, Е.О. БОГАТЫРЕВА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Peptide Composition of Rat Skin During Cold Trauma I.G. BESPALOVA, E.O. BOGATYREVA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Регуляторные пептиды играют чрезвычайно важную роль в поддержании гомеостаза организма. Любое откло- нение от нормального функционирования ткани, органа или организма должно сопровождаться изменением мо- лекулярно-массового распределения пептидов как на мест- ном, так и на организменном уровне. Целью данной работы было изучение пептидного сос- тава сыворотки крови и кожи крыс при холодовой травме и влияния на него введения животным экстрактов крио- консервированных фрагментов органов. Эксперименты проведены в соответствии с “Общими принципами экспериментов на животных”, одобренны- ми III Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2007 г.) и согласованными с положениями “Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в экспериментальных и других научных целях” (Страсбург, 1986 г.). Экстракт селезенки свиней (ЭСС) и экстракт кожи поросят (ЭКП) получали из криоконсервированных фраг- ментов селезенки свиней и кожи поросят, а экстракты ко- жи крыс – из измельченных участков, прилегающих к зоне травмы, путем их инкубирования в физиологи- ческом растворе 60 мин. Полученный экстракт фильтровали и освобождали от термолабильных белков. В работе были использованы беспородные крысы массой 190−220 г. Холодовые травмы наносились на наруж- ную поверхность бедра медным аппликатором диамет- ром 10 мм, охлажденным в жидком азоте, время экспози- ции – 60 с. Экстракты вводили внутрибрюшинно по 1 мл один раз в сутки на протяжении всего эксперимента (кон- центрация пептидов 100 мкг/мл). Контрольным живот- ным вводили по 1 мл физиологического раствора. Для оп- ределения молекулярно-массового распределения пепти- дов использовали метод высокоэффективной гельпрони- кающей хроматографии. При изучении дозозависимого влияния вводимых жи- вотным ЭСС и ЭКП (доза пептидов 1000, 100, 10 и 0,1 мкг) на пептидный состав сыворотки крови и кожи крыс уста- новлено, что максимальные изменения в молекулярно- массовом распределении пептидов наблюдаются при введении животным пептидов в дозе 100 мкг. При изучении заживления холодовых ран кожи было установлено, что при введении ЭСС или ЭКП наблюда- ется увеличение скорости заживления ран и в более ран- ние сроки происходит нормализация пептидного состава экстрактов кожи по сравнению с контролем. Regulatory peptides play an overwhelmingly important role in maintenance of organism homeostasis. Any deviation from normal function of tissue, organ or organism must be accompanied by the change of molecular-mass distribution of peptides as at the local and organism levels. The aim of this work was the investigation of peptide content of blood serum and rat skin after cold trauma and its dependence on injection into the animals of extracts of frozen-thawed organ fragments. The experiments have been carried-out according to the General Principles of Experiments in Animals approved by the 3rd National Congress on Bioethics (Kiev, 2007) and agreed with the regulations of European Convention on the Protection of Vertebrates Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). Pig spleen (PSE) and piglet skin (PlSE) extracts were obtained from frozen-thawed pig spleen fragments and piglet skin by their incubation in physiological solution for 60 min, as well as rat skin extracts from fragments of the areas, adjoining the trauma zone. The derived extracts were filtrated and cleared from thermolabile proteins. Breedless rats of 190–220g were used in the work. Cold traumas were applied to outer surface of thigh with copper applicator of 10 mm diameter cooled in liquid nitrogen, expo- sure time was 60 sec. The extracts were intraperitoneally in- jected with 1 ml once a day during the whole experiment (peptide concentration 100 мg/ml). Physiological solution (1 ml) was injected into the control animals. For determina- tion of molecular-mass peptide distribution there was used the highly effective gel-penetrating chromatography. During the studying of dose-dependent influence of injected PSE and PlSE in animals (peptide dose was 1,000, 100, 10 and 0.1 мg) on peptide content of blood serum and rat skin it was established that maximal changes in mole- cular-mass peptide distribution were observed after the in- jection of peptides in animals in dose of 100 мg. The investigation of cold skin trauma regenerative pro- cess showed that injection of PSE and PlSE resulted in the increase of regenerative process rate and more rapid nor- malization of skin extract peptide content comparing to the control. