Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні

Проведено молекулярно-генетичне обстеження у 27 пацієнтів з хворобою Гоше із 26 родин. Досліджено мажорні мутації в гені GBA – N370S, L444P та 84GG. Сумарна частка мажорних мутацій склала майже 58 % , частка алелів, що несуть мутацію N370S – 42,3 %, мутацію L444P – 15,4 %. Не було виявлено жодного а...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2007
Автори:	Горовенко, Н.Г., Ольхович, Н.В., Недобой, А.М., Пічкур, Н.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2007
Назва видання:	Цитология и генетика
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66570
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні / Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-66570
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-665702014-07-19T03:01:40Z Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні Горовенко, Н.Г. Ольхович, Н.В. Недобой, А.М. Пічкур, Н.О. Оригинальные работы Проведено молекулярно-генетичне обстеження у 27 пацієнтів з хворобою Гоше із 26 родин. Досліджено мажорні мутації в гені GBA – N370S, L444P та 84GG. Сумарна частка мажорних мутацій склала майже 58 % , частка алелів, що несуть мутацію N370S – 42,3 %, мутацію L444P – 15,4 %. Не було виявлено жодного алеля, який би містив мутацію 84GG. Серед інших мутацій в гені GBA було знайдено рідкісні мутації P178S, W184R та Rec Nci I (усі в компаунді з N370S) у пацієнтів з ненейронопатичною формою захворювання, а також генотипи G377S/c 999GA та D409H/R120W/G202R у пацієнтів з хронічною нейронопатичною формою. Аналіз співвідношення генотипу та перебігу захворювання у пацієнтів показав, що генотип-фенотипові кореляції близькі до описаних для європейських популяцій. The molecular diagnostics of 27 from 26 Ukrainian families has been performed. The common mutations in GBA gene (N370S, L444P and 84GG) accounted for up to 58 % of all cases: mutation N370S was detected in 42,3 % alleles, mutation L444P was observed in 15,4 % alleles and mutation 84GG was not found at all. The other mutations were: P178S, W184R and Rec Nci I (in compounds with N370S) in the patients with nonneuronopathic form of Gaucher disease, and the genotypes G377S/c 999G → A and D409H/R120W/G202R were detected in patients with chronic neuronopathic form of Gaucher disease. The data analysis of the genotype and disease progression in the patients allows confirming the known genotypephenotype correlation. 2007 Article Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні / Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 29 назв. — укр. 0564-3783 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66570 616–056.7–053.2–07 uk Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Горовенко, Н.Г. Ольхович, Н.В. Недобой, А.М. Пічкур, Н.О. Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні Цитология и генетика
description	Проведено молекулярно-генетичне обстеження у 27 пацієнтів з хворобою Гоше із 26 родин. Досліджено мажорні мутації в гені GBA – N370S, L444P та 84GG. Сумарна частка мажорних мутацій склала майже 58 % , частка алелів, що несуть мутацію N370S – 42,3 %, мутацію L444P – 15,4 %. Не було виявлено жодного алеля, який би містив мутацію 84GG. Серед інших мутацій в гені GBA було знайдено рідкісні мутації P178S, W184R та Rec Nci I (усі в компаунді з N370S) у пацієнтів з ненейронопатичною формою захворювання, а також генотипи G377S/c 999GA та D409H/R120W/G202R у пацієнтів з хронічною нейронопатичною формою. Аналіз співвідношення генотипу та перебігу захворювання у пацієнтів показав, що генотип-фенотипові кореляції близькі до описаних для європейських популяцій.
format	Article
author	Горовенко, Н.Г. Ольхович, Н.В. Недобой, А.М. Пічкур, Н.О.
author_facet	Горовенко, Н.Г. Ольхович, Н.В. Недобой, А.М. Пічкур, Н.О.
author_sort	Горовенко, Н.Г.
title	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні
title_short	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні
title_full	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні
title_fullStr	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні
title_full_unstemmed	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні
title_sort	визначення частоти мажорних мутацій в гені gba у пацієнтів з хворобою гоше в україні
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2007
topic_facet	Оригинальные работы
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66570
citation_txt	Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні / Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.
