Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу
Досліджено зміни активності гваяколпероксидази (РОD) у відповідь на тепловий стрес у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Columbia 0) i в нокаутної за геном каталази 2 (Саt2) мутантної лінії КО-Саt2, яка має знижену каталазну активність. Встановлено, що в інтактних листках мутантних росли...
Gespeichert in:
| Datum: | 2013 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2013
|
| Schriftenreihe: | Физиология и биохимия культурных растений |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66484 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу / Т.О. Руснак, I.М. Доліба, Р.А. Волков, I.I. Панчук // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 246-253. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-66484 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-664842014-07-17T03:01:45Z Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу Руснак, Т.О. Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. Досліджено зміни активності гваяколпероксидази (РОD) у відповідь на тепловий стрес у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Columbia 0) i в нокаутної за геном каталази 2 (Саt2) мутантної лінії КО-Саt2, яка має знижену каталазну активність. Встановлено, що в інтактних листках мутантних рослин, інкубованих у буфері за кімнатної температури в темряві, активність РОD зростала й компенсувала втрату ізоформи САT2, проте відмінностей між активностями РОD у рослин дикого типу й мутантів, які росли у ґрунті за оптимальних умов, не виявлено. Під дією помірного теплового стресу (37 °С) порівняно з кімнатною температурою активність РОD підвищувалась за дії двогодинної обробки у рослин дикого типу й одногодинної — у лінії КО-Саt2. Отже, залучений у відповідь на тепловий стрес фермент бере участь у контролі внутрішньоклітинного рівня пероксиду водню. Проте в умовах жорсткого теплового стресу (44 °С) захисна функція РОD може обмежуватись частковою інактивацією ферменту. Изучены изменения активности гваяколпероксидазы (РОD) в ответ на тепловой стресс у растений Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Columbia 0) и нокаутной по гену каталазы 2 (Саt2) мутантной линии КО-Саt2, которая имеет пониженную каталазную активность. Установлено, что в интактных листьях мутантных растений, которые инкубировались в буфере при комнатной температуре в темноте, активность РОD возрастала и компенсировала потерю изоформы САТ2, однако отличия активностей РОD у растений дикого типа и мутантов, которые росли в почве при оптимальных условиях, не обнаружены. Под воздействием умеренного теплового стресса (37 °С) по сравнению с комнатной температурой активность РОD повышалась после двухчасовой обработки у растений дикого типа и одночасовой — у линии КО-Саt2. Следовательно, фермент вовлечен в ответ на тепловой стресс путем участия в контроле внутриклеточного уровня пероксида водорода. Однако в условиях жесткого теплового стресса (44 °С) защитная функция РОD может быть ограничена частичной инактивацией фермента. Changes in guaiacol peroxidase (POD) activity upon heat stress were evaluated in wild type plants of Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia 0) and in catalase 2 (Cat2) knock-out mutant KO-Cat2, which demonstrates reduced catalase activity. It was found that in leaves of the mutant plants incubated in buffer at room temperature in dark activity of POD was increased compensating the lack of CAT2 isoform. However, no differences in POD activity were found between the wild type and mutant plants growing on soil at non-stressful conditions. Upon moderate (37 °C) heat treatment comparing to room temperature activity of POD was increased during 2 hours in wild type and during 1 hour in KO-Cat2 plants. Accordingly, the enzyme appears to be involved in heat stress response via the control of intracellular level of hydrogen peroxide. However, upon severe (44 °C) heat stress the protective function of POD can be limited due to partial inactivation of the enzyme. 2013 Article Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу / Т.О. Руснак, I.М. Доліба, Р.А. Волков, I.I. Панчук // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 246-253. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. 0522-9310 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66484 577.152.1+577.218 uk Физиология и биохимия культурных растений Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| description |
