Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании

Исследовали динамику эпигенотипов Dunaliella viridis при накопительном и квазинепрерывном культивировании. Установлено, что паттерн содержания нуклеиновых кислот, белков, триацилглицеридов, β-каротина, который характеризует эпигенотип, зависит от условий культивирования микроводорослей. Квазинепреры...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2013
Автори:	Божков, А.И., Сысенко, Е.И., Мензянова, Н.Г., Кизилова, В.Ю.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України 2013
Назва видання:	Альгология
Теми:	Физиология, биохимия, биофизика
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/67735
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании / А.И. Божков, Е.И. Сысенко, Н.Г. Мензянова, В.Ю. Кизилова // Альгология. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 231-247. — Бібліогр.: 39 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-67735
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-677352014-09-11T03:01:54Z Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании Божков, А.И. Сысенко, Е.И. Мензянова, Н.Г. Кизилова, В.Ю. Физиология, биохимия, биофизика Исследовали динамику эпигенотипов Dunaliella viridis при накопительном и квазинепрерывном культивировании. Установлено, что паттерн содержания нуклеиновых кислот, белков, триацилглицеридов, β-каротина, который характеризует эпигенотип, зависит от условий культивирования микроводорослей. Квазинепрерывное культивирование D. viridis позволяет увеличить выход биомассы на 23 % по сравнению с накопительным культивированием, при этом удельная продуктивность в 3 раза меньше, чем при накопительном культивировании. Обнаружено, что интенсивность роста микроводорослей коррелирует с накоплением экзополисахаридов в культуральной среде. Досліджували динаміку формування епігенотипів Dunaliella viridis при накопичувальному та квазібезперервному культивуванні. Встановлено, що паттерн вмісту нуклеїнових кислот, білків, триацилгліцеридів, β-каротина, який характеризує епігенотип, залежить від умов культивування мікроводоростей. Квазібезперервне культивування D. viridis дозволяє збільшити вихід біомаси на 23 % у порівнянні з накопичувальним культивуванням, при цьому питома продуктивність у 3 рази менша, ніж при накопичувальному культивуванні. Інтенсивність росту мікроводоростей корелює із накопиченням екзополісахаридів у культуральному середовищі. The dynamics of Dunaliella viridis epigenotypes at cumulative and quasicontinuous cultivation was studied. It was found that the pattern of nucleic acids, proteins, triacylglycerides, β-carotene, which characterizes epigenotype depends on the conditions of cultivation of microalgae. Quasicontinuous cultivation of D. viridis can increase biomass yield by 23 % compared to the cumulative cultivation, with the specific productivity was 3 times less than the cumulative cultivation. It was found that the growth rate of the microalgae correlates with the accumulation exopolysaccharides in the culture medium. 2013 Article Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании / А.И. Божков, Е.И. Сысенко, Н.Г. Мензянова, В.Ю. Кизилова // Альгология. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 231-247. — Бібліогр.: 39 назв. — рос. 0868-8540 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/67735 574; 591.544 ru Альгология Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Физиология, биохимия, биофизика Физиология, биохимия, биофизика
spellingShingle	Физиология, биохимия, биофизика Физиология, биохимия, биофизика Божков, А.И. Сысенко, Е.И. Мензянова, Н.Г. Кизилова, В.Ю. Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании Альгология
description	Исследовали динамику эпигенотипов Dunaliella viridis при накопительном и квазинепрерывном культивировании. Установлено, что паттерн содержания нуклеиновых кислот, белков, триацилглицеридов, β-каротина, который характеризует эпигенотип, зависит от условий культивирования микроводорослей. Квазинепрерывное культивирование D. viridis позволяет увеличить выход биомассы на 23 % по сравнению с накопительным культивированием, при этом удельная продуктивность в 3 раза меньше, чем при накопительном культивировании. Обнаружено, что интенсивность роста микроводорослей коррелирует с накоплением экзополисахаридов в культуральной среде.
format	Article
author	Божков, А.И. Сысенко, Е.И. Мензянова, Н.Г. Кизилова, В.Ю.
author_facet	Божков, А.И. Сысенко, Е.И. Мензянова, Н.Г. Кизилова, В.Ю.
author_sort	Божков, А.И.
title	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
title_short	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
title_full	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
title_fullStr	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
title_full_unstemmed	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
title_sort	динамика функциональных эпигенотипов dunaliella viridis teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании
publisher	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
publishDate	2013
topic_facet	Физиология, биохимия, биофизика
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/67735
citation_txt	Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании / А.И. Божков, Е.И. Сысенко, Н.Г. Мензянова, В.Ю. Кизилова // Альгология. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 231-247. — Бібліогр.: 39 назв. — рос.
