Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби

Визначено досконалі міжланцюгові триплекси, які потенційно можуть виникати у провірусній ДНК широко розповсюджених ретровірусів великої рогатої худоби (ВРХ) – вірусу лейкозу (ВЛ) та вірусу імунодефіциту (ВІ). У геномі ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ знайдено 5 та 10 фрагментів відповідно, які за кислих значень рН...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2010
Автор:	Лиманська, О.Ю.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2010
Назва видання:	Цитология и генетика
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66675
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби / О.Ю. Лиманська // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 1. — С. 10-18. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-66675
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-666752014-07-21T03:01:42Z Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби Лиманська, О.Ю. Оригинальные работы Визначено досконалі міжланцюгові триплекси, які потенційно можуть виникати у провірусній ДНК широко розповсюджених ретровірусів великої рогатої худоби (ВРХ) – вірусу лейкозу (ВЛ) та вірусу імунодефіциту (ВІ). У геномі ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ знайдено 5 та 10 фрагментів відповідно, які за кислих значень рН можуть утворювати потрійні спіралі. Один з цих фрагментів (локалізований у гені gag ВЛ ВРХ) може існувати і як частина хрестоподібної структури. Експериментально існування триплексів підтверджено за допомогою атомно-силової мікроскопії шляхом візуалізації суперспіральної ДНК pGEMEX, у геномі якої знайдено шість дзеркально-симетричних фрагментів, необхідних для утворення внутрішньомолекулярних триплексів. Створено карти локалізації триплексів (які є одним з ланцюгів сигнальних механізмів функціонування геному) на геномі ретровірусів ВРХ. Определены совершенные межцепочечные триплексы, которые потенциально могут возникать в провирусной ДНК широко распространенных ретровирусов крупного рогатого скота (КРС) – вируса лейкоза (ВЛ) и вируса иммунодефицита (ВИ). В геноме ВЛ КРС и ВИ КРС найдено 5 и 10 фрагментов соответственно, которые при кислых значениях рН могут образовывать тройные спирали. Один из этих фрагментов (локализованный в гене gag ВЛ КРС), может существовать и как часть крестообразной структуры. Экспериментально существование триплексов подтверждено с помощью атомно-силовой микроскопии посредством визуализации суперспиральной ДНК pGEMEX, в геноме которой найдено шесть зеркально-симметричных фрагментов, необходимых для образования внутримолекулярных триплексов. Созданы карты локализации триплексов (которые являются одной из цепей сигнальных механизмов функционирования генома) на геноме ретровирусов КРС. Perfect interstranded triplexes that can potentially arise in the proviral DNA of wide-spread bovine retroviruses like as bovine leukemia virus (BLV) and bovine immunodeficiency virus (BIV) have been determined. In the BLV and BIV genomes 2 and 5 fragments respectively were found to form triple helixes under acidic conditions. One of those fragments that is localized on the BLV gag gene can exist as cruciform structure too. Experimentally the existence of triplexes is confirmed by atomic force microscopic visualization of supercoiled pGEMEX DNA for which genome 6 fragments are found with mirror symmetry that is necessary for intramolecular triplex formation. The diagrams of triplexes (one of the elements of signaling genome function) localization on the genome of bovine retroviruses are obtained. 2010 Article Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби / О.Ю. Лиманська // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 1. — С. 10-18. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. 0564-3783 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66675 577.2:573.6 uk Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Лиманська, О.Ю. Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби Цитология и генетика
description	Визначено досконалі міжланцюгові триплекси, які потенційно можуть виникати у провірусній ДНК широко розповсюджених ретровірусів великої рогатої худоби (ВРХ) – вірусу лейкозу (ВЛ) та вірусу імунодефіциту (ВІ). У геномі ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ знайдено 5 та 10 фрагментів відповідно, які за кислих значень рН можуть утворювати потрійні спіралі. Один з цих фрагментів (локалізований у гені gag ВЛ ВРХ) може існувати і як частина хрестоподібної структури. Експериментально існування триплексів підтверджено за допомогою атомно-силової мікроскопії шляхом візуалізації суперспіральної ДНК pGEMEX, у геномі якої знайдено шість дзеркально-симетричних фрагментів, необхідних для утворення внутрішньомолекулярних триплексів. Створено карти локалізації триплексів (які є одним з ланцюгів сигнальних механізмів функціонування геному) на геномі ретровірусів ВРХ.
format	Article
author	Лиманська, О.Ю.
author_facet	Лиманська, О.Ю.
author_sort	Лиманська, О.Ю.
title	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби
title_short	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби
title_full	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби
title_fullStr	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби
title_full_unstemmed	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби
title_sort	поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній днк ретровірусів великої рогатої худоби
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2010
topic_facet	Оригинальные работы
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66675
citation_txt	Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби / О.Ю. Лиманська // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 1. — С. 10-18. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.
