Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої

Найважливішим етапом у будь-якому протеомному дослідженні є екстрагування та приготування білкових зразків. Краща розчинність білків забезпечує якісніше їх розділення в гелі й, відповідно, ідентифікацію більшої кількості поліпептидів, а відтак — точніше виявлення відмінностей в експресії генів, що ї...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2013
Автори:	Кондратюк, Ю.Ю., Маменко, П.М., Левішко, А.С., Дрозденко, Г.М., Коць, С.Я.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України 2013
Назва видання:	Физиология и биохимия культурных растений
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66481
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої / Ю.Ю. Кондратюк, П.М. Маменко, А.С. Левішко, Г.М. Дрозденко, С.Я. Коць // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 222-229. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-66481
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-664812014-07-17T03:01:45Z Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої Кондратюк, Ю.Ю. Маменко, П.М. Левішко, А.С. Дрозденко, Г.М. Коць, С.Я. Найважливішим етапом у будь-якому протеомному дослідженні є екстрагування та приготування білкових зразків. Краща розчинність білків забезпечує якісніше їх розділення в гелі й, відповідно, ідентифікацію більшої кількості поліпептидів, а відтак — точніше виявлення відмінностей в експресії генів, що їх кодують. Проте низка методичних труднощів, пов’язаних насамперед зі складністю організації рослинної клітини, змушує добирати методи отримання препаратів білків у кожному конкретному випадку. В зв’язку з цим було проведено моніторинг методів отримання та електрофоретичного розділення білкових екстрактів із коренів і бульбочок сої, вирощеної за інокуляції Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum на фоні різного азотного забезпечення. Відібрано найефективніші методи для подальшого виявлення кількісних та якісних змін білкових профілів сої. Важнейшим этапом в любом протеомном исследовании является экстракция и приготовление белковых образцов. Лучшая растворимость белков обеспечивает более качественное их разделение в геле и, соответственно, идентификацию большего количества полипептидов, а поэтому — более точное выявление различий в экспрессии генов, которые их кодируют. Однако ряд методических трудностей, связанных прежде всего со сложностью организации растительной клетки, вынуждает подбирать методы получения препаратов белков в каждом конкретном случае. В связи с этим был проведен мониторинг методов получения и электрофоретического разделения белковых экстрактов из корней и клубеньков сои, выращенной при инокуляции Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum на фоне различного азотного обеспечения. Отобраны наиболее эффективные методы для дальнейшего выявления количественных и качественных изменений белковых профилей сои. The most critical step in any proteomics study is protein extraction and sample preparation. Better solubilization increases the separation and resolution of gels allowing identification of a higher number of proteins and more accurate quantification of differences in gene expression. However, a number of methodological difficulties related to complexity of plant cells leads to necessity of choose the proteomic studies conditions in each case. The monitoring of methods for extraction and electrophoretic separation of proteins of roots and nodules of soybean grown under inoculation of Tn5-mutants of Bradyrhizobium japonicum and under different nitrogen supply was conducted. The most effective methods for further identification of quantitative and qualitative changes in soybean protein profiles were selected. 2013 Article Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої / Ю.Ю. Кондратюк, П.М. Маменко, А.С. Левішко, Г.М. Дрозденко, С.Я. Коць // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 222-229. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. 0522-9310 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66481 581.557:579.22 uk Физиология и биохимия культурных растений Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
description	Найважливішим етапом у будь-якому протеомному дослідженні є екстрагування та приготування білкових зразків. Краща розчинність білків забезпечує якісніше їх розділення в гелі й, відповідно, ідентифікацію більшої кількості поліпептидів, а відтак — точніше виявлення відмінностей в експресії генів, що їх кодують. Проте низка методичних труднощів, пов’язаних насамперед зі складністю організації рослинної клітини, змушує добирати методи отримання препаратів білків у кожному конкретному випадку. В зв’язку з цим було проведено моніторинг методів отримання та електрофоретичного розділення білкових екстрактів із коренів і бульбочок сої, вирощеної за інокуляції Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum на фоні різного азотного забезпечення. Відібрано найефективніші методи для подальшого виявлення кількісних та якісних змін білкових профілів сої.