series	Цитология и генетика
work_keys_str_mv	AT gorovenkong viznačennâčastotimažornihmutacíjvgenígbaupacíêntívzhvoroboûgoševukraíní AT olʹhovičnv viznačennâčastotimažornihmutacíjvgenígbaupacíêntívzhvoroboûgoševukraíní AT nedobojam viznačennâčastotimažornihmutacíjvgenígbaupacíêntívzhvoroboûgoševukraíní AT píčkurno viznačennâčastotimažornihmutacíjvgenígbaupacíêntívzhvoroboûgoševukraíní
first_indexed	2025-07-05T16:48:02Z
last_indexed	2025-07-05T16:48:02Z
_version_	1836826317403717632
fulltext	41 Проведено молекулярно�генетичне обстеження у 27 пацієнтів з хворобою Гоше із 26 родин. Досліджено ма� жорні мутації в гені GBA – N370S, L444P та 84GG. Су� марна частка мажорних мутацій склала майже 58 %, частка алелів, що несуть мутацію N370S – 42,3 %, му� тацію L444P – 15,4 %. Не було виявлено жодного алеля, який би містив мутацію 84GG. Серед інших мутацій в гені GBA було знайдено рідкісні мутації P178S, W184R та Rec Nci I (усі в компаунді з N370S) у пацієнтів з не� нейронопатичною формою захворювання, а також гено� типи G377S/c 999GA та D409H/R120W/G202R у пацієн� тів з хронічною нейронопатичною формою. Аналіз спів� відношення генотипу та перебігу захворювання у пацієн� тів показав, що генотип�фенотипові кореляції близькі до описаних для європейських популяцій. Вступ. Хвороба Гоше (ХГ) належить до лі� зосомних хвороб накопичення з аутосомно� рецесивним типом успадкування і обумовлена мутаціями в гені глюкоцереброзидази. Дефі� цит глюкоцереброзидазної активності, який виникає внаслідок цих мутацій, призводить до накопичення нерозщепленого глюкозил� цераміду в лізосомах клітин, що спричиняє порушення функції макрофагів. В результаті виникає полісистемне захворювання, основ� ними клінічними ознаками якого є гепатоспле� номегалія, панцитопенія та ураження кістко� вої тканини. Частота ХГ в різних популяціях становить від 1 : 40 000 до 1 : 60 000 [1], а в по� пуляції євреїв ашкеназі – 1 : 850 [2, 3]. Ген глюкоцереброзидази (GBA) локалізова� ний на довгому плечі хромосоми 1 в положенні q21 і має довжину 7 тис. п.н. Він налічує 11 ек� зонів та 10 інтронів, довжина кДНК – 2,5 тис. п.н. [4]. На відстані 16 тис. п.н. від функціо� нального гена GBA розташований псевдоген (psGBA), який має довжину 5 тис. п.н. Структур� но псевдоген має як екзони, так і інтрони та виник, вірогідно, еволюційно шляхом тандем� ної дуплікації GBA. Деякі мутації функціональ� ного гена GBA, які є причиною виникнення ХГ, присутні також і в псевдогені, що сприяє ген� ній конверсії та рекомбінації між функціональ� ним геном та псевдогеном. Це вказує на фун� даментальну роль псевдогена в утворенні мута� цій у гені GBA. На сьогодні вже описано близько 200 му� тацій в гені GBA [5]. Серед них присутні всі ти� пи мутацій, а саме місенс� та нонсенс�мутації, сплайсингові мутації, делеції та інсерції, ком� біновані мутації та рекомбінації у межах локу� су. Мутації в різних ділянках гена виникають з різною частотою та істотно відрізняються за функціональним значенням: або призво� дять до повної відсутності ферментативної ак� тивності, або лише незначним чином зміню� ють структуру протеїна, і тоді спостерігається певна залишкова ферментативна активність. Тому ХГ, як і більшість спадкових хвороб об� міну, характеризується значним клінічним по� ліморфізмом [6]. Першим етапом молекулярно�генетичного аналізу, як правило, є скринінг мажорних му� тацій [3]. За даними літератури, найчастішими в гені GBA вважаються мутації N370S, L444P, 84GG, D409H, IVS2+1, R496H [6–9]. Сумарна частка таких мутантних алелів складає близько ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 © Н.Г. ГОРОВЕНКО, Н.В. ОЛЬХОВИЧ, А.М. НЕДОБОЙ, Н.О. ПІЧКУР, 2007 УДК 616–056.7–053.2–07 Н.Г. ГОРОВЕНКО 1, Н.В. ОЛЬХОВИЧ 2, А.М. НЕДОБОЙ 2, Н.