series	Альгология
work_keys_str_mv	AT božkovai dinamikafunkcionalʹnyhépigenotipovdunaliellaviridisteodorprinakopitelʹnomikvazinepreryvnomkulʹtivirovanii AT sysenkoei dinamikafunkcionalʹnyhépigenotipovdunaliellaviridisteodorprinakopitelʹnomikvazinepreryvnomkulʹtivirovanii AT menzânovang dinamikafunkcionalʹnyhépigenotipovdunaliellaviridisteodorprinakopitelʹnomikvazinepreryvnomkulʹtivirovanii AT kizilovavû dinamikafunkcionalʹnyhépigenotipovdunaliellaviridisteodorprinakopitelʹnomikvazinepreryvnomkulʹtivirovanii
first_indexed	2025-07-05T17:44:17Z
last_indexed	2025-07-05T17:44:17Z
_version_	1836829856604618752
fulltext	Физиология, биохимия, биофизика ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 231 УДК 574; 591.544 А.И. БОЖКОВ, Е.И. СЫСЕНКО, Н.Г. МЕНЗЯНОВА, В.Ю. КИЗИЛОВА НИИ биологии Харьковского нац. ун-та им. В.Н. Каразина, пл. Свободы, 4, 61022 Харьков, Украина e-mail: bozhkov@univer.kharkov.ua ДИНАМИКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭПИГЕНОТИПОВ DUNALIELLA VIRIDIS TEODOR. ПРИ НАКОПИТЕЛЬНОМ И КВАЗИНЕПРЕРЫВНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ Исследовали динамику эпигенотипов Dunaliella viridis при накопительном и квазине- прерывном культивировании. Установлено, что паттерн содержания нуклеиновых кислот, белков, триацилглицеридов, β-каротина, который характеризует эпигенотип, зависит от условий культивирования микроводорослей. Квазинепрерывное культиви- рование D. viridis позволяет увеличить выход биомассы на 23 % по сравнению с на- копительным культивированием, при этом удельная продуктивность в 3 раза мень- ше, чем при накопительном культивировании. Обнаружено, что интенсивность роста микроводорослей коррелирует с накоплением экзополисахаридов в культуральной среде. К л ю ч е в ы е с л о в а : Dunaliella viridis, эпигенотип, состав биомассы, накопитель- ное культивирование, квазинепрерывное культивирование. Введение Интенсивное культивирование микроводорослей используется в техно- логиях получения биотоплива (Abou-Shanab et al., 2012; Yao et al., 2012; Campenni et al., 2013), биологически активных веществ (Christaki et al., 2012; Graziani et al., 2013) и медицинских препаратов (Mimouni et al., 2012; Soontornchaiboon et al., 2012; Amaro et al., 2013). Этот процесс предполагает высокую скорость накопления биомассы микроводорос- лей. При разработке интенсивных методов их культивирования, как правило, используют накопительные или квазинепрерывные культуры (Roleda et al., 2013; Samorì et al., 2013). К сожалению, существующие методы массового выращивания микроводорослей характеризуются очень низкой рентабельностью и требуют значительных капиталовложе- ний. Поэтому разработка высокорентабельных способов их культивиро- вания чрезвычайно актуальна. Многолетний опыт работы с культурами микроводорослей, в част- ности водорослями рода Dunaliella, показал, что частота их пересевов в условиях интенсивного культивирования влияет на состав биомассы (Bozhkov et al., 2009). Для решения этой проблемы необходимо, с одной стороны, обеспечить высокий выход биомассы микроводорослей и целе- © А.И. Божков, Е.И. Сысенко, Н.Г. Мензянова, В.Ю. Кизилова, 2013 А.И. Божков и др. 232 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 вых метаболитов, а с другой − получить биомассу микроводорослей оп- ределенного и относительно стабильного состава. Трудность решения этой задачи заключается в том, что при подборе интенсивных способов культивирования клетки адаптируются к новым условиям их выращивания. В процессе такой адаптации формируется новый метаболический паттерн — эпигенотип, вследствие чего состав биомассы микроводорослей характеризуется высокой вариабельностью в различных условиях культивирования (Божков и др., 2008). При разра- ботке интенсивных способов культивирования невозможно заранее предсказать состав биомассы микроводорослей в новых условиях. Одним из путей решения этой сложной проблемы является иссле- дование динамики формирования эпигенотипов микроводорослей в различных условиях культивирования. Ранее было показано, что в режиме накопительного культивирова- ния (НК) формируются возрастзависимые эпигенотипы — паттерн мета- болических показателей, определяющих особенности адаптации культу- ры к изменяющимся физико-химическим условиям (Божков и др., 2011). Характеристика возрастзависимых эпигенотипов представляет интерес с нескольких позиций. Во-первых, эпигенотипы, которые фор- мируются в различных условиях культивирования и на разных стадиях роста микроводорослей, определяют особенности биохимического со- става их биомассы. Во-вторых, динамика эпигенотипов в процессе куль- тивирования демонстрирует отсутствие жестких связей и наличие высо- кой вариабельности между различными метаболическими параметрами. Эту вариабельность необходимо учитывать в условиях массового куль- тивирования микроводорослей. И наконец, различия в динамике эпиге- нотипов могут отражать формирование различных механизмов адапта- ции в изменяющихся условиях среды. Целью данной работы было исследование взаимосвязи между ин- тенсивностью роста микроводорослей и динамикой эпигенотипов. Материалы и методы Для характеристики эпигенотипов D. viridis использовали показатели первичного метаболизма (содержание нуклеиновых кислот, белка), вто- ричного метаболизма (содержание триацилглицеридов и ß-каротина) и экзополисахаридов (ЭПС). 