format	Article
author	Кондратюк, Ю.Ю. Маменко, П.М. Левішко, А.С. Дрозденко, Г.М. Коць, С.Я.
spellingShingle	Кондратюк, Ю.Ю. Маменко, П.М. Левішко, А.С. Дрозденко, Г.М. Коць, С.Я. Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої Физиология и биохимия культурных растений
author_facet	Кондратюк, Ю.Ю. Маменко, П.М. Левішко, А.С. Дрозденко, Г.М. Коць, С.Я.
author_sort	Кондратюк, Ю.Ю.
title	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
title_short	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
title_full	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
title_fullStr	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
title_full_unstemmed	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
title_sort	порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої
publisher	Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
publishDate	2013
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66481
citation_txt	Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої / Ю.Ю. Кондратюк, П.М. Маменко, А.С. Левішко, Г.М. Дрозденко, С.Я. Коць // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 222-229. — Бібліогр.: 21 назв. — укр.
series	Физиология и биохимия культурных растений
work_keys_str_mv	AT kondratûkûû porívnâlʹnijanalízmetodívekstraguvannâtarozdílennâbílkívdlâproteomnogodoslídžennâbílkovihprofílívkorenívíbulʹbočoksoí AT mamenkopm porívnâlʹnijanalízmetodívekstraguvannâtarozdílennâbílkívdlâproteomnogodoslídžennâbílkovihprofílívkorenívíbulʹbočoksoí AT levíškoas porívnâlʹnijanalízmetodívekstraguvannâtarozdílennâbílkívdlâproteomnogodoslídžennâbílkovihprofílívkorenívíbulʹbočoksoí AT drozdenkogm porívnâlʹnijanalízmetodívekstraguvannâtarozdílennâbílkívdlâproteomnogodoslídžennâbílkovihprofílívkorenívíbulʹbočoksoí AT kocʹsâ porívnâlʹnijanalízmetodívekstraguvannâtarozdílennâbílkívdlâproteomnogodoslídžennâbílkovihprofílívkorenívíbulʹbočoksoí
first_indexed	2025-07-05T16:44:53Z
last_indexed	2025-07-05T16:44:53Z
_version_	1836826119599292416
fulltext	ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ КУЛЬТ. РАСТЕНИЙ. 2013. Т. 45. № 3 УДК 581.557:579.22 ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ МЕТОДІВ ЕКСТРАГУВАННЯ ТА РОЗДІЛЕННЯ БІЛКІВ ДЛЯ ПРОТЕОМНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ БІЛКОВИХ ПРОФІЛІВ КОРЕНІВ І БУЛЬБОЧОК СОЇ Ю.Ю. КОНДРАТЮК, П.М. МАМЕНКО, А.С. ЛЕВІШКО, Г.М. ДРОЗДЕНКО, С.Я. КОЦЬ Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України 03022 Київ, вул. Васильківська, 31/17 e-mail: kondratyuk_yulya@ukr.net Найважливішим етапом у будь-якому протеомному дослідженні є екстрагування та приготування білкових зразків. Краща розчинність білків забезпечує якісніше їх розділення в гелі й, відповідно, ідентифікацію більшої кількості поліпептидів, а відтак — точніше виявлення відмінностей в експресії генів, що їх кодують. Проте низка методичних труднощів, пов’язаних насамперед зі складністю ор- ганізації рослинної клітини, змушує добирати методи отримання препаратів білків у кожному конкретному випадку. В зв’язку з цим було проведено моніто- ринг методів отримання та електрофоретичного розділення білкових екстрактів із коренів і бульбочок сої, вирощеної за інокуляції Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum на фоні різного азотного забезпечення. Відібрано найефективніші ме- тоди для подальшого виявлення кількісних та якісних змін білкових профілів сої. Ключові слова: Glycine max (L.) Merr., мікробно-рослинний симбіоз, азотфіксація, протеом, методи екстрагування білків, електрофорез. Останнім часом дедалі більше уваги