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 230 Механизмы формирования противовирусной резистентности после введения препарата “Криоцелл-Гемокорд” О.Ю. КОЖИНА, Е.С. ОНАСЕНКО, Н.А. БОНДАРОВИч, А.Н. ГОЛЬЦЕВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Formation Mechanisms of Antiviral Resistance after Injection of Preparation “Cryocell-Hemocord” O.YU. KOZHYNA, YE.S. ONASENKO, N.A. BONDAROVICH, A.N. GOLTSEV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Из всех известных вирусов, вызывающих инфек- ционные заболевания верхних дыхательных путей, са- мым распространенным является вирус гриппа. На базе ИПКиК НАН Украины был разработан препарат ”Крио- целл-Гемокорд”, представляющий собой криоконсерви- рованную суспензию ядросодержащих клеток кордовой крови человека в аутологичной плазме. В предвари- тельных исследованиях была обнаружена противовирус- ная активность препарата по отношению к вирусу гриппа в экспериментах in vitro и in vivo. Однако механизмы реализации такого рода активности препарата остаются до конца не выясненными. Целью данной работы было изучение функцио- нальной активности клеток моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС) на экспериментальной модели вирус- ной инфекции (гриппа) у мышей после превентивного введения препарата “Криоцелл-Гемокорд”. В эксперименте были использованы мыши линии Balb/C массой 18−20 г. Животных разделили на 3 группы (n = 10): 1 – мыши, которым препарат “Криоцелл-Гемо- корд” вводили за 6 месяцев до инфицирования вирусом гриппа штамма А/Виктория в LD100/10; 2 − мыши, кото- рым за 6 месяцев до инфицирования вирусом гриппа пре- вентивно вводили физиологический раствор (контроль); 3 − интактные мыши, которым за 6 месяцев вводили пре- парат “Криоцелл-Гемокорд” без последующего инфици- рования. Штамм вируса гриппа А/Виктория (H3N2) имел гемагглютинирующий титр 1:512, инфекционный титр – 104 LD50/10. Препарат “Криоцелл-Гемокорд” вводили инт- раназально по 0,05 мл/мышь (6 ± 2×105клеток). У мышей всех опытных групп оценивали состояние клеток МФС пе- ритонеальной полости (ПП) на 2 и 7-е сутки. Превентивное введение препарата “Криоцелл-Гемо- корд” интактным животным не влияло на активность мо- ноцитов и несколько повышало активность макрофагов. В контрольной группе отмечалась 100% гибель живот- ных к 10 суткам. При этом оценка функционального сос- тояния клеток МФС со 2 до 7 суток выявила угнетение активности моноцитов ПП и незначительное её повышение у макрофагов. После заражения вирусом гриппа живот- ных, которым предварительно был введен “Криоцелл-Гемо- корд”, отмечалось повышение функциональной актив- ности моноцитов со 2 по 7 сутки после инфицирования, а показатели активности макрофагов мышей повыша- лись ко 2 суткам после заражения вирусом гриппа и возв- ращались к исходным величинам к 7 суткам. Таким образом, при развитии вирусной инфекции в организме мышей на фоне предварительного введения препарата “Криоцелл-Гемокорд” наблюдалась стимуля- ция фагоцитарной активности популяции клеток, отвечаю- щей за развитие неспецифического иммунного ответа. The most wide-spread of all known viruses caused infec- tive diseases of upper respiratory tracts is the virus of in- fluenza. At the IPC&C of the NAS of Ukraine there was developed the preparation “Cryocell-Hemocord”, the cryo- preserved suspension of human cord blood nucleated cells in autologous plasma. In previous investigations there was found the preparation antiviral activity against the virus of influenza in the experiments in vitro and in vivo. However, the mechanisms of such activity preparation remain unclear. Research aim was to study the functional cell activity of monocyte-phagocyte system (MPS) in experimental model of mice viral infection (influenza) after preventive injection of preparation “Cryocell-Hemocord”. Balb/C mice of 18–20 g mass were used in the experiment. The animals were divided into 3 groups (n = 10): 1 – mice injected with the preparation “Cryocell-Hemocord” 6 months prior to infection by influenza A/Victoria virus strain in LD100/10; 2 – mice injected with the physiological solution 6 months before infection by influenza virus (the control); 3 – intact mice injected with the preparation “Cryocell-Hemocord” 6 months before examination without following infection. Influenza