series	Цитология и генетика
work_keys_str_mv	AT limansʹkaoû polípurinovípolípírimídinovíposlídovnostízpotencíalomutvorennâtripleksívuprovírusníjdnkretrovírusívvelikoírogatoíhudobi
first_indexed	2025-07-05T16:51:51Z
last_indexed	2025-07-05T16:51:51Z
_version_	1836826557904060416
fulltext	ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 110 УДК 577.2:573.6 О.Ю. ЛИМАНСЬКА1, 2 1 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України», Харків E#mail: olga.limanskaya@mail.ru 2 Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», Харків ПОЛІПУРИНОВІ/ПОЛІПІРИМІДИНОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ З ПОТЕНЦІАЛОМ УТВОРЕННЯ ТРИПЛЕКСІВ У ПРОВІРУСНІЙ ДНК РЕТРОВІРУСІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ Визначено досконалі міжланцюгові триплекси, які потенційно можуть виникати у провірусній ДНК широ# ко розповсюджених ретровірусів великої рогатої худоби (ВРХ) – вірусу лейкозу (ВЛ) та вірусу імунодефіциту (ВІ). У геномі ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ знайдено 5 та 10 фраг# ментів відповідно, які за кислих значень рН можуть утворювати потрійні спіралі. Один з цих фрагментів (локалізований у гені gag ВЛ ВРХ) може існувати і як частина хрестоподібної структури. Експеримен# тально існування триплексів підтверджено за допомо# гою атомно#силової мікроскопії шляхом візуалізації су# перспіральної ДНК pGEMEX, у геномі якої знайдено шість дзеркально#симетричних фрагментів, необхідних для утворення внутрішньомолекулярних триплексів. Створено карти локалізації триплексів (які є одним з ланцюгів сигнальних механізмів функціонування геному) на геномі ретровірусів ВРХ. Вступ. Геномна РНК та провірусна ДНК (інтегрована в геном клітини�хазяїна еукаріо� тів, прокаріотів і вірусів) є структурно гнучки� ми молекулами. В залежності від послідовнос� ті нуклеотидів (наприклад, за наявності інвер� тованих повторів) в одноланцюговій РНК мо� жуть виникати дволанцюгові фрагменти (шпильки). У дволанцюговій ДНК також в за� лежності від послідовності (наприклад, за на� явності поліпуринових або поліпіримідинових дзеркальних повторів уздовж одного ланцюга ДНК) при певних умовах можливе утворення триплексів, які складаються з одноланцюго� вого та триланцюгового фрагментів [1]. Неканонічні структури, які утворюються в РНК та ДНК, є гарячими точками геномної нестабільності еукаріотів, прокаріотів, вірусів. Ця їхня особливість обумовлена можливістю утворення триплексів (або Н�ДНК), шпиль� кових (в одноланцюговому стані) та хрестопо� дібних (у дволанцюговому стані) структур при різних генетичних процесах. Повтори (прямі, інвертовані та дзеркальні в одному ланцюгу ДНК) широко представлені в геномі із залу� ченням до мутагенезу та значних геномних перебудов. Раніше було показано, що інвер� товані повтори блокують реплікацію ДНК in vitro [2–6], а також можуть бути сайтами зу� пинки РНК�полімерази при елонгації транс� крипції [7]. Внутрішньомолекулярні міжланцогові трип� лекси утворюються в гомопуринових (гомопі� римідинових) послідовностях з формуванням триплетів у формі пур – пур : пір (наприклад, АAT) або пір – пур : пір (наприклад, ТАТ та CGC+), де пір та пур – піримідинові та пурино� ві нуклеотиди, C+ – протонований цитидин� фосфат. Послідовність повинна містити дзер� кальний повтор – вона має бути такою ж у на� прямку 3' � 5', як і у напрямку 5' � 3' вздовж одного ланцюга ДНК. Цим неканонічний па� ліндром відрізняється від звичайного палінд� рому (інвертованого повтору), який утворює хрестоподібну структуру при однаковій послі� довності фрагмента у різних ланцюгах ДНК. В залежності від орієнтації третього ланцюга по відношенню до центрального уотсон�кри� ківського ланцюга триплекси класифікують на дві категорії – паралельні та антипаралельні. При утворенні паралельних триплексів необ� хідне протонування N3 цитозину для корект� ного хугстинівського зв’язування з N7 гуаніну.© О.Ю. ЛИМАНСЬКА, 2010 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 1 11 Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів З цієї причини паралельні триплекси є найста� більнішими за кислих значень рН. На відміну від них антипаралельні триплекси не потребу� ють протонування і характеризуються силь� ним зв’язуванням, що не залежить від рН. У паралельному триплексі піримідиновий мотив потрійної спіралі зв’язується паралель� но гомопуриновому ланцюгу дволанцюгової ДНК за допомогою хугстинівського водневого зв’язування з утворенням триплексів, подіб� них до Т – А : Т або С+ – G : C, які містять ка� нонічні пари А : Т та G : C відповідно. За фі� зіологічних значень рН зв’язування третього ланцюга з дуплексом зменшується, оскільки для утворення водневого зв’язку цитозин по� винен бути протонованим. У антипаралельно� му триплексі гомопуриновий мотив потрійної спіралі