1. Культивирование микроводорослей Dunaliella viridis В экспериментах использовали альгологически чистую культуру одно- клеточных зеленых микроводорослей D. viridis var. viridis f. euchlora, штамм IBASU-A N29. Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 233 Условия культивирования Микроводоросли культивировали на среде Артари в условиях круг- лосуточного освещения (4 кЛк) при температуре 26—28 оС. Начальная клеточная плотность для культур составляла 1,3 млн кл./мл. Культиви- рование проводили двумя способами: 1) в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, объем клеточной суспен- зии 20 мл, толщина культурального слоя 0,5 см. Для уменьшения испа- рения жидкости колбы закрывали полиэтиленовой пленкой; 2) в плоскопараллельных реакторах высотой 9 см, шириной 39 см, длиной 26 см, объем клеточной суспензии 1,5 л, толщина культурально- го слоя 1,5 см. Реакторы накрывали стеклянными крышками и еже- дневно для компенсации испарения в реакторы добавляли необходимое количество дистиллированной воды. Культивирование микроводорослей проводили без дополнительного барботирования, но ежедневно механически перемешивали суспензию клеток (1 раз в сутки в течение 5—10 мин). Сразу после перемешивания отбирали аликвоты для определения количества клеток (которое под- считывали в камере Горяева), содержания хлорофиллов, белка, нуклеи- новых кислот и липидов в клетках, а также экзополисахаридов (ЭПС) в культуральной среде. Режимы культивирования микроводорослей Накопительное культивирование (НК). Микроводоросли культивиро- вали без отбора биомассы и внесения свежих порций культуральной среды до выхода на стационарный уровень. Квазинепрерывное культивирование (КНК). В этом режиме, начиная с 14-х суток культивирования, каждые 7 дней отбирали 50 % клеточной суспензии D. viridis и вносили такой же объем свежей среды Артари. 2. Определение содержания хлорофиллов (а + b), нейтральных липидов, β-каротина, нуклеиновых кислот Для определения биохимических показателей в каждой эксперимен- тальной точке объединяли биомассу микроводорослей из 3 колб (общий объем клеточной суспензии 60 мл). В трех экспериментальных повтор- ностях использовали клеточный материал из 50 колб. При определении биохимических показателей в биомассе микроводорослей, которые вы- ращивали в культиваторе, для анализа отбирали такой же объем клеточ- ной суспензии (60 мл). Клетки микроводорослей осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 20 мин, затем осадок дважды промывали средой Артари для удаления экзометаболитов. К отмытым осадкам клеток последовательно добавляли смеси органических растворителей хлороформ—метанол (1:2) и хлороформ—метанол—вода (1:2:0.8). В полученном хлороформном экс- тракте определяли содержание хлорофиллов, липидов и β-каротина (Bozhkov, Menzyanova, 1997). А.И. Божков и др. 234 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 Определение хлорофиллов (a + b) Для оценки суммарного содержания хлорофиллов (a + b) определя- ли экстинкцию хлороформного экстракта при λ = 649 и 665 нм на спек- трофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия). Содержание хлорофиллов рас- считывали по формуле (Гавриленко и др., 1975): Схл. (а +b) = 6,10 Е665 + 20,04 Е649 и выражали в мкг/млн кл. Определение содержания нейтральных липидов и β-каротина Хлороформные экстракты анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах Sorbfil (Россия) в системе растворителей гексан—диэтиловый эфир (4:1). Окрашенную в желто-оранжевый цвет фракцию на линии фронта растворителя идентифицировали с помощью свидетеля как β-каротин. Фракцию β-каротина соскабливали и элюиро- вали смесью хлороформ—метанол (2:1). Экстинкцию элюата определяли при λ = 440 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия). Содержа- ние β-каротина в клетках водорослей рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в мкг/млн кл. После удаления фракции β-каротина фракции липидов визуализи- ровали в парах J2 и идентифицировали с помощью свидетелей. Для ко- личественного определения фракции липидов соскабливали, элюирова- ли смесью хлороформ—метанол (1:2). Экстракты упаривали досуха и минерализовали в течение 20 мин в