приділяється розробці нових техно- логій для швидкої та автоматизованої ідентифікації білків, однак най- важливішим етапом у будь-якому протеомному дослідженні залишається отримання білкових препаратів [6, 14]. Iдеальний метод передбачає екс- трагування й розчинення всього пулу білків, що містяться у зразку, з мінімальним включенням артефактів і небілкових компонентів. Проте з урахуванням величезного різноманіття поліпептидів за внутрішньоклітинною локалізацією, молекулярною масою, зарядом, гідрофобними властивостями, посттрансляційними модифікаціями, здатністю до утворення комплексів досі не вдалося створити універсаль- ний метод екстрагування всього протеому хоча б якогось одного ор- ганізму: умови проведення екстрагування потрібно добирати щоразу за- лежно від матеріалу й мети протеомного дослідження [16, 20]. Зі ще більшими проблемами стикаються при проведенні протеом- них досліджень рослин. Значною мірою це пов’язано зі складнощами вирішення методичних проблем приготування білкових препаратів із рослинних тканин, які містять «баластні» для такого аналізу речовини: вторинні метаболіти, фенольні сполуки, ліпіди, органічні й нуклеїнові кислоти, полісахариди клітинних стінок, а також значно домінуючі в зе- лених тканинах хлоропластні білки, наприклад такі, як рибулозобісфос- фаткарбоксилаза [8, 9, 13]. Деякі з цих сполук впливають на сам процес © Ю.Ю. КОНДРАТЮК, П.М. МАМЕНКО, А.С. ЛЕВІШКО, Г.М. ДРОЗДЕНКО, С.Я. КОЦЬ, 2013 222 отримання білкових препаратів, інші можуть взаємодіяти з білками і при цьому істотно знижувати якість результатів подальшого протеомно- го аналізу (ускладнювати електрофоретичне розділення поліпептидів, впливати на кількість і чіткість розділених білкових смуг тощо) [15]. Крім цього, у клітинах рослин відносно нижчий порівняно з тваринни- ми та бактеріальними клітинами вміст загального білка [10]. З огляду на це ефективне екстрагування білків із рослинних тканин є основною передумовою досягнення успішних результатів протеомного аналізу. Саме тому метою нашої роботи було проведення моніторингу су- часних методів екстрагування білків, добір оптимальних для отримання препаратів із коренів та бульбочок сої за інокуляції різними за ефек- тивністю Тn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum і електрофоретичного розділення одержаних білкових зразків. Методика У роботі використано Тn5-мутанти штаму В. japonicum 646: активний 21-2 та малоактивний 107, отримані методом транспозонового мутагенезу у відділі симбіотичної азотфіксації Iнституту фізіології рослин і генетики НАН України [1—3]. Рослини сої (Glycine max (L.) Merr.) сорту Васильківська вирощува- ли в умовах вегетаційного досліду в 16-кілограмових посудинах Вагнера на промитому річковому піску вологістю 60 % повної вологоємності за природного освітлення. Джерелом мінерального живлення слугувала по- живна суміш Гельригеля, збагачена мікроелементами (молібден, бор, манган, мідь), з 1 та 0,25 норми азоту (1 норма азоту відповідає 708 мг Са(NO3)2 · 4Н2О на 1 кг субстрату). Перед посівом простерилізоване 70 %-м розчином етанолу і промите під проточною водою протягом 1 год насіння інокулювали суспензіями бульбочкових бактерій різної ефектив- ності, кількість бактерій становила 107 клітин в 1 мл. Ефективність методів отримання білкових зразків порівнювали після екстрагування білків фенольним і SDS-буферами. У першому ви- падку застосовували метод, описаний Вангом [19]: 100 мг розтертого в рідкому азоті зразка коренів або бульбочок сої ресуспендували в екст- ракційному буфері, що містив 0,1 М трис-НСl, рН 8,0, 2 % SDS, 30 % сахарози, 5 % -меркаптоетанолу, 1мМ фенілметилсульфоксиду та трис-НСl насичений фенол. Зразок енергійно струшували протягом 10 хв і витримували 1 год за температури –20 °С. Розчин центрифугували протягом 5 хв при 16 000 об/хв і 4 °С. Відбирали фенольний шар і про- водили преципітацію білків трьома об’ємами попередньо охолоджено- го 0,1 М амонійацетату протягом 2 год за температури –20 °С. Пре- ципітовані білки осаджували центрифугуванням за 16 000 об/хв, 4 °С протягом 5 хв. Отриманий осад відмивали один раз попередньо охолодже- ним 0,1 М амонійацетатом і один раз попередньо охолодженим 80 %-м ацетоном. Отримані білкові осади ресуспендували в 30 мМ трис-НСl, рН 8,5. Другий метод отримання білкових екстрактів полягав у SDS-екстра- гуванні білків із наступним осадженням ацетоном [21]. Для цього 100 мг розтертого в рідкому азоті зразка коренів або бульбочок сої ресуспенду- вали в такому екстракційному буфері: 0,175 М трис-НСl, 5 % SDS, 15 % гліцерин, 0,3 М ДТТ. Зразок енергійно струшували протягом 30 с і вит- римували 1 год за температури –20 °С. Рештки клітин осаджували цент- 223 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 рифугуванням за 10 000 об/хв, 4 °С протягом 15 хв. Преципітацію білків проводили охолодженим ацетоном, що містив 10 % трихлороцтової кис- лоти, протягом 1 год за –20 °С. Преципітовані білки осаджували цент- рифугуванням за 10 000 об/хв, 4 °С протягом 15 хв. Білковий осад двічі промивали охолодженим 80 %-м розчином ацетону і розчиняли в 30 мМ трис-НСl, рН 8,5. Концентрацію сумарного білка в отриманих екстрактах визначали за методом Бредфорда [4]. Білкові профілі отриманих зразків аналізували методом електро- форезу. Для цього готували зразки з концентрацією сумарного білка 100 мкг/мл і проводили поліакриламідний гель-електрофорез у денату- руючих умовах за Леммлі (12 %-й розподілювальний гель) [12]. Пара- лельно отримані білкові екстракти розділяли електрофоретично за допо- могою біоаналізатора Agilent 2100 Bioanalyzer System (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) з використанням стандартного прото- колу й реакційної системи виробника. Результати та обговорення Відомо, що екстрагування білків і приготування препаратів із тканин цу- крової тростини, томатів, бананів, авокадо, тютюну, сої ускладнене че- рез високий вміст у них таких речовин, як фенольні й терпенові сполу- ки, органічні кислоти, вуглеводи, протеолітичні й окиснювальні ферменти [17]. Протеомні дослідження таких рослин, як рис та арабідо- псис, досягли великих успіхів, а от вивченню особливостей протеому однієї з безумовно найперспективніших сільськогосподарських культур — сої — приділяється значно менша увага [5]. Масштабні протеомні дослідження сої розпочалися лише 10—15 років тому, а оптимізація ме- тодів екстрагування та розчинення білків — тільки в останні роки [11]. Під час проведення порівняльного аналізу отриманих трьома способами білкових профілів різних тканин сої та рису було виявлено значно мен- ше плям на білкових картах першої, що могло бути результатом непо- вної екстракції білків сої [18]. З огляду на це запропоновано різні мето- дики отримання білкових препаратів із різних тканин сої (табл. 1) з одночасним акцентуванням уваги на необхідності корекції їх у кожному конкретному випадку. Після аналізу великого масиву методів екстрагування білків із різних тканин сої ми обрали дві методики, що різнились як екст- ракційними, так і преципітувальними буферами. За цими методиками отримано білкові екстракти коренів і бульбочок сої, інокульованої Тn5- мутантами