зв’язується антипаралельно гомопури� новому ланцюгу дуплекса ДНК за допомогою зворотного хугстинівського зв’язування з утворенням триплексів типу А – А : Т та G – G : C [8, 9]. Раніше встановлено, що довгі гомопурино� ві тракти з потенціалом утворення триплексів локалізовані невипадковим чином в геномі еукаріотів: типово вони розташовані поряд з промоторами генів, «гарячими» точками ре� комбінації [10]. Існують експериментальні до� кази того, що внутрішньомолекулярні триплек� си залучені до таких клітинних процесів, як реплікація, рекомбінація, транскрипція [11– 14]. При вивченні різних властивостей трип� лексів як модельні системи зазвичай викорис� товуються або синтетичні олігонуклеотиди, або довгі поліпуринові тракти, що екстрагова� ні з мікроорганізмів та клоновані у плазміди [15]. У той же час реальний розподіл фрагмен� тів геному, які потенційно можуть утворювати триплекси, для вірусів і бактерій залишається нез’ясованим. У зв’язку з цим нами проведено пошук структур, що потенційно можуть утво� рювати міжланцюгові триплекси, у геномі ретровірусів – вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛ ВРХ) та вірусу імунодефіциту ве� ликої рогатої худоби (ВІ ВРХ). Ретровіруси знайдені в різних видах тварин у широкому таксономічному діапазоні. Усі ретровіруси мають спільну особливість – необхідність синтезу копії ДНК з матриці ге� номної РНК за допомогою зворотної транс� криптази [16]. Лентівіруси належать до унікаль� ного роду ретровірусів з подібними структурни� ми, генетичними, біологічними та патологічни� ми властивостями. До лентівірусів відносяться віруси імунодефіциту людини, великої рогатої худоби, мавпи, кішки, а також вірус вісна�ма� еді овець, вірус артриту�енцефаліту кіз, вірус інфекційної анемії коня, вірус хвороби Йємб� рана великої рогатої худоби. Лентівіруси, які є неонкогенними вірусами, викликають повіль� ні, хронічні та дегенеративні патологічні змі� ни в інфікованій клітині�хазяїні, часто асоці� йовані з розвитком уражень імунної системи [17]. Усі лентівіруси інфікують моноцити та макрофаги. Лентівіруси на відміну від інших ретровірусів можуть реплікуватися у клітинах, що не діляться [18]. ВІ ВРХ, структурно схожий на ВІЛ, є ленті� вірусом, який викликає тривале інфекційне захворювання великої рогатої худоби, подібне до СНІДу, після варіабельної асимптоматич� ної фази [19]. ВЛ ВРХ, інший широко розпов� сюджений в світі ретровірус, асоційований з летальною формою лейкемії та персистую� чим лімфоцитозом [20]. У даній роботі за допомогою комп’ютерного аналізу знайдено розподіл потенційних доско� налих триплексів у провірусній ДНК ВЛ ВРХ і ВІ ВРХ та представлено фізичні карти вірусів з локалізованими триплексами. На основі ана� лізу створених карт локалізації потенційних триплексів показано, що розподіли триплексів у геномах ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ відрізняються якісно та кількісно. Візуалізацією суперспіраль� ної ДНК pGEMEX, яка містить гомопурино� ві/гомопіримідинові послідовності, за допомо� гою атомно�силової мікроскопії (АСМ) підтвер� джено можливість утворення триплексів in vitro. Матеріали та методи. Комп’ютерний аналіз. У роботі використані послідовності повністю секвенованих ізолятів вірусу лейкозу великої рогатої худоби (номер AF 033818 для бази да� них GenBank, довжина 8419 пар нуклеотидів, п.н.), вірусу імунодефіциту великої рогатої ху� доби (номер M32690, довжина 8482 п.н.), а та� кож плазміда pGEMEX (довжина 3993 п.н., «Promega», США). Для пошуку триплексів та визначення їх параметрів використовували програму Site пакета GeneBee [21]. Пошук ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 112 О.Ю. Лиманська міжланцюгових триплексів проводили за фор� мулами Rn · Nk · Rn та Yn · Nk · Rn, де R – пурини аденін (A) або гуанін (G), Y – піримідини ци� тозин (C) або тимін (T). Значення n змінюва� лося від 4 до 10, а значення k – від 4 до 7. Атомно�силова мікроскопія. В роботі вико� ристовували атомно�силовий мікроскоп Na� noscope IV MultiMode System («Veeco Instru� ments Inc.», CШA) з E�сканером. АСМ�зобра� ження ДНК були записані за допомогою віб� руючого варіанта АСМ у повітрі в режимі «ви� сота» з використанням OMCL�AC160TS кан� тилеверів («Olympus Optical Co.», Японія) з резонансною частотою 340–360 кГц та кон� стантою жорсткості 42 Н/м. Зображення отри� мані у форматі 512 � 512 пікселей, згладжені та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Nanoscope (версія 5.12r3) («Veeco Instruments Inc.», США). Підготовку зразка здійснювали відповідно до раніше на� веденої методики [22]. Коротко, процедура виглядала наступним чином. Для нанесення розчину ДНК на аміно�слюду використовува� ли ТЕ буфер (10 мM трис�HCl рН 7,6, 1 мM ЕДТА). На смугу слюди розміром 1 см2 нано� сили краплю розчину об’ємом 10 мкл ДНК у