О. ПІЧКУР 1 1 Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, Київ 2 Медико-генетичний центр УДСЛ «ОХМАТДИТ» МОЗ України, Київ ВИЗНАЧЕННЯ ЧАСТОТИ МАЖОРНИХ МУТАЦІЙ В ГЕНІ GBA У ПАЦІЄНТІВ З ХВОРОБОЮ ГОШЕ В УКРАЇНІ Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур 42 96 % в популяції євреїв ашкеназі та близько 75 % в неєврейських популяціях [9]. У пацієн� тів, які не мають єврейського походження, най� частіше (70 % випадків) зустрічаються мутації N370S, L444P та 84GG. Метою нашої роботи було виявлення ма� жорних мутацій N370S, L444P та 84GG в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні. Матеріали та методи. Було обстежено 27 па� цієнтів слов’янського походження з 26 родин із різних регіонів України. Використовували клі� нічні, біохімічні, морфологічні та молекулярно� генетичні методи дослідження. Клінічне обстеження включало збір анам� незу, оцінку фенотипу пацієнтів та даних їхніх параклінічних досліджень, побудову родоводу з наступним генеалогічним аналізом. Ферментативну активність глюкоцеребрози� дази визначали в лейкоцитах периферійної крові, хітотриозидази – в плазмі. Лейкоцити виділяли після обробки цільної крові 3 %�ним розчином декстрану, як описано Венгер та ін. [10]. Кількість білка в лейкоцитах визначали за стандартним методом Лоурі [11]. Глюкоце� реброзидазну активність в лізаті лейкоцитів оцінювали за деградацією флюорогенного суб� страту 4�метилумбелліферил�β�D�глюкопіра� нозиду (Sigma) за методом Сузукі [12]. Хітотри� озидазну активність плазми визначали за мето� дом Гуо та ін. [13]. Результати вираховували для глюкоцереброзидазної активності у нмоль/ год/мг білка, для хітотриозидазної активності – у нмоль/год/мл плазми. Інтерпретацію резуль� татів ферментативних досліджень проводили у відповідності до алгоритма, запропонованого Горовенко та ін. [14, 15]. ДНК виділяли із цільної гепаринізованої крові з використанням комерційного набору «ДНК�сорб В» (ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ). Якість препаратів ДНК перевіряли методом оцінки співвідношення оптичної щільності при 260 та 280 нм, яка визначалась на спектро� фотометрі Specord�40 (Analytik Jena AG). Пре� парати ДНК зберігали при температурі +4 °С. Молекулярно�генетичне дослідження прово� дили за методом «гніздової» ПЛР [16]. На пер� шому етапі проводили ампліфікацію великої ді� лянки функціонального гена GBA, яка відпові� дає послідовності 8–11 екзонів. Для ампліфіка� ції використовували олігонуклеотидний прай� мер А: 5'�ACCACCTAGAGGGGAAAGTG�3', праймер B: 5'�TGTGTGCAAGGTCCAGGATC� AG�3' [17]. ПЛР проводили в об’ємі 50 мкл при стандартних умовах за допомогою автоматич� ного ампліфікатора Perkin Elmer (США) з ви� користанням «гарячого» старту. На другому етапі, використовуючи отрима� ний фрагмент як матрицю, ампліфікували ді� лянки: 1) для детекції мутації N370S – прайме� ри 370F: 5'�CCTTTGTCTCTACCCTСGA�3' та 370R: 5'�GACAAAGTTACGCACCCAATT�3', температура відпалювання – 52 °С; 2) для де� текції мутації L444P – праймери 444F: 5'�CA� ATTGGGTGCGTAACTTTGT�3' та 444R: 5'� TGCCCTCACCGGTTTAGC�3', температура відпалювання – 53 °С. Для детекції мутації 84GG проводили амплі� фікацію ділянки 2�го екзону – праймери 84F: 5'�GGAATGTCCCAAGCCTTTGA�3' та 84R: 5'�CACTGCCTGAAGTAGAAG�3', температура відпалювання – 52 °С. Для ідентифікації вказаних мутацій вико� ристовували метод рестрикційного аналізу, який проводили за стандартним методом з ви� користанням ендонуклеаз рестрикції Xho1, Msp1, Bsa B1(MBI Fermentas) відповідно. Реак� цію рестрикції проводили в суміші такого скла� ду: 18 мкл ампліфікату, 0,2 мкл ферменту ре� стрикції і 2 мкл відповідного буфера. Інкуба� цію проводили в мікротермостаті при 37 °С протягом 2 год. Зупиняли реакцію додаванням 0,4 мкл 0,5 М ЕДТА, рН 7,5. Аналіз продукту першого етапу «гніздової» ПЛР проводили за допомогою електрофорезу в 1,5%�ному агарозному гелі, а продуктів ре� стрикційного аналізу – методом електрофоре� зу в 8� та 20%�ному поліакриламідному гелі з подальшим забарвленням розчином бромис� того етидію в концентрації 10 г/л. Візуалізацію та реєстрацію результатів елект� рофорезу проводили за допомогою ультрафіо� летового трансілюмінатора та відеосистеми з комп’ютерною програмою аналізу зображення «Біотест�А» («Біоком», Росія). Результати досліджень та їх обговорення. Нами було проаналізовано результати обсте� ження групи пацієнтів із 26 родин (в одній ро� дині обстежено двоє хворих сибсів) з різних регіонів України. Вік пацієнтів становив від 9 місяців до 51 року, з них 19 осіб жіночої ста� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів ... 