B. japonicum і вирощеної за різного азотного забезпечення. Ефективність методів оцінювали за вмістом сумарного білка в отрима- них екстрактах (табл. 2). Iстотної різниці за цим показником у білкових екстрактах коренів і бульбочок сої не виявлено, що свідчить про одна- кову ефективність і фенольного, і SDS-екстрагування для зразків сої за інокуляції як активним Тn5-мутантом бульбочкових бактерій 21-2, так і неактивним — 107. Не виявлено також залежності ефективності екстра- гування білків від кількості внесеного в ґрунт мінерального азоту. Тому в подальшому ми керувались практичними аспектами виконання даних методик і зупинились на другому методі екстрагування. Згідно з даними табл. 1, одним із найпоширеніших підходів проте- омного дослідження є електрофоретичний аналіз [15]. Двовимірний еле- 224 Ю.Ю. КОНДРАТЮК, П.Н. МАМЕНКО, А.С. ЛЕВИШКО, Г.Н. ДРОЗДЕНКО, С.Я. КОЦЬ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 ктрофорез, розроблений для високоякісного розділення білків, зали- шається методом дослідження білкових профілів у нативних умовах і ви- явлення в них кількісних та якісних змін [13, 16], а електрофорез у поліак- риламідному гелі за денатурувальних умов застосовують, коли білки потрібно розділити за їх молекулярною масою чи виявити у зразках мож- ливі інтерферуючі агенти [7]. Тому наступним етапом нашої роботи було порівняння електрофоретичних методів розділення білків: класичного поліакриламідного гель-електрофорезу за Леммлі та електрофорезу за до- помогою біоаналітичної системи Agilent 2100 Bioanalyzer System. 225 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 ТАБЛИЦЯ 1. Методи протеомних досліджень білкових екстрактів, отриманих із різних тканин сої [11] Тканина Екстракційний буфер Буфер для розчинення/лізису білків Метод протеомного аналізу 4 % CHAPS, 5 М сечовина, 2 М тіосечовина, 65 мМ ДТТ, 0,8 % амфоліти (рН 3—10) — 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS, Q-TOF 50 % фенол, 0,45 М сахароза, 5 мМ ЕДТА, 0,2 % -меркаптоетанол, 50 мМ трис-НСl, рН 8,8 8 М сечовина, 2 М тіосечовина, 2 % CHAPS, 2 % тритон Х-100, 50 мМ ДТТ, 2 мМ ТВР, 0,5 % амфоліти 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS Зріле насіння 10 % TХО в ацетоні, 0,07 % -меркаптоетанол 9 М сечовина, 1 % CHAPS, 1 % ДТТ, 1 % амфоліти (рН 3—10) 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS, LC-MS/MS Насіння, що пророс- тає 50 % фенол, 0,45 М сахароза, 5 мМ ЕДТА, 0,2 % -меркаптоетанол, 50 мМ трис-НСl, рН 8,8 8 М сечовина, 2 М тіосечовина, 2 % CHAPS, 2 % тритон Х-100, 50 мМ ДТТ, 0,5 % амфоліти 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS Кореневі волоски 50 % фенол, 0,45 М сахароза, 5 мМ ЕДТА, 0,2 % -меркаптоетанол, 50 мМ трис-НСl, рН 8,8 8 М сечовина, 2 М тіосечовина, 2 % CHAPS, 2 % тритон Х-100, 50 мМ ДТТ, 0,5 % амфоліти 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS Корінь і гіпоко- тиль Фосфатно-сольовий буфер, рН 7,6 (65 мМ К2НРО4, 2,6 мМ КН2РО4, 400 мМ NaCl, 3 мМ NaNO3) з наступною преципітацією 10 %-м розчином ТХО 9,5 М сечовина, 2 % NP-40, 5 % PVP, 5 % -меркаптоетанол, 2 % амфоліти, рН 3—10 1-D SDS PAGE, 2-DE, IEF, ESI- Q/TOF-MS/MS Корені 10 % ТХО в ацетоні, 0,07 % ДТТ, 1 % PVP 7 М сечовина, 2 М тіосечовина, 2 % CHAPS, 1 % ДТТ, 2 % амфоліти, рН 3—10 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS Листки 10 % ТХО в ацетоні, 0,07 % -меркаптоетанол 9 М сечовина, 1 % CHAPS, 1 % ДТТ, 1 % амфоліти (рН 3—10) 1-D SDS PAGE, 2-DE, IPG, MALDI-TOF MS, LC-MS/MS 100 мМ трис-НСl, рН 8,8, 50 мМ ДТТ, 10 мМ ЕДТА, 1 мМ ФМСФ, інгібітори протеаз 8,5 М сечовина, 2,5 М