ТЕ буфері, промивали після 2�хвилинної експозиції ультрачистою водою, вільною від РНКаз, обдували потоком аргону та після під� сушування зразка проводили візуалізацію. За� значимо, що свіжосколота слюда має сумар� ний незначний негативний поверхневий за� ряд. При модифікації свіжосколотої слюди у парах похідного аміносилану властивості аміногруп аміносилану, що знаходяться по� близу поверхні слюди, значно змінюються під впливом поверхні слюди. Якщо у водному розчині константа іонізації рК аміносилану 3� амінопропілтриетоксисилану (АПТЕС) ста� новить ~ 10 [23], то константа іонізації АПТЕС на поверхні слюди зменшується при� близно на три одиниці pH, і рК становить ~ 7 [24, 25]. Результати досліджень. Раніше було вста� новлено, що in vitro можливість утворення Н� ДНК у гомопуринових/гомопіримідинових фрагментах довжиною менше 15 п.н. є проб� лематичною [26]. У роботі [27] продемонстро� вано, що триплекси утворюються для послі� довності G16 · C16, у той час як вони не форму� Таблиця 1 Триплекси, що можуть бути потенційно утворені в провірусній ДНК вірусу лейкозу великої рогатої худоби (номер AF033818 для бази даних GenBank) фраг� мента 11 18 18 20 18 3 6 8 6 6 CTTTCTGTTTC 273–283 TCTCCCTCGGCGCCCTCT 302–319 CCCCCTCCTATAACCCCC 452–469 CCCCCCCTTATGACCCCCCC 740–759 CCCGTACCCTCCTATGCCC 3621–3638 LTR LTR gag gag pol петлі Послідовність, положення на геномі Ген Таблиця 2 Триплекси, що можуть бути потенційно утворені в провірусній ДНК вірусу імунодефіциту великої рогатої худоби (номер M32690 для бази даних GenBank) Довжина 13 13 12 13 14 14 15 11 12 5 3 4 5 4 4 3 3 4 GAAATTGTGAAAG 2169–2181 AAGGGAACGGGAA 2259–2271 AAGGTCCAGGAA 2713–2724 AGGAGTAAAAGGA 3096–3108 AGGGAAGAAAGGGA 3363–3376 GGGGGAATAGGGGG 4489–4502 GAAAGGAATGGAAAG 4616�4630 GGGGAAAGGGG 5464–5474 GAGGATCCGGAG 5477–5488 pol pol pol pol pol pol pol vif vif петлі фраг� мента Послідовність, положення на геномі Ген Примітка. Тут і в табл. 2 підкреслено дзеркально�си� метричні повтори. Потенційний триплекс, виділений курсивом (позиція № 4), може перебувати у конформа� ції хрестоподібної структури (як її частина). Довжина № 1 2 3 4 5 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 1 13 Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів ються у послідовності G14 · C14. Беручи до ува� ги ці дані, для подальшого аналізу ми вибрали фрагменти геному ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ з потен� ціалом утворення триплексів з такими пара� метрами: довжина повтору � 11 нуклеотидів, довжина стебла � 4 п.н., петля – до 8 нуклео� тидів. На основі визначених потенційних трип� лексів в геномі провірусної ДНК ВЛ ВРХ (табл. 1) була побудована діаграма їхнього розподілу на фізичній карті геному ВЛ ВРХ (рис. 1). Провірусна ДНК ВЛ ВРХ має довжи� ну приблизно 8420 п.н. і за своїм складом по� дібна до геному інших ретровірусів з типовою локалізацією генів gag, pol та env. Послідов� ність та вторинна структура одного із знайде� них у геномі ВЛ ВРХ потенційних триплексів наведені на рис. 2. Запропонована модель триплекса відповідає структурі, що утворена досконалими дзеркальними повторами. В той же час у роботі [28] показано, що наявність дзеркальної симетрії не є обов’язковою для формування тріад нуклеотидів триплекса, а деякі нуклеотиди, що не збігаються, можуть мати місце при взаємодії між дуплексом та третім ланцюгом пурин/піримідинової по� слідовності. Аналогічним чином були отримані діагра� ми розподілу (рис. 3) та параметри триплексів (табл. 2) для вірусу імунодефіциту ВРХ. ВІ ВРХ має найскладнішу геномну організацію серед лентівірусів (за винятком лентівірусів приматів). Довжина провірусної ДНК ВІ ВРХ становить понад 8480 п.н., а гени vpw, vpy та tmx є унікальними генами для бичачих лентіві� русів. Проведене порівняння діаграм розпо� ділу триплексів для двох ізолятів ВІ ВРХ (по� ряд з ізолятом М32690 на наявність триплек� сів був проаналізований ізолят ВІ ВРХ номер L04974, дані не наведено) показало, що сім з дев’яти потенційних триплексів (позиції 3–9 табл. 2) є консервативними структурними мотивами з ідентичними сайтами локалізації в геномі обох ізолятів ВІ ВРХ. В той же час позиції та послідовності двох інших триплек� сів незначно відрізняються (обидва ці трип� лекси локалізовано в гені pol – позиції 1 та 2 табл. 2). Послідовність та вторинна структура двох знайдених у геномі ВІ ВРХ триплексів наведені на рис. 4. З’єднання стебла одного триплекса з іншим сусіднім триплексом може бути гнучким в залежності від довжини лін� керного дуплекса між двома триплексами. Для подвійного триплекса, знайденого у геномі ВІ ВРХ, довжина лінкера становить 2 п.