Досліджено зміни активності гваяколпероксидази (РОD) у відповідь на тепловий стрес у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Columbia 0) i в нокаутної за геном каталази 2 (Саt2) мутантної лінії КО-Саt2, яка має знижену каталазну активність. Встановлено, що в інтактних листках мутантних рослин, інкубованих у буфері за кімнатної температури в темряві, активність РОD зростала й компенсувала втрату ізоформи САT2, проте відмінностей між активностями РОD у рослин дикого типу й мутантів, які росли у ґрунті за оптимальних умов, не виявлено. Під дією помірного теплового стресу (37 °С) порівняно з кімнатною температурою активність РОD підвищувалась за дії двогодинної обробки у рослин дикого типу й одногодинної — у лінії КО-Саt2. Отже, залучений у відповідь на тепловий стрес фермент бере участь у контролі внутрішньоклітинного рівня пероксиду водню. Проте в умовах жорсткого теплового стресу (44 °С) захисна функція РОD може обмежуватись частковою інактивацією ферменту. |
| format |
Article |
| author |
Руснак, Т.О. Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. |
| spellingShingle |
Руснак, Т.О. Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу Физиология и биохимия культурных растений |
| author_facet |
Руснак, Т.О. Доліба, І.М. Волков, Р.А. Панчук, І.І. |
| author_sort |
Руснак, Т.О. |
| title |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| title_short |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| title_full |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| title_fullStr |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| title_full_unstemmed |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| title_sort |
активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії ко-саt2 arabidopsis thaliana за умов теплового стресу |
| publisher |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| publishDate |
2013 |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66484 |
| citation_txt |
Активність гваяколпероксидази у нокаутної лінії КО-Саt2 Arabidopsis thaliana за умов теплового стресу / Т.О. Руснак, I.М. Доліба, Р.А. Волков, I.I. Панчук // Физиология и биохимия культурных растений. — 2013. — Т. 45, № 3. — С. 246-253. — Бібліогр.: 26 назв. — укр. |
| series |
Физиология и биохимия культурных растений |
| work_keys_str_mv |
AT rusnakto aktivnístʹgvaâkolperoksidaziunokautnoílínííkosat2arabidopsisthalianazaumovteplovogostresu AT dolíbaím aktivnístʹgvaâkolperoksidaziunokautnoílínííkosat2arabidopsisthalianazaumovteplovogostresu AT volkovra aktivnístʹgvaâkolperoksidaziunokautnoílínííkosat2arabidopsisthalianazaumovteplovogostresu AT pančukíí aktivnístʹgvaâkolperoksidaziunokautnoílínííkosat2arabidopsisthalianazaumovteplovogostresu |
| first_indexed |
2025-07-05T16:45:00Z |
| last_indexed |
2025-07-05T16:45:00Z |
| _version_ |
1836826126528282624 |
| fulltext |
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ КУЛЬТ. РАСТЕНИЙ. 2013. Т. 45. № 3
УДК 577.152.1+577.218
АКТИВНIСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗИ У НОКАУТНОЇ ЛIНIЇ
КО-Саt2 ARABIDOPSIS THALIANA ЗА УМОВ ТЕПЛОВОГО СТРЕСУ
Т.О. РУСНАК, I.М. ДОЛIБА, Р.А. ВОЛКОВ, I.I. ПАНЧУК
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича
58012 Чернівці, вул. Коцюбинського, 2
Досліджено зміни активності гваяколпероксидази (РОD) у відповідь на тепловий
стрес у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу (екотип Columbia 0) i в нокаутної
за геном каталази 2 (Саt2) мутантної лінії КО-Саt2, яка має знижену каталазну
активність. Встановлено, що в інтактних листках мутантних рослин, інкубованих
у буфері за кімнатної температури в темряві, активність РОD зростала й компен-
сувала втрату ізоформи САT2, проте відмінностей між активностями РОD у рос-
лин дикого типу й мутантів, які росли у ґрунті за оптимальних умов, не виявле-
но. Під дією помірного теплового стресу (37 °С) порівняно з кімнатною
температурою активність РОD підвищувалась за дії двогодинної обробки у рос-
лин дикого типу й одногодинної — у лінії КО-Саt2. Отже, залучений у відповідь
на тепловий стрес фермент бере участь у контролі внутрішньоклітинного рівня
пероксиду водню. Проте в умовах жорсткого теплового стресу (44 °С) захисна
функція РОD може обмежуватись частковою інактивацією ферменту.
Ключові слова: Arabidopsis thaliana, тепловий стрес, каталаза, гваяколпероксидаза,
ізоферменти.