концентрированной H2SO4 при тем- пературе 180 ºC. Затем пробы разбавляли водой и определяли экстинк- цию при λ = 400 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) (Гри- банов, Сергеев, 1975). Содержание фракций липидов рассчитывали по калибровочным кривым и выражали в мкг/млн кл. Определение содержания нуклеиновых кислот и белка в клетках D. viridis Осадки после экстракции липидов и пигментов дважды промывали смесью органических растворителей хлороформ—метанол (1:2). Затем осадки 3 раза промывали 5 % НClO4 при 4 оС. Гидролиз РНК проводи- ли в щелочной среде (0,3 N КОН, 1,5 ч, 37 оC), ДНК − в кислой среде (5 % НClO4, 20 мин, 100 оС). Экстинкцию гидролизатов определяли при λ = 270 и 290 нм. Содержание нуклеиновых кислот рассчитывали по формуле (Спирин, 1958): СРНК = [(Е270 — Е290) ч 0,19)] ч 10,5; СДНК = [(Е270 — Е290) ч 0,19)] ч 10,1 и выражали в мкг/млн кл. Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 235 Осадки после гидролиза нуклеиновых кислот растворяли в 1 N NaOH, определяли содержание белка по методу Лоури (Lowry et al., 1957) и выражали в мкг/млн кл. 3. Определение содержания экзополисахаридов в культуральных фильтратах D. viridis Культуральные фильтраты получали после осаждения клеток микрово- дорослей при 12000 об./мин, в течение 15 мин, ЭПС выделяли по из- вестному методу (Horiuchi et al., 2003). Для этого в культуральных фильтратах значения рН доводили до 10,0—10,3 путем внесения 1 N NaOH. Для формирования осадка ЭПС пробы инкубировали при ком- натной температуре в течение 15 мин. Затем их центрифугировали (при 12000 g, 15 мин, 4 оС). Полученные осадки ЭПС дважды промывали 50 мМ CaCl2, затем растворяли в 50 мМ ЭДТА и определяли углеводы фенольным методом (Dubois et al., 1956). Содержание ЭПС выражали в мкг глюкозы/мл среды. 4. Статистическая обработка результатов Эксперименты проводили в трех повторностях с 4 биологическими по- вторами для каждой экспериментальной точки. Результаты статистиче- ски обрабатывали по методу Стъюдента-Фишера. Достоверность разли- чий между выборками определяли с помощью непараметрического ме- тода, используя U-критерий Манна-Уитни (Гублер, Генкин, 1973). Результаты исследования Интенсивность роста и характеристика эпигенотипов D. viridis при накопительном культивировании При культивировании микроводорослей в конических колбах Эрлен- мейера (начальная клеточная плотность 1,3 млн/мл) выход в стационар- ную фазу наблюдался на 30-е сутки роста. В случае культивирования в реакторах плоского типа (начальная клеточная плотность 1,3 млн/мл) стационарная фаза также наступала на 28—30-е сутки роста (рис. 1). При этом в стационарной фазе концентрация клеток в колбах составля- ла 9—10 млн/мл, а в реакторах — 16—18 млн/мл. В экспоненциальной фазе (10—14-е сутки роста) концентрация кле- ток при культивировании в колбах и плоскопараллельных реакторах бы- ла одинаковой, но паттерны метаболических показателей в различных условиях культивирования существенно отличались (рис. 2). Так, в кле- точной биомассе, полученной из плоскопараллельных реакторов, со- держание белка было в 2,6 раза больше, а содержание РНК, β-каротина и триацилглицеридов, соответственно, в 3,7; 6,0 и 3,9 раза меньше чем в клеточной биомассе, полученной из колб (см. рис. 2). А.И. Божков и др. 236 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 Выход культур микроводорослей в стационарную фазу роста сопро- вождался формированием нового паттерна метаболических показателей как в колбах, так и в реакторах (см. рис. 2, 3). Паттерны метаболиче- ских показателей в стационарной фазе роста значительно отличались от паттернов в экспоненциальной фазе роста. Рис. 1. Динамика роста микроводорослей Dunaliella viridis в колбах Эрленмейера (1) и в плоскопараллельных реакторах (2) 0 0,5 1 1,5 2 РНК ДНК БелокКаротин ТГ НК (колбы) НК (реакторы) Рис. 2. Функциональные эпигенотипы, формирующиеся в экспоненциальной фазе роста микроводорослей Dunaliella viridis в условиях НК в колбах Эрленмейера (10-е сутки) и в плоскопараллельных реакторах (14-е сутки). Содержание белка выражено в мкг/105кл., содержание ДНК, РНК, ТГ и β-каротина — в мкг/106 кл. Динамика паттернов метаболических показателей существенно раз- личалась для реакторов и колб. Так, при культивировании в колбах в биомассе микроводорослей в стационарной фазе роста содержание бел- ка, β-каротина и триацилглицеридов было в 2,2; 2,9 и 1,4 раза больше, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 8 16 24 32 40 48 56 Время культивирования, сут С , м лн к л. /м л 1 2 Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 237 чем в экспоненциальной фазе. Содержание нуклеиновых кислот в экс- поненциальной и стационарной фазах роста отличалось незначительно (табл. 1). Таблица 1 Содержание РНК, ДНК, β-каротина