A/Victoria (H3N2) virus strain had hemagglutinating titre 1:512, infective titre was 104 LD 50/10. The preparation “Cryocell-Hemocord” was intranasally introduced per 0.05 ml/mouse (6 ± 2×105 cells). The state of MPS cells of peritoneal cavity (PC) in all the experimental mice were evaluated in the 2nd and 7th days. Preventive injection of the preparation “Cryocell-Hemo- cord” into intact animals did not affect the monocyte activity and slightly increased the macrophage activity. Animal death of 100% was noted in the control group to the 10th day. Moreover, the evaluation of MPS cell functional state from 2 up to 7 days revealed the suppression of PC monocyte activity and the insignificant increase of macrophages. The animals previously injected with “Cryocell-Hemocord” were later infected by the influenza virus and there was noted the rise of monocyte functional activity from 2 up to 7 days after infection and the indices of mice macrophage activity increased to the 2nd day after infection by influenza virus and returned to the initial indices to the 7th day. Consequently, the development of viral infection in mice organism after the preliminary injection of the preparation “Cryocell-Hemocord” was accompanied by the stimulation of cell population phagocytic activity responsible for the development of non-specific immune response. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 231 Восстановление дегенеративно измененной хрящевой ткани межпозвонковых дисков после неинъекционного введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток М.С. ЮХТА, Н.А. ВОЛКОВА, Е.И. ГОНчАРУК, В.И. ГРИЩЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Renewal of Degeneratively Changed Intervertebral Disc Cartilage after Non-Injectional Introduction of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells M.S. IUKHTA, N.A. VOLKOVA, YE.I. GONCHARUK, V.I. GRISCHENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Цель исследования – оценка терапевтического потен- циала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) при дегенеративно-дистрофическом пов- реждении хрящевой ткани межпозвонковых дисков (МПД). Исследование проведено на взрослых крысах-самцах массой 350–400 г, у которых моделировалось компрес- сионное дегенеративно-дистрофическое повреждение СсVI-VII. На 60-е сутки животным экспериментальной груп- пы (n = 14) в зону дефекта вводили 0,5×106 МСК на коллагеновой губке, которую укладывали на поврежден- ный МПД в сформированное из мягких тканей хвоста ложе. Контрольным животным (n = 14) таким же образом вводился физиологический раствор NaCl. Из опыта жи- вотных выводили на 30 и 60-е сутки после терапии. Оцен- ку эффективности введения МСК проводили с помощью спиральной компьютерной томографии (КТ) и гистоло- гических методов исследования. Работа проведена в со- ответствии с “Общими принципами экспериментов на животных”, одобренными III Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2007 г.). По данным КТ на 30-е сутки после введения МСК четко определялось увеличение высоты СсVI-VII по сравне- нию с контролем (0,7 ± 0,03 и 0,5 ± 0,04 мм соответствен- но). На 60-е сутки высота МПД достигала нормальных размеров, характерных для животных данной возрастной группы (1,0 ± 0,06 мм). В то же время значение данного показателя в группе контроля составило лишь 0,7 ± 0,03 мм. Анализ гистологических препаратов показал, что после введения МСК происходит постепенное вос- становление структуры МПД. На 30-е сутки увеличи- вается клеточность фиброзного кольца (ФК), при этом фибробластоподобные клетки располагаются как вдоль, так и внутри пучков коллагеновых волокон. На 60-е сутки исчезают разволокнения коллагеновых волокон ФК, трещины и щели в нем. При этом у контрольных живот- ных признаки дегенеративно-дистрофических измене- ний МПД сохраняются на всех сроках наблюдения. Проведенные морфометрические исследования также показали достоверное увеличение высоты МПД: у экспериментальной группы животных на 30-е сутки этот показатель составил 0,7 ± 0,034 мм, на 60-е сутки – 1,0 ± 0,051 мм, в то время как в контроле – 0,57 ± 0,029 и 0,6 ± 0,032 мм соответственно. Таким образом, полученные данные компьютерно- томографических, гистологических и морфометрических исследований указывают на достоверно положительный эффект применения суспензии МСК при дегенеративно- дистрофических повреждениях МПД, что проявляется не только в увеличении высоты диска, но и в восстановлении его структуры. The research aim was to evaluate multipotent