43 ті та 8 осіб чоловічої статі. Всім пацієнтам на підставі характерної клінічної картини та наяв� ності клітин Гоше в аспіратах кісткового мозку попередньо було виставлено клінічний діагноз – хвороба Гоше. У більшості пацієнтів (48 %) маніфестація клінічних проявів ХГ припадала на вік від 3 до 8 років, у 37 % випадків хвороба маніфес� тувала до 3 років і у 15 % – у віці більше 8 ро� ків. Початковими клінічними симптомами за� хворювання були гепатоспленомегалія (52 %), первинні ознаки панцитопенії (32 %), кісткові кризи (16 %). За клінічною характеристикою появи симптомів та ступенем тяжкості роз� витку хвороби було визначено, що у більшості пацієнтів (24 із 27) мав місце тип ХГ, ненейро� нопатична форма, а у 3 осіб – ІІІ тип, хроніч� на нейронопатична форма. Для остаточного підтвердження діагнозу всі пацієнти були направлені до лабораторії медич� ної генетики Медико�генетичного центру УДСЛ «ОХМАТДИТ». З метою встановлення біохімічного дефекту було проведено визна� чення глюкоцереброзидазної активності в лей� коцитах та хітотриозидазної активності в плаз� мі крові. При аналізі глюкоцереброзидазної ак� тивності у переважної більшості пацієнтів (25 із 27) було виявлено зниження активності цьо� го ферменту порівняно з контрольними зна� ченнями, проте у плазмі крові всіх обстежених пацієнтів було виявлено патологічно високі значення хітотриозидазної активності [14]. Це дозволило остаточно підтвердити діагноз ХГ всім 27 пацієнтам. При детальному порівнянні значень глюко� цереброзидазної активності не було виявлено залежності між рівнем залишкової активності та тяжкістю клінічного перебігу захворюван� ня, що збігається з даними літератури [18]. Особливість молекулярної діагностики ХГ полягає в існуванні поруч з функціональним геном GBA псевдогена psGBA, що призводить до можливості утворення кросоверних обмінів між ними. Виникає необхідність чіткої локалі� зації виявленого мутантного алеля – він може знаходитись як у функціональному гені, так і у псевдогені, тобто при виявленні такої мута� ції у пацієнта без підтвердження її локалізації саме у функціональному гені виникає ймовір� ність хибнопозитивної діагностики ХГ, що під� вищує невиправдані витрати на діагностичні та подальші лікувальні заходи. У 1988 р. Горовіц з співавт. [4] проводили де� тальне дослідження структури гена GBA та псевдогена psGBA і показали, що ці два гени мають до 96 % гомології в кодувальній части� ні, тоді як деякі фрагменти інтронів гена GBA відсутні в psGBA. До них належать фрагменти 313 п.н. в другому інтроні, 626 п.н. в четверто� му, 320 п.н. в шостому та 277 п.н. в сьомому інтроні. Крім того, за всією довжиною псевдо� гена зустрічаються однонуклеотидні заміни по відношенню до послідовності функціональ� ного гена. Це дає можливість підібрати прай� мери для ампліфікації таким чином, щоб їхнє відпалювання відбувалося лише на гені GBA. Особливу увагу було сконцентровано на ре� гіоні, що охоплює ділянку з 8�го по 11�й екзо� ни. У цьому регіоні локалізовані дві найчасті� ші мутації, асоційовані з ХГ – N370S та L444P [5]. Для уникнення впливу псевдогена psGBA на результати молекулярно�генетичного аналі� зу мутацій, в гені GBA було використано метод «гніздової» ПЛР, перша ампліфікація якої про� ходить виключно на функціональному гені GBA [17]. В інтроні 7 функціонального гена в позиції 5202 розташовано цитозин, тоді як у відповідній позиції псевдогена – тимін. Ця однонуклеотид� на заміна не дозволяє проводити відпалюван� ня праймера А на матриці псевдогена. Отже, відпалювання праймера проходить виключно на матриці функціонального гена GBA. Отри� маний фрагмент використовували для подаль� шого скринінгу мажорних мутацій в гені GBA. Для визначення мутації N370S використову� вали праймери 370R та 370F. В результаті про� ведення реакції ампліфікації утворюється фраг� мент розміром 106 п.