Температура є одним із чинників навколишнього середовища, який
істотно впливає на рослини. Підвищення температури понад оптималь-
ний рівень порушує швидкість ферментативних реакцій у клітині, а по-
дальше її зростання супроводжується денатурацією багатьох білків, що
призводить до метаболічного дисбалансу й загибелі [26]. Відповідно
клітинна реакція на дію теплового стресу пов’язана зі швидким синте-
зом захисних білків теплового шоку, більша частина яких є молекуляр-
ними шаперонами, здатними стабілізувати інші білки й захищати їх від
денатурації [18].
Iншим аспектом теплового стресу є збільшення продукції в клітині
активних форм кисню (АФК), зокрема пероксиду водню, що може спри-
чинити вторинний оксидативний стрес [12, 15, 18]. Молекула пероксиду
водню найстабільніша серед представників АФК; вона порівняно легко
проникає крізь мембрани й пошкоджує біомолекули на значній відстані
від місця свого утворення [17]. Доведено також, що в Arabidopsis
thaliana L. в умовах помірного теплового стресу пероксид водню відіграє
роль сигнальної молекули і необхідний для ефективної активації екс-
пресії генів, які кодують білки теплового шоку, зокрема HSP17.6,
HSP18.2, та антиоксидантний фермент аскорбатпероксидазу 2 (АРХ2)
[19].
Рівень АФК у клітині контролюється антиоксидантними системами,
які включають низькомолекулярні антиоксиданти й антиоксидантні
© Т.О. РУСНАК, I.М. ДОЛIБА, Р.А. ВОЛКОВ, I.I. ПАНЧУК, 2013
246
ферменти [17]. У рослин у розщепленні пероксиду водню беруть участь
каталази (САТ) і пероксидази, а саме: аскорбатпероксидази (АРХ) та
«класичні» гваяколпероксидази (РОD) [21, 22, 24]. Ці ферменти пред-
ставлені в рослинній клітині кількома ізоформами. Наприклад, у
сім’ядолях соняшника виявлено вісім ізоформ САТ [11], у A. thaliana тa
Zea mays — по три [13, 21]. Серед ізоформ САТ A. thaliana найбільш екс-
пресованою є САТ2, на яку припадає 70 % загальної каталазної актив-
ності у тканинах мезофілу листків.
Мультигенна родина АРХ у A. thaliana складається з восьми ізоформ
[19], РОD кодується значно більшою кількістю генів, яких є щонаймен-
ше 73 у A. thaliana та 138 у Orysa sativa. Кодовані цими генами білки ви-
явлено в апопласті, клітинній стінці, вакуолях, цитозолі [24]. РОD ка-
талізують реакції, де пероксид водню є акцептором електронів і бере
участь в окисненні різних субстратів, зокрема фенолів та ароматичних
амінів [1, 17].
У наших попередніх дослідженнях встановлено, що тепловий стрес
активує в A. thaliana транскрипцію генів, які належать до родини АРХ.
Зокрема, АРХ2 схарактеризовано як білок теплового шоку нешапероно-
вої природи і висунуто припущення щодо його участі у захисті рослини
від термооксидативного стресу [20]. Пізніше було доведено, що цей ген
відіграє важливу роль у забезпеченні виживаності A. thaliana за дії підви-
щених температур [16]. На противагу цьому набагато менше відомо про
участь у забезпеченні термотолерантності рослин інших ферментів, які
розщеплюють пероксид водню, зокрема каталази і гваяколпероксидази.
Питання взаємодії між різними ферментними системами, роль ок-
ремих ізоформ у забезпеченні стійкості до стресу, здатність окремих
білків замінювати один одного протягом розвитку стресової реакції все
ще залишаються недостатньо дослідженими. Для прояснення ролі окре-
мих ізоформ САТ у захисті від теплового стресу та перевірки припущен-
ня, чи може РОD компенсувати втрату активності окремих ізоформ САТ
і брати участь у стресовій реакції ми дослідили зміни активності РОD у
листках A. thaliana дикого типу (ДТ) та в мутантної лінії КО-Саt2 за дії
підвищених температур.