mesenchy- mal stromal cell (MSCs) therapeutic potential under the conditions of degenerative and dystrophic cartilage damage of intervertebral discs (IVDs). The study was carried-out in adult male rats of 350– 400 g weight, in which the compressive degenerative-dys- trophic damage of CcVI-VII was modelled. To the 60th day the animals of experimental group (n = 14) were treated with 0.5×106 MSCs on a collagen sponge which was placed over the damaged IVD into the bed formed from tail soft tissues. The animals of control group (n = 14) were treated with NaCl physiological solution in the same manner. The animals were sacrified to the 30th and 60th day after therapy. The efficiency of MSC introduction was estimated with spiral computer tomography (CT) and histological methods. The research was performed according to the General principles of experiments in animals approved by the 3rd National Congress on Bioethics (Kiev, 2007). Analysis of the CT data revealed to the 30th day after MSC introduction an increase of CcVI-VII compared with the control (0.7 ± 0.03 and 0.5 ± 0.04 mm, respectively). To the 60th day the IVD height reached a normal value, typical for animals of this age group (1.0 ± 0.06 mm). At the same time, this parameter in the control group was only 0.7 ± 0.03 mm. Histological analysis showed gradual renewal of the IVD structure after MSC injection. To the 30th day we found an increased number of cells in the fibrous ring (FR), while fibroblast-like cells were located both along and inside of the collagen fiber bundles. To the 60th day the collagen fiber dissociation in FR were dissapeared, as well as fissures and cracks. At the same time the degenerative-dystrophic changes in IVDs in the control animals were preserved in all observation terms. The performed morphometric studies also showed significant increase in the IVD height: in the experimental group of animals this parameter to the 30th day was 0.7 ± 0.034 mm, to the 60th day it was 1.0±0.051 mm, while in the control group it reached 0.57 ± 0.029 mm and 0.6 ± 0.032 mm, respectively. Thus, the data of computer tomography, histological and morphometric studies point to the statisically significant positive effect of MSC application under the conditions of degenerative-dystrophic cartilage damages of IVDs, that is manifested both in an increasing of disc height, and in renewal of its structure. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 232 Трансплантация криоконсервированных клеток фетальной печени, заселенных в макропористые губки, крысам с печеночной недостаточностью Д.В. ГРИЦАЙ, А.О. КОЗЛОВА, А.С. ЛЕБЕДИНСКИЙ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Transplantation of Cryopreserved Fetal Liver Cells Immobilized in Macroporous Sponge in Rats with Liver Failure D.V. GRITSAY, A.O. KOZLOVA, A.S. LEBEDINSKY Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Целью исследования явилось изучение эффективнос- ти трансплантации клеток фетальной печени (КФП), им- мобилизированных в макропористых альгинатных губ- ках (МПГ), крысам с печеночной недостаточностью, фор- мирующейся проведением частичной гепатэктомии (ЧГЭ) в условиях ингибирования пролиферации гепатоцитов 2-ацетиламинофлуореном (ААФ). Модель формировали на крысах-самцах путем инт- рагастрального введения ААФ (30 мг ААФ/кг) на протя- жении 5 суток, после чего проводили ЧГЭ. Было сформи- ровано 3 группы животных: группа 1 – контроль; группа 2 – животные с моделью ААФ/ЧГЭ, которым в сальник имплантировали пустые МПГ; группа 3 – животные с мо- делью ААФ/ЧГЭ, которым в сальник имплантировали МПГ с иммобилизированными в них КФП человека первого триместра гестации, полученные после письменного сог- ласия пациента с соблюдением этических норм. Мак- ропористые альгинатные губки получали методом крио- тропного гелирования из альгината. Имплантацию МПГ проводили одновременно с проведением ЧГЭ. На 7, 14, 21 и 28-е сутки в сыворотке крови измеряли содержание альбумина и общего билирубина, а также активность АЛТ и АСТ, а также проводили мониторинг содержания эритроцитов в крови. Смертность животных в группе 3 на 28-е сутки после трансплантации составляла 20%, против 40 % в группе 2. Уровень альбумина резко снижался после проведения ЧГЭ в обеих группах с минимумом на 7-е сутки, когда он составлял 19,26 ± 1,9 г/л в группе 2 (против 44,39 ± 3,7 г/л в контроле) и 27,14 ± 2,4 г/л в группе 3 (р < 0,05 относи- тельно группы 2). Схожая динамика наблюдалась в содер- жании общего билирубина. Активность