н., який в нормі не має сайту впізнавання для рестриктази Xho1. Замі� на аденіна на гуанін у позиції 1226 кДНК при� зводить до утворення сайту впізнавання для цієї рестриктази, в результаті чого фрагмент розщеплюється на дві частини – 86 та 20 п.н. (рис. 1). Експресія іn vitro гена GBA з цією му� тацією в клітинах комах показала, що знижен� ня специфічної активності ферменту, що син� тезується, обумовлено активацією негативно заряджених фосфоліпідів [19]. Для визначення мутації L444P використову� вали праймери 444R та 444F. В результаті про� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур 44 ведення реакції ампліфікації утворюється фраг� мент розміром 583 п.н., який в нормі не має сайту впізнавання для рестриктази MspI. Заміна тиміну на цитозин в позиції 1448 кДНК при� зводить до утворення сайту впізнавання для цієї рестриктази, в результаті чого фрагмент розще� плюється на дві частини – 495 та 88 п.н. (рис. 2). Лейцин в положенні 444 розташований у каталітичному домені глюкоцереброзидази, то� му порушення структури білка у цьому районі призводить до нестабільності, яка спричиняє дуже низьку залишкову активність ферменту [19]. Це пояснює тенденцію до ускладнень у перебігу захворювання або появи неврологіч� них проявів у хворих з мутацією L444P, особ� ливо в гомозиготному стані. В 1990 р. Бьойтлер та ін. [19] описали інсер� цію одиничного гуаніну в позиції 84 кДНК в другому екзоні гена GBA, яка призводить до зсуву рамки зчитування та передчасної терміна� ції транскрипції. Для визначення мутації 84GG використовували праймери 84F та 84R. В ході реакції ампліфікації утворюється фрагмент дов� жиною 75 п.н., який в нормі не має сайту впіз� навання для ендонуклеази BsaBI. Інерція 84GG призводить до утворення сайту впізнавання для цієї рестриктази, в результаті чого фрагмент розщеплюється на дві частини – 57 та 18 п.н. Аналіз результатів проведеного нами моле� кулярного обстеження пацієнтів ХГ (табл. 1) показав, що частка алелів, що несуть мутацію N370S, була найбільшою і склала 22/52 (42,3 %). Чотири пацієнти були гомозиготними носія� ми цього алеля, 14 пацієнтів – гетерозиготами і мали в другому алелі іншу мутацію. У восьми пацієнтів не було виявлено жодного алеля з мутацією N370S. Частка алелів, що несуть мутацію L444P, у обстежених нами пацієнтів з ХГ становила 8/52 (15,4 %). В нашій групі не було знайдено жодного пацієнта, гомоалельного за мутацією L444P. Компаундних гетерозигот серед наших пацієнтів було 8 осіб, з яких 6 мали генотип N370S/L444P. Молекулярно�генетичний аналіз, проведе� ний нами у пацієнтів з ХГ в Україні, не виявив жодного алеля з мутацією 84GG. Цю мутацію досить часто знаходять як одиничну копію у комплексних гетерозигот. Частота цього пато� логічного алеля серед пацієнтів єврейського походження становить 13 %. Спектр мутацій в гені GBA серед пацієнтів з ХГ в різних популяціях істотно відрізняється. Існують певні етнічні особливості і за частотою мажорних мутацій (табл. 2). Середньоєвропей� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Рис. 1. Електрофореграма детекції мутації N370S в гені GBA: М – маркер молекулярної маси (100 bp, «Fer� mentas»); no/no – відсутність мутації N370S в обох але� лях; N370S/no – гетерозигота за мутацією N370S; N370S/N370S – гомозигота за мутацією N370S. Зраз� ки оброблені рестриктазою Xho1 Рис. 2. Електрофореграма детекції мутації L444P в ге� ні GBA: М – маркер молекулярної маси (100 bp, «Fermentas»); 2, 4 – гетерозигота за мутацією L444P; 1, 3, 5, 6 – відсутність мутації L444P в обох алелях. Зраз� ки оброблені рестриктазою MspI ська частота мутації N370S становить 40,5 % від загальної кількості досліджених алелів, тоді як серед японських пацієнтів не знайдено жод� ного алеля з цією мутацією. Мутація L444P знаходиться на другому місці за частотою серед європейських пацієнтів (24,2 %), а мутація 84GG зустрічається в цьому регіоні дуже рідко (0,4 %). Для пацієнтів єврейського походжен� ня, навпаки, саме мутація 84GG знаходиться на другому місці за частотою, після N370S. Серед досліджених нами хворих найрозпов� сюдженішою була мутація N370S. Знайдена во� на у 