Методика
Дослідження проводили на семитижневих рослинах Arabidopsis thalia-
na (L.) Heynh. екотипу Columbia 0 (дикий тип) та нокаутної мутантної
лінії КО-Саt2 (SALK 057998), отриманої з колекції NASC (Nottingham
Arabidopsis Stock Centre, University of Nottingham, Велика Британія). Ця
нокаутна лінія містить інсерцію Т-ДНК у кодувальній ділянці гена ката-
лази Саt2, що призводить до повної втрати його експресії.
Рослини вирощували в ґрунті за постійної температури 20 °С й
освітлення 2,5 клк в умовах 16-годинного світлового дня та відносної во-
логості повітря 60—70 %. Після 6,5 тижня температуру вирощування
підвищували до 28 °С і продовжували культивувати рослини ще 48 год.
У наших попередніх дослідженнях встановлено, що такий режим куль-
тивування посилює клітинну відповідь арабідопсису на тепловий стрес
[20].
Для стресової обробки відбирали по 5—6 лише добре розвинених
листків із середньої частини розетки; наймолодші та найстаріші листки
не використовували. Рослинні зразки обробляли на термостатованій во-
247
АКТИВНОСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗЫ У НОКАУТНОЙ ЛИНИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
дяній бані в конічних скляних колбах об’ємом 100 мл, в які вміщували
по 10—15 листків і наливали по 25 мл інкубаційного буферу (1 мМ
калій-фосфатний буфер, рН 6,0).
Теплову обробку рослин проводили в темряві протягом 1, 2 і 4 год
за температури +37 та +44 °С. Для вивчення процесів, що відбуваються
у фазу постстресової репарації, через 1 і 2 год після початку стресової об-
робки зразки переносили в камеру, де підтримували оптимальну для рос-
лин температуру +20 °С і продовжували інкубацію відповідно протягом
1 і 2 год. Контролем слугували зразки, інкубовані протягом зазначеного
часу в темряві за температури +20 °С.
Після завершення обробки рослинний матеріал заморожували в
рідкому азоті й зберігали у морозильній камері за температури –70 °С для
подальших досліджень. Як додатковий контроль використовували інтактні
листки, заморожені безпосередньо після відокремлення від рослини.
Білки екстрагували в буфері, що складався із 50 мМ натрій-фосфа-
ту (рН 7,0), 0,25 мМ ЕДТА, 10 % гліцерину, 2 % полівінілпіролідону-25 та
1 мМ аскорбату (АsA).
До 200 мкл охолодженого екстракційного буфера додавали 100 мг
замороженого рослинного матеріалу, гомогенізували й центрифугували
протягом 10 хв за 15 000 g і температури +4 °С; після цього відбирали
надосадову рідину та зберігали її на льоду до визначення активності
РОD.
Загальну активність РОD визначали спектрофотометрично
вимірюванням зміни оптичної густини проби за довжини хвилі 470 нм
[9]. Реакційна проба (1 мл) містила 25 мкл білкового екстракту і 975 мкл
реакційної суміші, що складалась із 25 мМ натрій-ацетатного буфера
(рН 5,0), 8 мМ гваяколу, 9 мМ Н2О2. Активність ферменту виражали в
мікромолях субстрату, розщепленого за 1 хв, в перерахунку на 1 мг білка.
Вміст білка в екстракті визначали спектрофотометрично за методом
Бредфорда [10]. Всі експерименти повторювали для п’яти незалежно ви-
рощених партій рослин. Кожне вимірювання ферментної активності
проводили у 3—4 паралельних пробах. Статистичну вірогідність отрима-
них результатів оцінювали з використанням двовибіркового t-критерію
для залежних вибірок [6].
Результати та обговорення
На першому етапі досліджень порівнювали активність РОD в інтактних
рослин ДТ і КО-Саt2, які не піддавали стресовій обробці. Встановлено,
що порівнювані лінії практично не відрізнялись за активністю РОD (ри-
сунок, а).
У наших попередніх дослідженнях виявлено, що в нокаутної лінії
КО-Саt2 повністю відсутня активність ізоформи САТ2, але ця втрата ча-
стково компенсується додатковою активацією ізоформи САТ3. Втім за-
гальна каталазна активність у листках нокаутних рослин знижена і ста-
новить 58 % рівня активності у рослин ДТ. При цьому активність АРХ
незначно зростала у рослин нокаутної лінії, які культивували за нестре-
сових умов [2]. Отримані нами нові дані свідчать, що подібно до АРХ ак-
тивність РОD також не зростала, тобто досліджені пероксидази — АРХ і
РОD — за нестресових умов не беруть участі в компенсації втрати САТ2.