тіосечовина, 5 % CHAPS, 2 % тритон Х-100, 1 % амфоліти (рН 3—10), 100 мМ ДТТ IPG, 2-DE, 1-D SDS PAGE У результаті порівняння обох методів розділення білків доведено значну перевагу застосування комерційної аналітичної системи (рис. 1). Як видно з рис. 1, для чітко видимого розділення рослинних білків методом класичного електрофорезу в поліакриламідному гелі треба значно збільшувати кількість нанесеного на доріжки сумарного білка. Водночас для роботи на біоаналізаторі таких концентрацій цілком достатньо, причому в процесі підготовки зразків до розділення аналізатором білкові препарати розбавлялись ще в 200 разів, тому цей метод є доцільнішим для дослідження саме рослинних зразків порівня- но з тваринними й бактеріальними з огляду на менший вміст у них су- марного білка [10]. Крім набагато вищої роздільної здатності аналізатора порівняно з класичною електрофоретичною системою і, відповідно, більш високо- якісними результатами, біоаналізатор Agilent 2100 Bioanalyzer System не лише механічно розділяє білки у гелі, а й одразу ж автоматично аналізує 226 Ю.Ю. КОНДРАТЮК, П.Н. МАМЕНКО, А.С. ЛЕВИШКО, Г.Н. ДРОЗДЕНКО, С.Я. КОЦЬ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 ТАБЛИЦЯ 2. Вміст сумарного білка в екстрактах бульбочок і коренів сої, отриманих різними методами Вміст сумарного білка, мг/г тканини Варіант Фенольний метод SDS-метод Корені 0,25 норми азоту 1,2±0,06 1,3±0,0721-2 1 норма азоту 1,3±0,07 1,2±0,06 0,25 норми азоту 0,9±0,04 0,9±0,05107 1 норма азоту 1,1±0,06 1,1±0,05 Бульбочки 0,25 норми азоту 1,0±0,05 1,0±0,0621-2 1 норма азоту 1,0±0,06 1,1±0,06 0,25 норми азоту 1,2±0,06 1,2±0,07107 1 норма азоту 1,1±0,05 1,0±0,06 Рис. 1. Електрофореграми білкових профілів коренів і бульбочок сої: а — отримана методом ПААГ за Леммлі; б — отримана за допомогою біоаналізатора Agilent 2100 Bioanalyzer System; 1—6 — білкові екстракти коренів сої; 7—9 — білкові екстракти бульбочок; 10 — суміш маркерних білків; М — маркери молекулярних мас їх спектри: з дуже високою точністю обчислює молекулярні маси й кон- центрації поліпептидів, їх відносний вміст у зразку, подає результати у вигляді електрофореграм і графіків, які одразу ж можна порівнювати між собою (рис. 2, табл. 3). 227 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 Рис. 2. Схематичне зображення результатів електрофоретичного розділення білків за до- помогою біоаналізатора Agilent 2100 Bioanalyzer System ТАБЛИЦЯ 3. Зведена таблиця кількості, концентрації та відносного вмісту білків у зразку, наведеному на рис. 2 Number of peaks found: 56 Total Area: 238,8 Total Rel. Conc: 11315,4 pg/l Noise: 0,4 Peak table for sample 10: Sample 10 Peak Size [kDa] Rel. Conc. [pg/l] % of Total 1 4,7 0,0 0,00 2 5,0 0,0 0,00 3 13,9 678,3 5,99 4 19,7 1440,2 12,73 5 25,9 427,2 3,78 6 29,4 242,2 2,14 7 33,0 489,4 4,33 8 37,1 236,4 2,09 9 42,5 966,2 8,54 10 48,1 322,2 2,85 11 56,0 162,9 1,44 12 59,0 332,5 2,94 13 62,8 144,5 1,28 14 67,4 245,8 2,17 15 74,6 173,7 1,54 16 82,4 236,1 2,09 17 88,4 183,9 1,63 18 101,1 528,5 4,67 19 119,0 375,3 3,32 20 121,0 126,2 1,12 Отже, у результаті моніторингу та аналізу сучасних методів проте- омного дослідження рослинних об’єктів загалом і сої зокрема ми підібрали оптимальні методи отримання білкових екстрактів та їх елект- рофоретичного розділення для подальшого виявлення кількісних і якісних змін білкових профілів за різних умов вирощування рослин сої. Оскільки соя є однією з сільськогосподарських культур першочергового агрономічного й економічного значення, вона потрапляє в ряд об’єктів, які потребують обов’язкового детального протеомного аналізу. Глибоке дослідження протеому сої дасть змогу не лише оперативно порівнювати і характеризувати її сорти, мутанти і трансгенні лінії, а й виявляти вплив на них біотичних та абіотичних чинників, прогнозувати функції білків, клонувати відповідні гени. У свою чергу, ідентифікація нових генів і роз- шифрування функцій білків, синтез яких вони кодують, дасть підґрунтя для генно-інженерного поліпшення стійкості сої до стресів, що є не- обхідним для її вирощування у сучасних умовах. 