АСТ в группе 2 повышалась на 7−21-е сутки после ЧГЭ, а к 28-м суткам возвращалась к нормальному уровню. Трансплантация иммобилизированных КФП нивелировала повышение данного показателя на 7 и 21-е сутки после введения. Изменение активности АЛТ имело сходный характер. Поскольку печень является одним из основных депо крови, ЧГЭ сопровождалась значительной кровопотерей и, как следствие, снижением содержания эритроцитов в крови. В группе 2 данный показатель оставался достовер- но ниже контроля на протяжении всего периода наблю- дения. В группе 3 он не отличался от значений группы 2 на 7–14-е сутки, однако на 21-е сутки наблюдалось досто- верное его повышение (р = 0,01), а на 28-е сутки содер- жание эритроцитов нормализовалось. Результаты настоящей работы свидетельствуют о по- ложительном действии клеток фетальной печени, иммо- билизированных в макропористых губках, на течение пече- ночной недостаточности и перспективности данного под- хода при лечении заболеваний печени. The aim of study was to investigate the efficiency of transplantation of fetal liver cell (FLC) immobilized in macro- porous alginate sponge (MPS) in rats with liver failure formed by partial hepatectomy (PHE) under inhibition of hepatocytes proliferation with 2-acetyl aminofluorene (AAF). AAF/PHE model was formed in male rats by intragastric administration of 2-acetyl aminofluorene solution (30 mg/1 kg) during 5 days, on the 5th day PHE was performed. 3 groups of animals were formed: group 1 – the control; group 2 – rats with AAF/PHE model with cell-free MPS implanted into omentum majus; group 3 – rats with AAF/PHE model with human FLCs immobilized in MPS implanted in omentum majus. Human FLC of the 1st gestation trimester were collected after written consent of recipient in accordance to ethical norms. Macroporous alginate sponges were produced by cryotropic gelation of alginate. MPS implantation was carried-out at the same time with PHE. To the 7th, 14th, 21st and 28th days total bilirubin content, ALT and AST activities in blood serum were assessed, as well as and the erythro- cyte number in whole blood was counted. Mortality in animals of the 3rd group to the 28th day after transplantation comprised 20% vs. 40 % in group 2. Albumin content sharply decreased after PHE in both groups with minimum at the 7th day, when this index was 19.26 ± 1.9 g/l in group 2 (vs. 44.39 ± 3.7 g/l in the control) and 27.14 ± 2.4 g/l in group 3 (р < 0.05 compared to group 2). Similar dynamics was observed in total bilirubin content. AST activity in group 2 increased to the 7–21st days after PHE and by the 28th day returned to normal level. Immobilized FLC trans- plantation balanced the increase of this index to the 7th and 21st days after implantation. Similar dynamics was observed in ALT activity. As liver is one of the most important blood depot in organism PHE was accompanied by significant blood loss and consequently by decrease of erythrocyte number in blood. In group 2 this index was significantly lower com- pared to the control during whole observation period. In group 3 it did not differ from values of group 2 to the 7–14th day but to the 21st day its significant increase (р = 0.01) was observed. To the 28th day erythrocyte number returned to the normal content. The results of this work testify to positive effect of fetal liver cells immobilized in macroporous sponge on proceed- ing of liver failure and perspective of this approach in liver disease treatment. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 233 Особенности изменения иммунного статуса крыс с острым гнойным перитонитом после лечения препаратом “Криоцелл-Гемокорд” К.А. ГОЛЬЦЕВ, О.Ю. КОЖИНА, О.В. САФРАНчуК, М.В. ОСТАНКОВ, А.Н. ГОЛЬЦЕВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Peculiarities of Changes of Rats Immune Status with Acute Purulent Peritonitis after Treatment with “Cryocell-Hemocord” Preparation K.A. GOLTSEV, O.YU. KOZHYNA, O.V. SAFRANCHUK, M.V. OSTANKOV, A.N. GOLTSEV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Перитониты, независимо от их причины, в подавля- ющем большинстве случаев представляют собой воспа- ление бактериальной природы. Антибактериальную те- рапию при данной патологии нельзя считать полноцен- ной, если она не сочетается со стимуляцией иммуно- генеза, поскольку использование антибиотиков широкого спектра действия сопровождается иммунодепрессией. Цель работы – оценить состояние иммунного статуса крыс в экспериментальной модели острого гнойного