42,3 % алелів, що добре узгоджується з да� ними для європейських популяцій. Мутація L444P серед наших хворих зустрічалась з часто� тою 15,4 %, що дещо нижче, ніж представлені в літературі дані для неєврейських популяцій. Відсутність жодного з алелів, які б несли мута� цію 84GG в наших дослідженнях, підтверджує гіпотезу про панетнічне поширення цієї мутації серед євреїв ашкеназі. Таким чином, сумарна частка знайдених в українських пацієнтів ма� жорних алелів, які несли мутації N370S та L444P, склала майже 58 %. П’ять пацієнтів, у яких не виявлено мажор� них мутацій в одному або обох алелях, були об� стежені в лабораторії молекулярної діагностики Childrens Hospital and Regional Medical Center (США). У двох пацієнтів (Л.Л. та Д.І.) знайдено рідкісні мутації в одному алелі, P178S та W184R відповідно, у компаунді з N370S. Один пацієнт (М.Д.) мав рідкісні мутації в обох алелях (гено� тип G377S/c 999G→A). Пацієнт М.С. мав рід� кісну мутацію D409H в одному алелі і комплекс з двох рідкісних мутацій, R120W та G202R, – в другому. Пацієнт М.М. в одному алелі мав ма� жорну мутацію N370S, а в другому – комплекс� ну мутацію Rec Nci I (L444P, A456P, V460V). За даними літератури, мутація N370S зу� стрічається в більшості випадків у пацієнтів з І типом ХГ [3]. При виникненні цієї мутації Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів ... 45ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Та б л и ц я 2 Частота мутацій N370S, L444P та 84GG в гені GBA у різних популяціях N370S/ N370S N370S/R* N370S/? N370S/L444P L444P/? R/R ?/? І І І І І ІІІ І, ІІІ 4 3 5 6 2 2 4 Генотип Тип ХГ Кількість пацієнтів Та б л и ц я 1 Молекулярно!генетичне обстеження пацієнтів з ХГ в Україні Велика Британія Росія Чехія та Словаччина Польща Україна Румунія Італія Іспанія Туреччина В середньому по Європі 54 110 58 68 52 40 288 102 34 26 45,6 48,3 26 42,3 50 36 55 35,3 40,5 35 20 19 37 15,4 22,2 27,4 15 26,5 24,2 2 0 0 2 0 0 0 0 – 0,4 63 65,6 67,3 65 57,7 72,2 63,4 70 61,8 65,1 [9] [20] [21] [22] Власні дослідження [7] [23] [24] [25] Cумарна частота, % Джерело інформації N370S L444P 84GG Частота мутантних алелів, % Країна Загальна кількість досліджених алелів Європейський регіон Інші регіони Аргентина Японія Євреї ашкеназі 62 44 200 46,7 0 77 6,5 44 3 3,2 0 13 56,4 44 93 [26] [27] [2] Н.Г. Горовенко, Н.В. Ольхович, А.М. Недобой, Н.О. Пічкур ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 446 синтезується фермент з певною залишковою каталітичною активністю, що і обумовлює лег� кий перебіг захворювання, особливо в гомози� готному стані. Усі обстежені нами пацієнти, що несли мутацію N370S в обох алелях, мали І тип захворювання (ненейронопатичний) з легким клінічним перебігом. У пацієнтів з мутацією N370S в одному алелі тяжкість перебігу хворо� би в певній мірі залежала від мутації в другому алелі. Пацієнти з генотипом N370S/L444P (6 осіб) характеризувались середньою тяжкіс� тю перебігу захворювання, як і 3 пацієнти з рідкісними мутаціями у компаунді з N370S. Мутація L444P виявляється у пацієнтів всіх трьох типів ХГ, але найчастіше зустрічається при нейронопатичних формах [3]. Ця мутація пов’язана з синтезом нестабільного фермен� ту, а у гомозиготному стані – взагалі з втратою активності, що і призводить до важких форм ХГ. Однак у нашій групі пацієнтів з ІІІ типом ХГ (3 особи) не було виявлено жодного алеля з мутацією L444P. Пацієнт М.С. мав складну комбіновану мутацію D409H/R120W/G202R, всі складові якої асоціюються з тяжким клініч� ним перебігом [22, 28, 29]. Цікавим є виявлен� ня у пацієнтки М.Д. з ІІІ типом ХГ нової му� тації c. 999G→A в 7�му екзоні гена GBA, яка знаходилась у компаунді з рідкісною G377S. При обстеженні третього пацієнта з ІІІ типом ХГ (пацієнт Н.