Незважаючи на те що рослини КО-Саt2 мають знижену здатність роз-
щеплювати пероксид водню, згідно з нашими попередніми даними
248
Т.А. РУСНАК, И.Н. ДОЛИБА, Р.А. ВОЛКОВ, И.И. ПАНЧУК
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
рівень пероксидного окиснення ліпідів мембран у них не підвищувався
[3]. Отже, у КО-Саt2 активуються інші механізми, які компенсують втра-
ту активності ізоформи САТ2.
Оскільки тепловий стрес призводить до зростання рівня пероксиду
водню в A. thaliana [19], було досліджено, чи змінюється активність РОD
у рослин, підданих тепловій обробці. Встановлено, що помірний (37 °С)
249
АКТИВНОСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗЫ У НОКАУТНОЙ ЛИНИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
Гваяколпероксидазна активність (мкмоль/(мг білка · хв)) у листках рослин Arabidopsis
thaliana дикого типу та нокаутної лінії КО-Саt2 за дії помірного (а, 37 °С) і жорсткого (б,
44 °С) теплового стресу. *Різниця вірогідна: між контрольними та інтактними рослинами
(р < 0,05); **між підданими стресу й контрольними рослинами (р < 0,05); ***між піддани-
ми стресу рослинами й рослинами у фазу післястресового відновлення (р < 0,05)
тепловий стрес протягом 1 год порівняно з контролем (інкубація за
кімнатної температури) спричинював підвищення активності РОD на
22 % у рослин ДТ і на 25 % у КО-Саt2 (див. рисунок, а). За двогодин-
ної помірної теплової обробки активність РОD зростала лише у рослин
ДТ, а в КО-Саt2 залишалась на рівні контрольних значень. Подальша
стресова обробка рослин (4 год, 37 °С) призводила до зниження актив-
ності РОD на 26 % у рослин ДТ і на 29 % — у мутантної лінії.
За дії жорсткого теплового стресу (44 °С) характер змін активності
РОD в обох досліджених ліній арабідопсису відрізнявся від такого за дії
помірної стресової обробки (див. рисунок, б). У рослин ДТ активність
РОD після жорсткого стресу протягом 1 і 2 год практично не змінюва-
лась, але через 4 год обробки за 44 °С активність ферменту знижувалась
на 49 % порівняно з контролем.
На противагу рослинам ДТ у КО-Саt2 лінії інактивація РОD за дії
жорсткого стресу розпочиналась раніше: вже через 1 год активність
ферменту знижувалась на 15 %. З подовженням теплової обробки до
2 і 4 год активність ферменту знижувалась відповідно на 26 і 46 %
порівняно зі значеннями, зафіксованими для контрольних зразків.
Iмовірним поясненням зниження активності РОD може бути інакти-
вація ферменту в умовах теплового стресу за відсутності достатнього
компенсаторного синтезу нових молекул. На користь такого пояснення
свідчить те, що максимальне зниження активності РОD спостерігалось
за найтривалішої обробки (4 год), причому за 44 °С фермент інактиву-
вався сильніше, ніж за 37 °С.
Попередньо ми дослідили вплив теплового стресу на арабідопсис
ДТ із застосуванням інкубаційного буфера, що додатково містив 1 %
цукрози [8]. Встановлено, що після обробки листків протягом 2 год за
37 °С активність РОD зростала на 27 %, за 44 °С — на 16 %. Статистич-
но вірогідне зниження активності ферменту не спостерігалось у жодно-
му з варіантів досліду. Отже, склалось враження, що цукроза здатна
відігравати роль стабілізатора активності РОD за умов теплового стресу.
Проте це питання потребує детальніших досліджень.