и триацилглицеридов (ТГ) в клетках микроводо- рослей Dunaliella viridis в различных фазах роста в условиях НК РНК ДНК Белок β-каротин ТГ Условия культивирования мкг/млн кл. Экспон. фаза 1,740±0,253 0,140±0,021 2,80±0,042 0,600±0,090 0,700±0,105 Стац. фаза 1,752±0,263 0,180±0,027 6,20±0,093 1,750±0,263 0,970±0,146 К о л б ы ∆, раз +0,99 +0,78 +2,2 +2,9 +1,4 Экспон. фаза 0,477±0,071 0,121±0,018 7,300±1,100 0,100±0,020 0,180±0,030 Стац. фаза 0,474±0,032 0,050±0,001 1,950±0,250 0,180±0,080 1,480±0,120 Р е а к то р ы ∆, раз -1,01 -2,4 -3,74 +1,8 +8,2 О б о з н а ч е н и я . ∆ — Различия между показателями в экспоненциальной и ста- ционарной фазе роста, где «+» — увеличение, « - » — уменьшение абсолютных значе- ний, «0» — отсутствие различий. При культивировании в реакторах в биомассе микроводорослей в стационарной фазе роста содержание белка было в 3,6 раза меньше, со- держание β-каротина и триацилглицеридов, соответственно, в 1,8 и 8 раз больше, чем в экспоненциальной фазе роста (см. табл. 1). При этом в стационарной фазе содержание ДНК в биомассе было в 2,4 раза меньше, чем в экспоненциальной фазе (см. табл. 1). Следовательно, условия культивирования существенно влияют на формирование эпигенотипов, что подтверждается изменением соотно- шений между исследованными параметрами. Можно полагать, что в процессе культивирования в колбах и реакторах формируются специфи- ческие физико-химическиех условия, определяющие особенности адап- тации микроводорослей. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в результате адаптации микроводорослей формируются специфиче- ские метаболические паттерны — эпигенотипы. Исходя из этого, можно предположить, что стабилизация физико- химических условий в процессе культивирования позволит уменьшить А.И. Божков и др. 238 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 вариабельность эпигенотипов, которая является одной из важнейших проблем в различных биотехнологиях и экспериментальной альгологии. На следующем этапе работы мы определяли метаболические пат- терны в клетках D. viridis в условиях КНК. 0 0,5 1 1,5 2 РНК ДНК БелокКаротин ТГ НК (колбы) НК (реакторы) Рис. 3. Функциональные эпигенотипы, формирующиеся в стационарной фазе роста микроводорослей Dunaliella viridis в условиях НК в колбах Эрленмейера (40-е сутки) и в плоскопараллельных реакторах (56-е сутки). Содержание белка выражено в мкг/105 кл., содержание ДНК, РНК, ТГ и β-каротина — в мкг/106 кл. Интенсивность роста и характеристика эпигенотипов D. viridis в условиях КНК в плоскопараллельных реакторах На 14-е сутки роста, т.е. в середине экспоненциальной фазы роста, 50 % клеточной суспензии удаляли вместе со средой и в реактор вносили та- кой же объем свежей среды Артари. Процедуру отбора осуществляли каждые 7 дней в течение 56 дней роста. Этот режим культивирования был принят за КНК по схеме (14→7+7…). После отбора концентрация клеток восстанавливалась до исходного значения 5—6 млн кл./мл за 7 дней культивирования (рис. 4). Повторе- ние цикла отбора и роста позволило поддерживать концентрацию кле- ток на постоянном уровне на протяжении 42 дней роста (14—56-е сутки) (см. рис. 4). Следовательно, по концентрации клеток на протяжении 42-х дней роста культура соответствовала 14-м суткам, т.е. середине экспоненциальной фазы НК. В условиях НК выход сухой биомассы из плоскопараллельного ре- актора за 56 дней составил 2,5±0,04 г, а удельная продуктивность — 1,68±0,06 г/л. В условиях КНК выход сухой биомассы за этот же период составил 3,08±0,02 г (т.е. на 23 % больше, чем для НК). Но удельная Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 239 продуктивность была в 3 раза меньше (0,51±0,01 г/л), чем при НК (табл. 2). Рис. 4. Динамика роста микроводорослей Dunaliella viridis в плоскопараллельных реакторах в условиях НК (1) и КНК (2) Таблица 2 Суммарный выход сухой биомассы микроводорослей Dunaliella viridis и удельная продуктивность культуры микроводорослей в различных режимах культивирования Режим культиви- рования Суммарный выход биомассы, г/реактор Удельная продук- тивность, г/л Общий объем среды культивирования, л НК 2,50±0,04 1,68±0,06 1,5 КНК 3,08±0,02 0,51±0,01* 6,0 Примечание : здесь и в табл. 4 звездочкой отмечены значения для варианта КНК, достоверно отличающиеся от значений для варианта НК (р < 0,05). Время культиви- рования 56 суток. Следовательно, при КНК (14→7+7…) происходит увеличение об- щего выхода сухой биомассы в расчете на реактор на 23 % по сравне- нию с НК. Однако частый отбор клеточной биомассы и замена среды снижают удельную продуктивность культуры микроводорослей. Весьма вероятно, что изменение условий КНК, например, реализа- ция частичных отборов клеточной биомассы не на 14-е сутки (в экспо- ненциальной фазе), а на 28-й день (в стационарной фазе) может при- вести к увеличению удельной продуктивности. Далее были проанализированы особенности эпигенотипов на позд- них этапах культивирования (56-е сутки) в условиях КНК и НК. Уста- 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 14 21 28 35 42 49 56 Время культивирования, сут С , м лн к л. /м л 1 2 А.