н. Тому в даному випадку можливе формування тільки структури, модель якої показана на вставці а рис. 4. В той же час стеричні обмеження (рис. 4, вставка б) унеможливлюють утворення П� образної структури для даної триплексної структури, модель якої запропоновано в робо� ті [15]. Формування триплексів при іммобілізації ДНК на поверхні амінослюди із розчину за нейтральних значень рН було експерименталь� но підтверджено за допомогою методу атом� Рис. 1. Фізична карта геному вірусу лейкозу великої рогатої худоби з наведеними позиціями відомих генів. Стрілками показано позиції визначених дзеркально� симетричних поліпіримідинових послідовностей Рис. 2. Структура міжланцюгового триплекса (або Н� ДНК) для фрагмента провірусної ДНК вірусу лейкозу ВРХ. Стрілки вказують на потрійну спіраль. Підкрес� лені фрагменти послідовності «–»�нитки провірусної ДНК ВЛ ВРХ вказують на два симетричних повтори, які приймають участь в утворенні триплекса. Малень� кими прямокутниками показано взаємодію третього ланцюга триплекса з фрагментом дволанцюгової ДНК за рахунок хугстинівського зв’язування. На вставці на� ведено модель даного триплекса ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 114 О.Ю. Лиманська но�силової мікроскопії. Нами візуалізовано декілька незвичних поодиноких молекул су� перспіральної ДНК pGEMEX, фрагменти яких утворюють своєрідну сітку (рис. 5). Проведе� ний комп’ютерний аналіз показав, що послі� довність ДНК pGEMEX містить шість фраг� ментів з потенціалом утворення триплексів. Три фрагменти мають довжину стебла 5 п.н., два фрагменти – 6 п.н., а один фрагмент – 7 п.н. Розмір петлі для усіх зазначених фраг� ментів становить 5 нуклеотидів. Атомно�силова мікроскопія дозволяє не тільки візуалізувати молекули, але і вимірювати їх геометричні параметри. Один з таких струк� турних параметрів (висота молекули) було вимі� ряно за допомогою побудови поперечного пе� рерізу молекули ДНК pGEMEX (рис. 5, б). Ви� сота короткого міжланцюгового триплекса, ви� значена з профілю перерізу, становить 0,75 нм. Обговорення одержаних даних. Життєвий цикл реплікації ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ є подібним до такого для інших ретровірусів. Після вихо� ду геномної РНК до цитоплазми інфікованої клітини вірусна зворотна транскриптаза, яку кодує ген pol, транскрибує РНК у дволанцю� гову молекулу ДНК (також відому як прові� русна ДНК). Після цього провірусна ДНК ін� тегрується у геном клітини�хазяїна за допомо� гою вірусної інтегрази. Провірусна ДНК може залишатися у латентному стані або за наяв� ності певних сигналів бути як ДНК�матриця для синтезу нових молекул вірусних РНК. Ретровіруси використовують розмаїття цис� регуляторних сигналів та регуляторних і допо� міжних білків для модуляції різних аспектів їхньої реплікації та інфекційної дії. Експресія генів ретровірусів істотно залежить від числен� них факторів, в тому числі від взаємодії транс� крипційних факторів клітини�хазяїна з цис� регуляторними елементами, локалізованими у довгих кінцевих повторах (LTR), конформації регуляторних фрагментів геному. В роботі [28] показано, що інвертований повтор, клонований у плазміду, з довжиною стебла 7 п.н. за нейтральних значень рН може утворювати хрестоподібну структуру з сусід� нім фрагментом, проте за кислих іонних умов хрестоподібна структура руйнується, і зазна� чений фрагмент утворює триплекс. З усіх про� аналізованих потенційних триплексів в прові� русній ДНК ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ тільки один фрагмент (позиція № 4, табл. 1) може прийма� ти участь в утворенні хрестоподібної структу� ри (аналіз геномної РНК ВІ ВРХ та ВЛ ВРХ на наявність шпилькових структур, які можуть утворювати хрестоподібні структури в прові� русній ДНК, не показано). Дані щодо можли� вості тригерного переключення фрагмента Рис. 3. Фізична карта геному вірусу імунодефіциту ве� ликої рогатої худоби з наведеними позиціями відомих генів. Гени rev і tat складаються з двох кодувальних об� ластей. Перший кодувальний екзон гена rev та коду� вальна область tmx мають таку ж рамку зчитування, як і ген env. Кодувальні області геному вірусу показа� но трьома горизонтальними полосами, що відповіда� ють різним рамкам зчитування. Стрілками показано позиції визначених дзеркально�симетричних поліпу� ринових послідовностей Рис. 4. Структура двох триплексів (або Н�ДНК) для фрагмента провірусної ДНК вірусу імунодефіциту ВРХ, які відповідають положенню 5464–5488 гена vif провірусної ДНК ВІ ВРХ. Стрілки вказують на потрій� ні спіралі. У прямокутниках та підкреслено дзеркаль� но�симетричні повтори «+»�нитки провірусної ДНК ВІ ВРХ, які утворюють два триплекси. Маленькими прямокутниками показано взаємодію третього ланцю� га триплекса з фрагментом дволанцюгової ДНК за ра� хунок хугстинівського зв’язування: вставка а – мо� дель запропонованого подвійного триплекса; вставка б – модель триплекса, яка є неможливою через сте� ричні обмеження, що виникають при формуванні да� ної