1. Коць С.Я., Моргун В.В., Тихонович И.А. и др. Биологическая фиксация азота: генетика азотфиксации, генетическая инженерия штаммов. Т. 3. — Киев: Логос, 2011. — 404 с. 2. Маліченко С.М., Воробей Н.А., Даценко В.К., Коць С.Я. Одержання та первинний скринінг за симбіотичними властивостями транспозантів бульбочкових бактерій сої // Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин: Матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. до 90-річчя від дня народження професора О.Ф. Михайлова. — Дніпропетровськ: Вид-во Дніпропетр. нац. ун-ту, 2005. — С. 32—33. 3. Маліченко С.М., Даценко В.К., Василюк В.М., Коць С.Я. Транспозоновий мутагенез штамів Bradyrhizobium japonicum // Физиология и биохимия культ. растений. — 2007. — 39, № 5. — С. 409—418. 4. Bradford M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of pro- tein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — 72. — P. 248— 254. 5. Carpentier S.C., Panis B., Vertommen A. et al. Proteome analysis of non-model plants: a chal- lenging but powerful approach // Mass Spectrometry Reviews. — 2008. — 27. — P. 354—377. 6. Cho W. Proteomics technologies and challenges // Genomics, Proteomics and Bioinformatics. — 2007. — 5, N 2. — P. 77—85. 7. Cilia M., Fish T., Yang X. et al. A comparison of protein extraction methods suitable for gel- based proteomic studies of aphid proteins // J. Biomolec. Techniques. — 2009. — 20. — P. 201— 215. 8. Espagne C., Martinez A., Valot B. et al. Alternative and effective proteomic analysis in Arabidopsis // Proteomics. — 2007. — 7. — P. 3788—3799. 9. Granier F. Extraction of plant proteins for two-dimensional electrophoresis // Electrophoresis. — 1988. — 9, N 11. — P. 712—718. 10. Isaacson T., Damasceno C.M.B., Saravanan R.S. et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues // Nature Protocols. — 2006. — 1. — P. 769— 774. 11. Komatsu S., Ahsan N. Soybean proteomics and its application to functional analysis // J. Proteomics. — 2009. — 72. — P. 325—336. 12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — 227, N 5259. — P. 680—685. 13. Mesquita R.O., Soares E.A., Barros E.G., Loureiro M.E. Method optimization for proteomic analysis of soybean leaf: improvements in identification of new and low-abundance proteins // Genetics and Molecular Biol. — 2012. — 35, N 1. — P. 353—361. 14. Mooney B.P., Krishnan H.B., Thelen J.J. High-throughput peptide mass fingerprinting of soy- bean seed proteins: automated workflow and utility of UniGene expressed sequence tag data- bases for protein identification // Phytochemistry. — 2004. — 65. — P. 1733—1744. 15. Rodrigues E.P., Torres A.R., Batista J.S.S. et al. A simple, economical and reproducible pro- tein extraction protocol for proteomics studies of soybean roots // Genetics and Mol. Biol. — 2012. — 35, N 1. — P. 348—352. 16. Rose J.K.C., Bashir S., Giovannoni J.J. et al. Tackling the plant proteome: practical appro- aches, hurdles and experimental tools // Plant J. — 2004. — 39. — P. 715—733. 17. Saravanan R.S., Rose J.K. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues // Proteomics. — 2004. — 4. — P. 2522—2532. 228 Ю.Ю. КОНДРАТЮК, П.Н. МАМЕНКО, А.С. ЛЕВИШКО, Г.Н. ДРОЗДЕНКО, С.Я. КОЦЬ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3 18. Toorchi M., Nouri M.Z., Tsumura M., Komatsu S. Acoustic technology for high-performance disruption and extraction of plant proteins // J. Proteome Res. — 2008. — 7. — P. 3035— 3041. 19. Wang W., Vignani R., Scali M., Cresti M. A universal and rapid protocol for protein extrac- tion from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis // Electrophoresis. — 2006. — 27. — P. 2782—2786. 20. Wijk K.J. Challenges and prospects of plant proteomics // Plant Physiol. — 2001. — 126. — P. 501—508. 21. online:http: // proteomics.missouri.edu/protocols/proteinExtraction.html Отримано 24.10.2012 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ЭКСТРАКЦИИ И РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ДЛЯ ПРОТЕОМНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ ПРОФИЛЕЙ КОРНЕЙ И КЛУБЕНЬКОВ СОИ Ю.Ю. Кондратюк, П.Н. Маменко, А.С. Левишко, Г.Н. Дрозденко, С.Я. Коць Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, Киев Важнейшим этапом в любом протеомном исследовании является экстракция и приготов- ление белковых образцов. Лучшая растворимость белков обеспечивает более качественное их разделение в геле и, соответственно, идентификацию большего количества полипепти- дов, а поэтому — более точное выявление различий в экспрессии генов, которые их коди- руют. Однако ряд методических трудностей, связанных прежде всего со сложностью орга- низации растительной клетки, вынуждает подбирать методы получения препаратов белков в каждом конкретном случае. В связи с этим был проведен мониторинг методов получе- ния и электрофоретического разделения белковых экстрактов из корней и клубеньков сои, выращенной при инокуляции Tn5-мутантами Bradyrhizobium japonicum на фоне различного азотного обеспечения. Отобраны наиболее эффективные методы для дальнейшего выявле- ния количественных и качественных изменений белковых профилей сои. COMPARATIVE ANALYSIS OF METHODS FOR PROTEIN EXTRACTION AND SEPARATION FOR PROTEOMIC INVESTIGATION OF SOYBEAN ROOTS AND NODULES PROTEINS Iu.Iu. Kondratiuk, P.M. Mamenko, A.S. Levishko, G.M. Drozdenko, S.Ya. Kots Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine 31/17 Vasylkivska St., Kyiv, 03022, Ukraine The most critical step in any proteomics study is protein extraction and sample preparation. Better solubilization increases the separation and resolution of gels allowing identification of a higher number of proteins and more accurate quantification of differences in gene expression. However, a number of methodological difficulties related to complexity of plant cells leads to necessity of choose the proteomic studies conditions in each case. The monitoring of methods for extraction and electrophoretic separation of proteins of roots and nodules of soybean grown under inocula- tion of Tn5-mutants of Bradyrhizobium japonicum and under different nitrogen supply was con- ducted. The most effective methods for further identification of quantitative and qualitative changes in soybean protein profiles were selected. Key words: Glycine max (L.) Merr., microbe-plant symbiosis, nitrogen fixation, proteome, methods of protein extraction, electrophoresis. 229 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3

Порівняльний аналіз методів екстрагування та розділення білків для протеомного дослідження білкових профілів коренів і бульбочок сої

Репозитарії

Схожі ресурси