И. Божков и др. 240 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 новлено, что в условиях НК в стационарной фазе в биомассе микрово- дорослей содержание β-каротина увеличивается в 1,8 раза, а триацилг- лицеридов — в 8 раз по сравнению с экспоненциальной фазой (табл. 3). Накопление продуктов вторичного обмена может служить маркером старения клеточных культур (Божков и др., 2011). Таблица 3 Состав биомассы Dunaliella viridis на 14-е и 56-е сутки роста в различных условиях культивирования Условия культивирования РНК ДНК Белок β-каротин ТГ НК 14-е сутки (экспоненциальная фаза) 0,477±0,071 0,121±0,018 7,300±1,100 0,100±0,020 0,180±0,030 НК 56-е сутки (стационарная фаза) 0,474±0,032 0,050±0,001 1,950±0,250 0,180±0,080 1,480±0,120 КНК 56-е сутки (стационарная фаза) 0,354±0,053 0,046±0,006 1,300±0,150 0,080±0,001 0,140±0,020 В биомассе микроводорослей содержание β-каротина и триацилгли- церидов на 56-е сутки роста в условиях КНК и в экспоненциальной фа- зе роста в условиях НК отличалось незначительно, однако было сущест- венно ниже, чем на 56-е сутки роста в условиях НК (см. табл. 3). В условиях НК значительные различия были выявлены в содержа- нии белка, ДНК и ТГ в биомассе микроводорослей на 14-е и 56-е сутки роста (см. табл. 3). Возможно, в условиях КНК формируется эпигено- тип, который сильно отличается от вариантов эпигенотипов в экспо- ненциальной и стационарной фазах в условиях НК. Известно, что в процессе роста микроводоросли D. viridis экскрети- руют в среду полисахариды (Mohamed, 2008; Angelis et al, 2012; Fiori et al., 2012; Geun Goo et al., 2012). Интерес к ЭПС микроводорослей свя- зан с их возможным использованием: — в пищевых и фармакологических технологиях в качестве альтер- нативы пектину высших растений (Fang et al., 2008); — в фармацевтической индустрии в качестве антивирусных, анти- канцерогенных и иммуностимулирующих агентов (Jeong et al., 2012); — в качестве эффективных хелаторов тяжелых металлов (Paperi et al., 2006; Micheletti et al., 2008). Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 241 Экзополисахариды могут функционировать как временное экстра- клеточное депо углеводов и в зависимости от функциональных потреб- ностей повторно транспортироваться в клетки (Yang et al., 2008). В условиях НК на 56-е сутки роста выход ЭПС из одного реактора составил 48±9,8 мг при удельной продуктивности 32,5±6,5 мг/л (см. табл. 4). В условиях КНК общий выход ЭПС составил 35±6,3 мг из ре- актора, а удельная продуктивность была в 5 раз меньше (6,5±1,1 мг/л), чем в условиях НК (см. табл. 4). Таблица 4 Суммарный выход экзополисахаридов и их удельная продуктивность в культуре микроводорослей Dunaliella viridis в различных режимах культивирования Режим культивирования Выход ЭПС, мг глюкозы/реактор Удельная продуктив- ность, мг глюкозы/л Общий объем среды культивиро- вания, л НК 48,0±9,8 32,5±6,5 1,5 КНК 35,0±6,3 6,5±1,1* 6,0 Учитывая выявленные различия, на следующем этапе работы опре- деляли динамику содержания ЭПС в условиях НК и КНК. В режиме НК содержание ЭПС в культуральной среде в экспонен- циальной фазе роста составляло 7—8 мг глюкозы/л, а в стационарной — 21—33 мг глюкозы/л (см. рис. 5). В условиях КНК содержание ЭПС в среде культивирования не превышало 10 мг глюкозы/л, что в 2—4 раза меньше, чем в условиях НК (рис. 5). Кроме того, в условиях НК и КНК динамика содержания ЭПС в культуральной среде совпадала с динамикой роста клеток в культуре (рис. 4, 5). Как уже отмечалось, интенсивность роста D. viridis в условиях КНК была значительно ниже, чем в условиях НК. Снижение интенсивности роста микроводорослей может быть связано с тем, что удаление 50 % клеток и культуральной среды является стрессом для клеточной популя- ции микроводорослей. Известно, что одной из основных реакций кле- точных культур микроводорослей на стресс является снижение их ин- тенсивности роста (Fiori et al., 2012; Jiang et al., 2012). В условиях КНК формирование стрессовой ситуации может быть связано со скачкообразным снижением концентрации экзометаболитов, снижением оптической плотности культуры и увеличением интенсивно- сти освещения. Резкие колебания интенсивности освещения могут зна- чительно влиять на активность фотосинтетического аппарата клетки и, вследствие этого, на интенсивность роста микроводорослей. Определение динамики содержания хлорофиллов а и b в биомассе микроводорослей в условиях НК и КНК показало, что в случае НК со- А.