Згідно з отриманими результатами, РОD у A. thaliana є відносно
термолабільним білком, який може поступово інактивуватись за дії жор-
сткого теплового стресу. Проте РОD — термостабільніший фермент, ніж
АРХ, активність якої за дії 4-годинного жорсткого теплового стресу
зменшується на 69 % у рослин ДТ екотипу Columbia 0 і на 88 % — у еко-
типу С24 [4, 20] навіть при проведенні інкубації листків за наявності
1 % цукрози.
Слід зазначити, що результати, отримані для A. thaliana, відрізня-
ються від раніше отриманих нами даних для кукурудзи [7]. Зокрема по-
казано, що інкубація листків Zea mays в умовах жорсткого теплового
стресу (44 °С) протягом 2 год зумовлювала зростання активності РОD
приблизно на 60 %, тоді як помірний тепловий стрес не викликав істот-
них змін активності РОD. Відмінність у стресовій реакції цих видів мож-
на розглядати як елемент адаптації кукурудзи до теплішого клімату.
У фазу одногодинної репарації після помірного теплового стресу
(1 год, 37 °С + 1 год, 20 °С) у рослин ДТ і КО-Саt2 відмічено зниження
активності РОD до рівня рослин, інкубованих за кімнатної температури.
Це може бути пов’язано з нормалізацією рівня пероксиду водню у кліти-
нах листків. На стадії двогодинного відновлення після двогодинного
помірного стресу активність РОD у ДТ була нижчою порівняно з групою
250
Т.А. РУСНАК, И.Н. ДОЛИБА, Р.А. ВОЛКОВ, И.И. ПАНЧУК
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
рослин, що зазнали дії двогодинного теплового стресу. Проте у КО-Саt2
активність РОD на стадії відновлення не зменшувалась, що вказує на за-
тримку в роботі репаративних механізмів у мутанта.
У фазу одногодинного відновлення після одногодинної жорсткої
теплової обробки у ДТ активність РОD не змінювалась. Нагадаємо, що
в цьому варіанті теплового стресу (1 год, 44 °С) активність РОD залиша-
лась на рівні значень контрольних рослин, інкубованих протягом 1 год
за 20 °С (див. рисунок, б). Iнакше кажучи, у ДТ ані стресова обробка
протягом 1 год за 44 °С, ані наступне відновлення протягом 1 год за 20 °С
не викликали статистично вірогідних змін активності РОD. Iнша карти-
на спостерігалась для лінії КО-Саt2: після одногодинного відновлення
відмічено зростання активності РОD на 21 % порівняно з рослинами зі
зниженим рівнем активності цього ферменту внаслідок обробки за 44 °С
протягом 1 год.
У фазу двогодинного постстресового відновлення як у рослин ДТ,
так і нокаутної лінії КО-Саt2 не виявлено вірогідних змін активності
РОD порівняно з рослинами, інкубованими за температури 44 °С.
Слід зауважити, що в контрольних зразках рослин КО-Саt2, інкубо-
ваних за нестресової температури протягом 1, 2 і 4 год, виявлено тен-
денцію до зростання активності РОD порівняно з інтактними рослина-
ми. Унаслідок цього різниця між значеннями активності у ДТ і КО-Саt2
поступово збільшувалась і ставала статистично вірогідною.
Відомо, що в рослин РОD є функціонально лабільним ферментом,
який реагує на порушення клітинного гомеостазу за дії різноманітних
стресорів. Пероксидазна активність підвищувалась за впливу водного
дефіциту, високої й низької температур, механічних пошкоджень, у про-
цесі старіння, при патогенезі [5, 14, 23, 25]. Диференційні зміни в набо-
рах ізоферментів за дії низько- і високотемпературного стресу виявлено
у злаків [5, 7].
Отримані нами результати підтверджують, що в нокаутних КО-Саt2
рослин арабідопсису можливе активування РОD, що компенсує
відсутність ізоформи САТ2. Проте таке активування має місце лише за
певних умов (у нашому випадку — за інкубації в темряві при 20 °С), тоді
як у листках рослин, що зростали в ґрунті в умовах кліматичної камери,
активність РОD у ДТ і КО-Саt2 була однаковою.