Т.) мажорних мутацій не було знайдено. Невелика кількість пацієнтів з ІІІ ти� пом ХГ не дає можливості розцінювати відсут� ність у них мутації L444P як певні особливості генотипу хворих українського походження. На сьогодні 15 алелів у пацієнтів з ХГ не ви� значені, що потребує подальших досліджень із залученням інших методів молекулярної діа� гностики. Це дозволить доповнити інформа� цію про генотип�фенотипові кореляції пацієн� тів з ХГ в Україні. Висновки. Частота мажорних мутацій N370S та L444P серед обстежених нами пацієнтів з ХГ в Україні добре узгоджується з середньоєв� ропейськими частотами для популяцій неєв� рейського походження. Відсутність мутації 84GG серед обстежених нами пацієнтів під� тверджує панетнічне розповсюдження цієї му� тації серед евреїв ашкеназі. Перебіг захворю� вання у пацієнтів з генотипом N370S/N370S підтверджує асоціацію цієї мутації з легкою формою захворювання. Серед українських паці� єнтів з ІІІ типом ХГ (нейронопатичним) не бу� ло знайдено жодного алеля з характерною для цієї форми хвороби мутацією L444P, але неве� лика кількість хворих (3 особи) не дозволяє ро� бити висновки про особливості генотипу укра� їнських пацієнтів. Молекулярно�генетичне до� слідження повинно бути важливим етапом ал� горитму діагностики ХГ та медико�генетично� го консультування сімей, обтяжених цією па� тологією, бо дозволяє не тільки остаточно під� твердити діагноз, але і, незважаючи на певний клінічний поліморфізм, прогнозувати важкість перебігу захворювання. Автори щиро вдячні лікарям медико�генетич� ного та онко�гематологічного центрів УДСЛ «ОХМАТДИТ» за надану клінічну інформацію. Особлива вдячність фірмі «Genzyme» за допомогу в організації проведення молекулярних дослід� жень, а також лабораторії молекулярної діагнос� тики Childrens Hospital and Regional Medical Center (США) за надану інформацію про молеку� лярні дослідження п'яти пацієнтів. SUMMARY. The molecular diagnostics of 27 from 26 Ukrainian families has been performed. The common mu� tations in GBA gene (N370S, L444P and 84GG) account� ed for up to 58 % of all cases: mutation N370S was detected in 42,3 % alleles, mutation L444P was observed in 15,4 % alleles and mutation 84GG was not found at all. The other mutations were: P178S, W184R and Rec Nci I (in com� pounds with N370S) in the patients with nonneuronopath� ic form of Gaucher disease, and the genotypes G377S/c 999G → A and D409H/R120W/G202R were detected in patients with chronic neuronopathic form of Gaucher dis� ease. The data analysis of the genotype and disease progres� sion in the patients allows confirming the known genotype� phenotype correlation. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Басистова А.А., Ланга И.Н., Смирнова Г.В. Совре� менный взгляд на лизосомальные болезни и бо� лезнь Гоше // Педиатрия. – 1999. – № 4. – С. 90—93. 2. Germain D.P. Gaucher’s disease: a paradigm for inter� ventional genetics // Clin Genet. – 2004. – 65, № 2. – P. 77—86 3. Beutler E., Grabowski G.A. Gaucher disease. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease / Eds C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D.Valle. – New York : McGraw�Hill, 2001. – P. 3635—3668. 4. Horowitz M., Wildre S., Horowitz Z., Reiner O., Gelbart T., Beutler E. The human glucocerebrosidase gene and Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів ... 47 pseudogene : Structure and evolution // Genomics. – 1989. – 4, № 1. – P. 87—96. 5. Montfort M., Chaba's A., Vilageliu L., Grinberg D. Fun� ctional analysis of 13 GBA mutant alleles identified in gaucher disease patients : Pathogenic changes and «modifier» polymorphisms // Hum. Mutat. – 2004. – 23. – P. 567—575. 6. Бейер Е.М., Букина Т.М., Цветкова И.В. Биохими� ческая и генетическая диагностика болезни Гоше и фенотипическая гетерогенность заболевания // Вопр. мед. химии. – 2000. – 46, № 5. – С. 451—454. 7. Drugan C., Procopciuc L., Jebeleanu G., Grigorescu�Sido P., Dussau I., Poenaru L., Caillaud C. Gaucher disease in Romanian patients: incidence of the most common mutations and phenotypic manifestations // Eur. J. Hum. Genet. – 2002. – 10, № 9. – P. 511—515. 8. Sidransky E., Tayebi N., Ginnes E.I. Diagnosing Gaucher disease // Clin. Pediat. – 1995. – 34, № 7. – P. 365—371. 9. Walley A., Barth M.L., Ellis I., Fensom A.H., Harris A. Gaucher’s disease in United Kingdom: screening non� Jewish patients for the two common mutations// J. Med. Genet. – 1993. – 30. – P. 280—283. 