И. Божков и др. 242 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 держание хлорофиллов а и b достоверно увеличивалось в период с 14-х по 21-е сутки роста. После выхода на стационарную фазу роста содер- жание хлорофиллов а и b уменьшалось и на поздних этапах этой фазы достоверно не изменялось (рис. 6). В условиях КНК содержание хлорофиллов а и b в биомассе микро- водорослей было значительно меньше, чем при НК, в среднем в 1,5 раза (см. рис. 6). Низкое содержание хлорофиллов коррелировало со снижением интенсивности роста микроводорослей в условиях КНК. Рис. 5. Динамика накопления ЭПС (мкг глюкозы/мл) в культуральной среде микро- водорослей Dunaliella viridis в условиях НК (1) и КНК (2) в плоскопараллельных реакторах Рис. 6. Динамика содержания хлорофиллов (a + b) в клетках микроводорослей Dunaliella viridis в условиях НК (1) и КНК (2) в плоскопараллельных реакторах 0 5 10 15 20 25 30 35 40 14 21 28 35 42 49 56 Время культивирования, сут Э П С , м г гл ю ко зы /л 1 2 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 14 21 28 35 42 49 56 Время культивирования, сут Х ло ро ф ил лы ( а+ b) , м кг /м лн к л. 1 2 Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 243 Обсуждение Микроводоросли, в частности микроводоросли рода Dunaliella, являются перспективным объектом современных биотехнологий. Это связанно с уникальным составом биомассы, относительно высокой скоростью рос- та в природных популяциях (Ben-Amotz et al., 1995; Garcia-Gonzalez et al., 2003; Tafresh et al., 2006). В настоящее время биомассу этой водоросли получают в основном в открытых автотрофных системах, использующих солнечную энергию (Borowitzka et al., 1990; Garcia-Gonzalez et al., 2003, Tafresh et al., 2006; Del Campo et al., 2007). К сожалению, разработка интенсивных методов культивирования водорослей рода Dunaliella, которые активно ведутся с 60—70-х гг. ХХ в. (Soeder, 1980), не привела к созданию эффективных промышленных технологий. Из-за невысокой стоимости биомассы и значительной вариабельности ее состава промышленное культивирова- ние этих микроводорослей низкорентабельно. Существует представление, что высокая вариабельность содержания липидов, витаминов, белков в биомассе микроводорослей связана с не- стандартными условиями культивирования. Нет сомнений, что стандар- тизация условий является важнейшим этапом в любых биологических производствах. Однако культивирование D. viridis даже в строго стан- дартных условиях не позволяет получать стабильный и стандартный вы- ход целевых продуктов (Мензянова, 2002). Результаты данной работы показали, что в плоских реакторах от- крытого типа при небольшой толщине культурального слоя на 28— 30-е сутки роста концентрация клеток была в 2 раза больше, чем в кол- бах Эрленмейера (16—18 и 8—10 млн кл./мл соответственно). В обоих вариантах культуры выходили на стационарную фазу роста практически одновременно, на 29—30-е сутки культивирования. Эти результаты указывают на то, что в случае открытых реакторов, даже без использования систем аэрации, можно получать относительно высокий выход биомассы. В реакторе открытого типа на стадии экспоненциального роста можно выделить две фазы. Так, первые 10 дней интенсивность роста культуры в реакторе и колбах была одинаковой, в период с 10-х по 28-е сутки в реакторах она была выше, чем в колбах (см. рис. 1). Перевод накопительной культуры на 14-е сутки в режим КНК по схеме (14→7+7…) обеспечивал регулярное восстановление численности клеток за последующие 7 суток роста, но при этом удельная продуктив- ность за весь период культивирования была значительно ниже по срав- нению с НК. Учитывая, что при КНК проводили 50 %-ю замену среды, можно было ожидать значительного сокращения лаг-фазы, следовательно, бо- лее высокой скорости роста по сравнению с полной заменой культу- ральной среды. Однако этого не наблюдалось. Можно полагать, что в условиях КНК совокупность повторяющихся скачкообразных измене- А.И. Божков и др. 244 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 ний концентрации экзометаболитов и солей в среде, интенсивности ос- вещенности (за счет уменьшения клеточной плотности) является стрес- сом для клеточной популяции микроводорослей и приводит к уменьше- нию содержания хлорофиллов и в результате — к снижению интенсив- ности роста. Наиболее важным результатом этой работы явились выявленные особенности динамики эпигенотипов в различных условиях культивиро- вания. Динамика паттернов метаболических показателей в условиях НК и КНК указывает на высокую реактивность не только обмена белков и нуклеиновых кислот, содержания хлорофиллов, но и вторичного мета- болизма в клетках D. viridis. Эти результаты подтверждают полученные ранее данные о высокой чувствительности клеток D. viridis не только к локальным, но и глобальным факторам, а также к комбинированным их воздействиям (Божков и др., 2008). Разнообразие биотропных эффектов комбинированных воздействий локальных и глобальных факторов вы- ражается в неопределенности функционирования биологических систем (Bozhkov et al., 2008). Выводы 1. Культивирование Dunaliella viridis в квазинепрерывном режиме по схеме (14→7+7…) позволило увеличить выход биомассы в расчете на реактор на 23 % по сравнению с накопительным культивированием за тот же период времени, однако удельная продуктивность при этом сни- жалась. 