Крім того, в A. thaliana індукція РОD спостерігається на ранній
стадії (1—2 год) відповіді на дію помірного теплового стресу. В умовах
тривалішої дії (4 год) жорсткого теплового стресу захисна функція РОD
може ослаблюватись унаслідок часткової інактивації ферменту. Ме-
ханізми, що впливають на стабільність РОD в умовах теплового стресу,
потребують додаткового вивчення.
1. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма дейст-
вия пероксидаз растений // Успехи биол. химии. — 2006. — 46. — С. 303—322.
2. Доліба I.М., Волков Р.А., Панчук I.I. Активність каталази та аскорбатпероксидази у Саt2
нокаутного мутанта Arabidopsis thaliana за дії іонів кадмію // Вісн. Укр. т-ва генетиків і
селекціонерів. — 2011. — 9, № 2. — С. 200—209.
3. Доліба I.М., Волков Р.А., Панчук I.I. Вплив іонів міді на перекисне окислення ліпідів у Саt2
нокаутного мутанту Arabidopsis thaliana // Там само. — 2012. — 10, № 1. — С. 13—19.
4. Доліба I.М., Руснак Т.О., Волков Р.А., Панчук I.I. Підвищена активність аскорбат перок-
сидази у подвійного мутанта Arabidopsis thaliana за генами Саt2 та Саt3 // Там само. —
2011. — 9, № 1. — С. 3—9.
5. Капустян А.В., Кучеренко В.П., Панюта О.О. Активність пероксидази та зміна її ізофер-
ментних форм за умов низькотемпературного стресу // Физиология и биохимия культ.
растений. — 2004. — 36, № 1. — С. 55—63.
251
АКТИВНОСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗЫ У НОКАУТНОЙ ЛИНИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
6. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с.
7. Пиріжок Р.Ю., Волков Р.А., Панчук I.I. Активність пероксидази проростків кукурудзи в
умовах теплового стресу // Физиология и биохимия культ. растений. — 2008. — 40,
№ 1. — С. 1—6.
8. Пиріжок Р.Ю., Волков Р.А., Панчук I.I. Температурнозалежна активність гваяколперок-
сидази у АРХ2 нокаут-мутантів арабідопсису // Вісн. Укр. т-ва генетиків і се-
лекціонерів. — 2008. — 6, № 2. — С. 275—281.
9. Amako K., Chen G., Asada K. Separate assays for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxi-
dase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants // Plant
Cell Physiol. — 1994. — 35. — P. 497—504.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — 72. —
P. 248—254.
11. Eising R., Trelease R.N., Ni W. Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaftype peroxisomes
of sunflower cotyledons // Arch. Biochem. Biophys. — 1990. — 278. — P. 258—264.
12. Fedoroff N. Redox regulatory mechanisms in cellular stress responses // Ann. Bot. — 2006. —
98. — P. 289—300.
13. Frugoli J., Nuccio M. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana // Plant
Physiol. — 1996. — 112. — P. 327—336.
14. Garcia-Lara S., Arnason J.T., Diaz-Pontones D. et al. Soluble peroxidase activity in maize
endosperm associated with maize weevil resistance // Crop. Sci. — 2007. — 47. — P. 1125—
1130.
15. Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tole-
rance in crop plants // Plant Physiol. Biochem. — 2010. — 48. — P. 909—930.
16. Larkindale J., Vierling E. Core genome responses involved in acclimation to high tempera-
ture // Plant Physiol. — 2008. — 146. — P. 748—761.
17. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M. Reactive oxygen gene network of plants // Trends
Plant Sci. — 2004. — 9. — P. 490—498.
18. Nobuhiro S., Mittler R. Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance
between signaling and destruction // Physiol. plant. — 2006. — 126. — P. 45—51.
19. Panchuk I.I., Volkov R.A., Mullineaux P.M., Schoeffl F. Heat stress-induced H2O2 is required
for effective expression of heat shock genes in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. — 2006. —
61. — P. 733—746.
20. Panchuk I.I., Volkov R.A., Schoeffl F. Heat stress — and HSF-dependent expression and acti-
vity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis // Plant Physiol. — 2002. — 129. — P. 838—853.
21. Scandalios J.G., Guan L., Polidoros A.N. Catalases in plants: gene structure, properties, regu-
lation, and expression / J.G. Scandalios (ed.) Oxidative stress and molecular biology of anti-
oxidant defenses. — N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997. — P. 343—406.