вторинної структури, утвореної двома триплек� сами ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 1 15 Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів провірусної ДНК ВЛ ВРХ з конформації ка� нонічної подвійної спіралі до конформації триплекса або конформації хрестоподібної структури вказують на особливу роль зазначе� ного фрагмента в геномній структурі ВЛ ВРХ. Крім того, привертає увагу відсутність доско� налих потенційних триплексів в гені env обох ретровірусів ВРХ. З одного боку, це підтверд� жує, що ген env є найваріабельнішим з відомих генів ВЛ ВРХ та ВІ ВРХ [29, 30], а з іншого, на� дає додаткову інформацію для конструювання праймерів при створенні молекулярно�генетич� них тест�систем для детекції і типування ретро� вірусів ВРХ. Відомо, що за фізіологічних умов паралельні триплекси є стабільнішими порівняно з анти� паралельними [31]. Утворення паралельних триплексів (на відміну від антипаралельних потрійних спіралей [9]) є залежним від рН: го� мопуринові/гомопіримідинові послідовності дуплекса ДНК утворюють потрійні спіралі за кислих значень рН (приблизно рН 4) [32]. За таких умов перехід до Н�ДНК спостерігали для релаксованої, ненадсуперспіралізованої ДНК [32]. Для молекул ДНК зазначені умови можна змоделювати при їх іммобілізації на по� верхню слюди, яку використовують як суб� страт при дослідженнях за допомогою атомно� силової мікроскопії. Разом з тим під впливом поверхневих влас� тивостей слюди може зменшуватися не тільки рК АПТЕС, а також рК нуклеотидів при іммо� білізації ДНК на поверхні слюди. Це означає, що деякі нуклеотиди за умов iммобiлiзацiї ДНК на модифiкованiй амiнослюдi можуть бути протонованими. Однією з причин форму� вання візуалізованої структури (рис. 5) може бути саме формування внутрiшньомолекуляр� них міжланцюгових триплексів. Потрійна спі� раль ДНК утворюється для фрагментів пу� рин/піримідинових послідовностей ДНК за рН ~ 4 у водному розчині, тобто за умови зни� ження рН на три одиниці від нейтрального значення вiдбувається структурний перехід від В�ДНК до Н�ДНК [33], а саме на три одиниці рН зсуваються у бік кислих рН значення кон� стант іонізації молекул, іммобілізованих на слюді. Зазначимо, що діаметр спіралі дволанцюго� вої ДНК за даними рентгеноструктурного ана� лізу становить приблизно 2 нм для В�форми [34]. В той же час під впливом поверхневих властивостей амінослюди висота молекули ДНК, іммобілізованої на амінослюді, зменшу� ється і становить 0,4–0,5 нм. Різниця у значен� нях висоти молекули для В�ДНК та триплекса свідчить про те, що структури, які візуалізова� но за допомогою АСМ, є внутрішньомолеку� лярними триплексами. Ефективне утворення таких структур виникає через протонування нуклеотидів на поверхні амінослюди з висо� кою поверхневою щільністю позитивного за� ряду, яке є необхідним для формування трип� лексів. Отримане нами збільшення висоти триплекса у 1,5 разу порівняно з В�ДНК збіга� Рис. 5. Зображення поодинокої молекули суперспіраль� ної ДНК pGEMEX, яке отримане за допомогою атом� но�силового мікроскопа (а) (сегменти молекули утво� рюють своєрідну сітку, розмір кадру – 345 нм � 345 нм), та поперечний профіль перерізу фрагмента ДНК pGEMEX, що утворив триплекс (б) (переріз виконано вздовж лінії, перпендикулярно до площини рисунка; визначене значення висоти триплекса, на яке вказують два трикутники, становить 0,73 нм) ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 116 О.Ю. Лиманська ється з результатами роботи [15] по визначен� ню структурних параметрів триплексів при ім� мобілізації на амінослюді. Аналогічну сітку молекул плазмідних ДНК, іммобілізованих на свіжосколотій слюді, було візуалізовано у роботі [35] тільки для певного значення концентрації іонів Mg2+. Таким чи� ном, отримані результати свідчать про те, що, по�перше, утворення триплексів є можливим за наявності дзеркальних поліпурин/поліпіри� мідинових повторів в послідовності ДНК; по� друге, суперспіральні ДНК утворюють потрій� ні спіралі тільки у вузькому інтервалі як по� верхневої щільності заряду слюди, так і кон� центрації ДНК. Встановлення розподілу потенційних три� плексів в геномі ретровірусів тварин є одним з етапів на шляху розуміння основних компо� нентів сигнального механізму функціонування геному віріонів. Внутрішньомолекулярні три� плекси в геномі ретровірусів ВРХ можуть вка� зувати на сайти зупинки полімераз при репліка� ції та транскрипції. Крім того, визначені триплекси можуть знайти застосування в генній терапії ретрові� русів ВРХ, а саме для модулювання біологіч� них функцій, асоційованих з ДНК. Знання специфічних мішеней в ДНК з потенціалом утворення триплексів надає можливість ство� рювати комплементарні до триплексів моле� кули для наступного маніпулювання генами (тобто їх селективного виключення). Такий підхід базується на інгібуванні транскрипції відповідних генів за рахунок комплексоутво� рення з триплексними мотивами на ДНК�мі� шені. Подальші фундаментальні дослідження на рівні поодиноких молекул та клітин до� зволяють відповісти на численні питання – яка роль зазначених міжланцюгових триплек� сів? Як вони функціонують і взаємодіють з іншими ключовими молекулами? Автор висловлює подяку О.