пе- ритонита (ОГП) после лечения антибиотиком per se и в сочетании с препаратом “Криоцелл-Гемокорд”. Работа выполнена на крысах линии Вистар массой 160–180 г в возрасте 6 месяцев в соответствии с правилами “Европейской Конвенции о защите позвоночных живот- ных, используемых в научных целях” (Страсбург, 1986 г.). Моделировали ОГП путем перевязки и отсечения черве- образного отростка, который оставляли в брюшной по- лости. Препарат “Криоцелл-Гемокорд” получали из цель- ной кордовой крови человека. Крысы были разделены на 4 группы: 1 – интактные (контроль), 2 – с ОГП, которым че- рез 24 ч проводили релапаратомию и санацию брюш- ной полости раствором фурацилина, 3 – с ОГП, такое же лечение с внутримышечной инъекцией ампицилина, 4 – с ОГП, такое же лечение ампицилином и внутривенным вве- дением препарата “Криоцелл-Гемокорд” в объеме 0,3 мл (56×106 клеток). Все показатели оценивали на 1, 3, 5 и 7-е сутки после операции. Иммунофенотипирование клеток селезенки проводили на цитофлюорометре (FACS Сali- bur, BD, США) с использованием МАТ к CD3, CD4, CD8, CD25, IFN-γ и IL-10 (ВD, США). Во всех опытных группах крыс наблюдали откло- нения исследованных показателей состояния иммунной системы. В первую очередь, это касалось общих Т-клеток (СD3+), субпопуляции Treg клеток (CD4+CD25+), а также повышения содержания клеток-продуцентов провоспа- лительного цитокина IFN-γ . Применение препарата “Крио- целл-Гемокорд” обеспечивало восстановление субпопу- ляционного состава у крыс с ОГП, увеличивая процент СD3+-, CD4+-, CD8+- и снижая содержание CD4+CD25+-кле- ток. Судя по снижению содержания IFN-γ +- и повыше- нию IL-10+-клеток, введение препарата “Криоцелл-Гемо- корд” может положительно влиять на цитокиновый про- филь животных с ОГП, перепрофилируя синтез противо- спалительного IL-10 и провоспалительного цитокина IFN-γ. Peritonites regardless on their causes mostly represent the inflammation of bacterial origin. Antibacterial therapy of this pathology could not be considered complete, if it is not combined with the stimulation of immunogenesis, whe- reas the application of antibiotics of wide spectrum is ac- companied with an immune depression. The research aim is to estimate the rat immune status in experimental model of acute purulent peritonitis (APP) after treatment with antibiotics per se and in combination with “Cryocell-Hemocord” preparation. The work was performed in 160–180g 6-month-old Wistar rats according to the rules of European convention on the protection of vertebrate animals used for scientific purposes (Strasbourg, 1986). APP was simulated by means of legation and dissecting of vermicular appendix which was left in peritoneal cavity. The preparation “Cryocell-He- mocord” was derived from the whole human cord blood. The rats were divided into 4 groups: the 1st one was intact animals (the control); the 2nd – those with APP, which in 24 hrs were relaparotomized and the cavity was sanitated with Furacinum; the 3rd – with APP, the same treatment and intramuscular injection of Ampicillin; the 4th – with APP and the same treatment with Ampicillin and intravenous injection of “Cryocell-Hemocord” in the volume of 0.3 ml (56×106 cells). All the indices were estimated to the 1st, 3rd, 5th and 7th days after surgery. Immune phenotyping of spleen cells was performed with cytofluorimeter (FACS Calibur, BD, USA) using MAB to CD3, CD4, CD8, CD25, IFN-γ, IL- 10 (BD, USA). In all the experimental groups of rats we found the devia- tions of the studied indices of immune system state. Firstly this concerned total T-cells (CD3+), Treg cell subpopulation (CD4+CD25+) as well as the rise in the content of the cells producing of antiinflammatory cytokine IFN-γ . Application of the “Cryocell-Hemocord” preparation provided the res- toration of subpopulation composition in the rats with APP, by means of increasing the percentage of CD3+, CD4+, CD8+ and reducing the content of CD4+CD25+ cells. Judging on the reduced content of IFN-γ+ and increased IL-10+ cells, the introduction of the “Cryocell-Hemocord” preparation may positively affect the cytokine profile of animals with APP by means of re-orientation of the synthesis of anti- inflammatory IL-10 and pro-inflammatory cytokine IFN-γ. ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 21, 2011, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 21, 2011, №2 234

Тезисы конференции молодых ученых “Холод в биологии и медицине 2011” 18–19 мая 2011, г. Харьков

Репозитарії

Схожі ресурси