22. Shigeoka S., Ishikawa T., Tamoi M. et al. Regulation and function of ascorbate peroxidase
isoenzymes // J. Exp. Bot. — 2002. — 53. — P. 1305—1319.
23. Sofo A., Dichio B., Xiloyannis C., Masia A. Antioxidant defenses in olive trees during drought
stress: changes in activity of some antioxidant enzymes // Functional Plant Biol. — 2005. —
32. — P. 45—53.
24. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P. Analysis and expression of the class III peroxi-
dase large gene family in Arabidopsis thaliana // Gene. — 2002. — 288. — P. 129—138.
25. Veljovic-Jovanovic S., Kukavica B., Stevanovic B. Senescence- and drought-related changes in
peroxidase and superoxide dismutase isoforms in leaves of Ramonda serbica // J. Exp. Bot. —
2006. — 57. — P. 1759—1768.
26. Wahid A., Gelani S., Ashraf M., Foolad M.R. Heat tolerance in plants: An overview // Environ.
Exp. Bot. — 2007. — 61. — P. 199—223.
Отримано 05.07.2012
АКТИВНОСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗЫ У НОКАУТНОЙ ЛИНИИ КО-Саt2
ARABIDOPSIS THALIANA ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА
Т.А. Руснак, И.Н. Долиба, Р.А. Волков, И.И. Панчук
Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича
Изучены изменения активности гваяколпероксидазы (РОD) в ответ на тепловой стресс у
растений Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Columbia 0) и нокаутной по гену катала-
зы 2 (Саt2) мутантной линии КО-Саt2, которая имеет пониженную каталазную активность.
252
Т.А. РУСНАК, И.Н. ДОЛИБА, Р.А. ВОЛКОВ, И.И. ПАНЧУК
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
Установлено, что в интактных листьях мутантных растений, которые инкубировались в бу-
фере при комнатной температуре в темноте, активность РОD возрастала и компенсирова-
ла потерю изоформы САТ2, однако отличия активностей РОD у растений дикого типа и
мутантов, которые росли в почве при оптимальных условиях, не обнаружены. Под воздей-
ствием умеренного теплового стресса (37 °С) по сравнению с комнатной температурой ак-
тивность РОD повышалась после двухчасовой обработки у растений дикого типа и одно-
часовой — у линии КО-Саt2. Следовательно, фермент вовлечен в ответ на тепловой стресс
путем участия в контроле внутриклеточного уровня пероксида водорода. Однако в услови-
ях жесткого теплового стресса (44 °С) защитная функция РОD может быть ограничена ча-
стичной инактивацией фермента.
GUAIACOL PEROXIDASE ACTIVITY IN Cat2 KNOCK-OUT MUTANT OF
ARABIDOPSIS THALIANA UPON HEAT STRESS TREATMENT
T.O. Rusnak, I.M. Doliba, R.A. Volkov, I.I. Panchuk
Yuri Fedkovych Chernivtsi National University
2 Kotsiubynskoho St., 58012 Chernivtsi, Ukraine
Changes in guaiacol peroxidase (POD) activity upon heat stress were evaluated in wild type plants
of Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia 0) and in catalase 2 (Cat2) knock-out mutant KO-Cat2,
which demonstrates reduced catalase activity. It was found that in leaves of the mutant plants incu-
bated in buffer at room temperature in dark activity of POD was increased compensating the lack
of CAT2 isoform. However, no differences in POD activity were found between the wild type and
mutant plants growing on soil at non-stressful conditions. Upon moderate (37 °C) heat treatment
comparing to room temperature activity of POD was increased during 2 hours in wild type and
during 1 hour in KO-Cat2 plants. Accordingly, the enzyme appears to be involved in heat stress
response via the control of intracellular level of hydrogen peroxide. However, upon severe (44 °C)
heat stress the protective function of POD can be limited due to partial inactivation of the enzyme.
Key words: Arabidopsis thaliana, heat stress, catalase, guaiacol peroxidase.
253
АКТИВНОСТЬ ГВАЯКОЛПЕРОКСИДАЗЫ У НОКАУТНОЙ ЛИНИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2013. Т. 45. № 3
|