П. Лиманському (ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України») за дискусії та допомогу при підготовці статті. Автор щи# ро вдячний рецензенту за конструктивні заува# ження, направлені на покращення статті. Робота частково підтримана грантом АМН 72/2007 від Академії медичних наук України. O.Yu. Limanskaya POLYPURINE/POLYPYRIMIDINE SEQUENCES WITH POTENTIAL OF FORMING TRIPLEXES IN THE PROVIRAL DNA OF BOVINE RETROVIRUSES Perfect interstranded triplexes that can potentially arise in the proviral DNA of wide�spread bovine retroviruses like as bovine leukemia virus (BLV) and bovine immunodefi� ciency virus (BIV) have been determined. In the BLV and BIV genomes 2 and 5 fragments respectively were found to form triple helixes under acidic conditions. One of those fragments that is localized on the BLV gag gene can exist as cruciform structure too. Experimentally the existence of triplexes is confirmed by atomic force microscopic visuali� zation of supercoiled pGEMEX DNA for which genome 6 fragments are found with mirror symmetry that is necessary for intramolecular triplex formation. The diagrams of triplexes (one of the elements of signaling genome func� tion) localization on the genome of bovine retroviruses are obtained. О.Ю. Лиманская ПОЛИПУРИНОВЫЕ/ПОЛИПИРИМИДИНОВЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ С ПОТЕНЦИАЛОМ ОБРАЗОВАНИЯ ТРИПЛЕКСОВ В ПРОВИРУСНОЙ ДНК РЕТРОВИРУСОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Определены совершенные межцепочечные три� плексы, которые потенциально могут возникать в провирусной ДНК широко распространенных рет� ровирусов крупного рогатого скота (КРС) – вируса лейкоза (ВЛ) и вируса иммунодефицита (ВИ). В гено� ме ВЛ КРС и ВИ КРС найдено 5 и 10 фрагментов со� ответственно, которые при кислых значениях рН мо� гут образовывать тройные спирали. Один из этих фрагментов (локализованный в гене gag ВЛ КРС), мо� жет существовать и как часть крестообразной структу� ры. Экспериментально существование триплексов подтверждено с помощью атомно�силовой микроско� пии посредством визуализации суперспиральной ДНК pGEMEX, в геноме которой найдено шесть зер� кально�симметричных фрагментов, необходимых для образования внутримолекулярных триплексов. Соз� даны карты локализации триплексов (которые явля� ются одной из цепей сигнальных механизмов функ� ционирования генома) на геноме ретровирусов КРС. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Soyfer V.N., Potaman V.N. Triple�helical nucleic acids. – New York : Springer�Verlag, 1996. – 360 р. 2. Kang S., Ohshima K., Shimizu M., Amirhaeri S., Wells R.D. Pausing of DNA synthesis in vitro at specific loci in CTG and CGG triplet repeats from human heredi� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 1 17 Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів tary disease genes // J. Biol. Chem. – 1995. – 270, № 45. – P. 27014–27021. 3. Sherman L.A., Gefter M.L. Studies of the mechanism of enzymatic DNA elongation by Escherichia coli DNA polymerase II // J. Mol. Biol. – 1976. – 103, № 3. – P. 61–76. 4. Chalberg M.D., Englund P.T. The effect of template secondary structure on vaccinia DNA polymerase // J. Biol. Chem. – 1979. – 254, № 16. – P. 7820– 7826. 5. Kaguni L.S., Clayton D.A. Template�directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1982. – 79, № 4. – P. 983–987. 6. Weaver D.T., De Pamphilis M.L. Specific sequences in native DNA that arrest synthesis by DNA poly� merase alpha // J. Biol. Chem. – 1982. – 257, № 4. – P. 2075–2086. 7. Komissarova N., Kashlev M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates back� ward, leaving the 3’ end of the RNA intact and extrud� ed // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1997. – 94, № 5. – P. 1755–1760. 8. Nagatsugi F., Sasaki S. Chemical tools for targeted mutagenesis of DNA based on triple helix formation // Biol. Pharm. Bull. – 2004. – 27, № 4. – P. 463–467. 9. Murphy D., Eritja R., Redmond G. Monitoring denatu� ration behaviour and comparative stability of DNA triple helices using oligonuleotide – gold nanoparticle conjugates // Nucl. Acids Res. – 2004. – 32, № 7. – e65. DOI: 10.1093/nar/gnh065. 10. Zain R., Sun J.S. Do natural DNA triple�helical struc� tures occur and function in vivo? // Cell Mol. Life Sci. – 2003. – 60, № 5. – P. 862–870. 