10. Wenger D.A., Williams C. Screening for lysosomal dis� orders // Techniques in Diagnostics of Human Bio� chemical Genetics. – New York : Wiley�Liss, 1991. – P. 587—619. 11. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справоч� ник биохимика. – М.: Мир, 1991. – 543 с. 12. Suzuki K. Enzymic Diagnosis of Sphingolipidoses // Methods in Enzymology. – New York : Acad. press, 1978. – 50. – P. 475—480. 13. Guo Y., He W., Boer A.M. et al. Elevated plasma chito� triosidase activity in various lisosomal storage disorders // J. Inher. Metab. Dis. – 1995. – 18. – P. 717—722. 14. Горовенко Н.Г., Дроздова В.Д., Недобой А.М., Ольхо� вич Н.В., Пічкур Н.О., Циганкова М.А., Радзіховська О.В. Можливість підвищення точності біохімічної діагностики хвороби Гоше // Цитология и генети� ка. – 2006. – 40, № 3. – С. 67—71. 15. Горовенко Н.Г., Недобой А.М., Ольхович Н.В., Івано� ва Т.П., Кочнєва О.М., Пічкур Н.О., Грегуль І.С. Ви� значення хітотриозидазної активності в плазмі крові як критерій підтверджуючої діагностики хвороби Гоше // Вісн. Укр. т�ва генетиків і селекціо� нерів. – 2006. – 4, № 1. – С. 68—75. 16. Молекулярная клиническая диагностика : Мето� ды. – М.: Мир, 1999. – 291 с. 17. Stone D.L., Tayebi N., Orvisky E. et al. Glucocerebrosi� dase gene mutations in patients with type 2 Gaucher disease // Hum. Mutat. – 2000. – 15. – P. 181–188. 18. Недобой А.М., Ольхович Н.В., Горовенко Н.Г. Особ� ливості біохімічної діагностики хвороби Гоше на сучасному етапі // Зб. наук. пр. співробітників КМАПО ім. П. Л. Шупика. – Київ, 2004. – Bип.13, кн.5. – С. 300—306. 19. Cox T.M. Gaucher disease: understanding the molecu� lar pathogenesis of sphingolipidoses // J. Inherit. Metab. Dis. – 2001. – 24 (Suppl.2). – P. 106–112. 20. Букина Т.М. Биохимическая и молекулярно�гене� тическая характеристика болезни Гоше у россий� ских пациентов : Автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2005. – 16 c. 21. Hodanova K. et al. Analysis of the β�glucocerebrosidase gene in Czech and Slovak Gaucher patients: mutation profile and description of six mutant alleles // Blood Cells, Mol., and Dis. – 1999. – 25, № 18. – P. 287—298. 22. Tylki�Szymanska A., Millat G., Maire I., Czartoryska B. Types I and III Gaucher disease in Poland: Incidence of the most common mutations and pheno� typic manifestations // Eur. J. Hum. Genet. – 1996. – 4. – P. 334—337. 23. Colombo R. Age estimate of the N370S mutation caus� ing Gaucher disease in Ashkenazi Jews and European populations // Amer. J. Hum. Genet. – 2000. – 66. – P. 692—697. 24. Alfonso P., Cenarro A. et al. Mutation prevalence among 51 unrelated spanish patients with Gaucher disease: Identification of 11 novel mutations // Blood Cells, Mol. and Dis. – 2001. – 27, № 5. – P. 882—891. 25. Gurakan F., Terzioglu M., Kocak N., Yuce A., Ozen H., Ciliv G., Emre S. Analysis of three mutations in Turkish children with Gaucher disease // J. Inher. Metab. Dis. – 1999. – 22. – P. 947—948. 26. Cormand B., Harboe T.L., Gort L., Campoy C., Blanco M., Chamoles N. et al. Mutation analysis of Gaucher disease patients from Argentina : High prevalence of the RecNciI mutation // Amer. J. Med. Genet. – 1998. – 80. – P. 343—351. 27. Ida H., Rennert O.M., Ito T., Maekawa K., Eto Y. Type 1 Gaucher disease: phenotypic expression and natural history in Japanese patients // Blood Cells, Mol. and Dis. – 1998. – 24, № 5. – P. 73—81. 28. Brautbar A., Elstein D., Abrahamov A., Zeigler M et al. The 1604 (R496H) mutation in Gaucher disease: geno� type/phenotype correlation // Blood Cells, Mol. and Dis. – 2003. – 31. – P. 187—189. 29. Cormand B., Grinberg D., Gort A., Chabas A., Vilageliu L. Molecular analysis and clinical findings in the Spanish Gaucher disease population: Putative haplo� type of the N370S ancestral chromosome // Hum. Mutat. – 1998. – 11. – P. 295—305. Надійшла 25.10.06 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4

Визначення частоти мажорних мутацій в гені GBA у пацієнтів з хворобою Гоше в Україні

Репозитарії

Схожі ресурси