11. Bianchi A., Wells R.D., Heintz N.H., Caddle M.S. Sequences near the origin of replication of the DHFR locus of Chinese hamster ovary cells adopt left�handed Z�DNA and triplex structures // J. Biol. Chem. – 1990. – 265, № 35. – P. 21789–21796. 12. Kohwi Y., Kohwi#Shigematsu T. Altered gene expression correlates with DNA structure // Genes Dev. – 1991. – 5, № 12B. – P. 2547–2554. 13. Rooney S.M., Moore P.D. Antiparallel, intramolecular triplex DNA stimulates homologous recombination in human cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 92, № 6. – P. 2141–2144. 14. Kohwi Y., Panchenko Y. Transcription�dependent recombination induced by triple�helix formation // Genes Dev. – 1993. – 7, № 9. – Р. 1766–1778. 15. Kato M., McAllister C.J., Hokabe S., Shimizu N., Lyubchenko Y.L. Structural heterogeneity of pyrimi� dine/purine�biased DNA sequence analyzed by atomic force microscopy // Eur. J. Biochem. – 2002. – 269, № 15. – P. 3632–3636. 16. Goff S.P. Retroviridae : The retroviruses and their repli� cation // Fields Virology / Eds D.M. Knipe, P.M. How� ley. – Philadelphia : Lippincott, Williams and Wilkins, 2001. – P. 843–911. 17. Desrosiers R.C. Nonhuman lentiviruses // Ibid. – P. 2095– 2121. 18. Chen H., Wilcox G., Kertayadnya G., Wood C. Characterization of the Jembrana disease virus tat gene and the cis� and trans�regulatory elements in its long terminal repeats // J. Virology. – 1999. – 73, № 1. – P. 658–666. 19. Gonda M., Luther D., Fong S., Tobin J. Bovine immun� odeficiency virus: molecular biology and virus�host interactions // Virus Res. – 1994. – 32, № 2. – P. 155– 181. 20. Gillet N., Florins A., Boxus M., Burteau C., Nigro A., Vandermeers F., Balon H., Bouzar A., Defoiche J., Burny A., Reichert M., Ketmann R., Willems L. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti�retroviral therapies in human // Retrovirology. – 2007. – 4, № 18. – P. 1–32. 21. Бродский Л.И., Драчев А.Л., Татузов Р.Л., Чума# ков А.П. Пакет прикладных программ для анализа последовательностей биополимеров: GeneBee // Биополимеры и клетка. – 1991. – 7, № 1. – С. 10– 14. 22. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, ад� сорбированных на аминослюде // Биоорган. хи� мия. – 2006. – 32, № 5. – С. 494–510. 23. Лиманский А.П. Исследование аминомодифици� рованной слюды как субстрата для атомно�сило� вой микроскопии нуклеиновых кислот // Біопо� лімери і клітина. – 2001. – 17, № 4. – С. 292– 297. 24. Zhang H., He H., Wang J., Mu T., Liu Z. Force titration of amino group�terminated self�assembled monolayers using chemical force microscopy // Appl. Phys. – 1998. – A66. – P. S269–S271. 25. Vezenov D., Noy A., Rozsnyai L., Lieber C. Force titra� tions and ionization state sensitive imaging of function� al groups in aqueous solutions by chemical force microscopy // J. Amer. Chem. Soc. – 1997. – 119. – P. 2006–2015. 26. Lyamichev V.I., Mirkin S.M., Kumarev V.P., Bara# nova L.V., Vologodskii A.V., Frank#Kamenetskii M.D. Energetics of the B�H transition in supercoiled DNA carrying d(CT)x · d(AG)x and d(C)n · d(G)n inserts // Nucl. Acids Res. – 1989. – 17, № 22. – Р. 9417– 9423. 27. Kohwi Y. Cationic metal�specific structures adopted by the poly (dG) region and the direct repeats in the chicken adult beta A globin gene promoter // Nucl. Acids Res. – 1989. – 17, № 12. – P. 4493–4502. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 118 О.Ю. Лиманська 28. Klysik J. An intramolecular triplex structure from non� mirror repeated sequence containing both Py: Pu·Py and Pu: Pu·Py triads // J. Mol. Biol. – 1995. – 245, № 5. – Р. 499–507. 29. Лиманская О., Rola M., Bicka L., Kuzmak J., Лиман# ский А. Детекция провирусной ДНК вируса имму� нодефицита крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусоло� гии. – 2005. – № 2. – С. 38–43. 30. Limansky A.P., Limanskaya O.Yu. Comparison of primer sets for detection of bovine leukemia virus by polymerase chain reaction // Bull. Veterinary Inst. Pulawy (Poland). – 2002. – 46, № 1. – P. 27–36. 31. Goni J., Crus X., Orozco M. Triplex�forming oligonu� cleotide target sequences in the human genome // Nucl. Acids Res. – 2004. – 32, № 1. – P. 354–360. 32. Франк#Каменецкий М.Д. Век ДНК. – М., 2004. – 240 с. 33. Lyamichev V., Mirkin S., Frank#Kamenetskii M. Structu� re of (dG)n · (dC)n under superhelical stress and acid pH // J. Biomol. Struct. & Dyn. – 1987. – 5, № 2. – P. 275–282. 34. Зенгер В. Принципы структурной организации нук� леиновых кислот : Пер. с англ. – М.: Мир, 1987. – 584 с. 35. Wu A., Li Z., Yu L., Wang H., Wang E. Plasmid DNA network on a mica substrate investigated by atomic force microscopy // Analyt. Sci. – 2001. – 17, № 5. – P. 583–584. Поступила 26.11.08

Поліпуринові/поліпіримідинові послідовності з потенціалом утворення триплексів у провірусній ДНК ретровірусів великої рогатої худоби

Репозитарії

Схожі ресурси