2. Культивирование D. viridis в различных условиях (колбы и куль- тиваторы, толщина слоя 0,5 см и 1 см, накопительный и квазинепре- рывный режим культивирования) сопровождалось изменениями в со- ставе метаболитов (ДНК, РНК, белок, триацилглицериды и β-каротин), что отражает формирование различных эпигенотипов. 3. Интенсивность роста микроводорослей D. viridis при разных ре- жимах культивирования коррелирует с накоплением ЭПС в культураль- ной среде и содержанием хлорофиллов а и b в клетках. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Божков А.И., Ковалёва М.К., Мензянова Н.Г. Можно ли «отменить» процесс старения клеточных культур созданием оптимальных условий культивирования? // Усп. геронтол. − 2011. − 24, № 1. − С. 26—37. Божков А.И., Мензянова Н.Г., Ковалёва М.К. Годовой ритм интенсивности роста культур микроводоросли Dunaliella viridis Teodor. и флуктуации некоторых ге- лиофизических факторов // Альгология. — 2008. — 18, № 3. — С. 229—243. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. — М.: Высш. шк. — 1975. — 127 с. Грибанов Г.А., Сергеев С.А. Экспресс-микроанализ общих липидов сыворотки крови и их фракций // Вопр. мед. химии. — 1975. — 26. — С. 652—655. Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 245 Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в ме- дико-биологических исследованиях. — Л.: Медицина, 1973. — 141 с. Мензянова Н.Г. Интенсивность роста и состав биомассы в периодической культуре Dunaliella viridis Teodor. (Chlorophyta) // Альгология. — 2002. — 12, № 1. — С. 59—68. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеи- новых кислот // Биохимия. — 1958. — 23. — С. 656—662. Abou-Shanab R.A., Ji M.K., Kim H.C. et al. Microalgal species growing on piggery wastewa- ter as a valuable candidate for nutrient removal and biodiesel production // J. Environ. Manage. — 2012. — 115C. — P. 257—264. Amaro H.M., Barros R., Guedes A.C. et al. Microalgal compounds modulate carcinogenesis in the gastrointestinal tract // Trends Biotechnol. — 2013. — 31, N 2. — P. 92—98. Angelis S., Novak A.C., Sydney E.B. et al. Co-culture of microalgae, cyanobacteria, and macromycetes for exopolysaccharides production: process preliminary optimization and partial characterization // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2012. — 167, N 5. — P. 1092—1106. Ben-Amotz A. New mode of Dunaliella biotechnology: twophase growth for β-carotene pro- duction // Аppl. Phycol. — 1995. — 7. — Р. 65—68. Borowitzka L.J., Borowitzka M.A. Commercial production of β-carotene by Dunalella salina in open ponds // Bull. Mar. Sci. — 1990. — 47. — Р. 244—252. Bozhkov A.I., Menzyanova N.G. Age dependence of lipid metabolism and β-carotene content in cells of Dunaliella viridis Teod. // Hydrobiol. J. — 1997. — 33, N 6. — Р. 132—138. Bozhkov A.I., Menzyanova N.G., Kovalyova M.K. Annual rhythm of growth intensity of mi- croalgal culture Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta) and fluctuations of some helio- physical factors // Intern. J. Algae. − 2008. − 10, N 4. − P. 350—364. Bozhkov A.I., Menzyanova N.G., Kovalyova M.K. Seasonal peculiarities of the epigenotype formation in the copper-sensitive and copper-resistant strain of Dunaliella viridis Teod. in the process of accumulative cultivation // Ibid. − 2009. − 11, N 2. − P. 128—140. Campenni L., Nobre B.P., Santos C.A. et al. Carotenoid and lipid production by the autotro- phic microalga Chlorella protothecoides under nutritional, salinity, and luminosity stress conditions // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2013. — 97, N 3. — P. 1383−1393. Christaki E., Bonos E., Giannenas I., Florou-Paneri P. Functional properties of carotenoids originating from algae // J. Sci. Food Agric. — 2012. [Epub ahead of print]. Del Campo J.A., Garcнa-González M., Guerrero M.G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspective // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2007. — 74, N 6. — P. 1163—1174. Dubois М., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Calorimetric method for deter- mination of sugars and related substances // Anal. Chem. — 1956. — 28, N 3. — Р. 350—356. Fang Y., Al-Assaf S., Phillips G.O. et al. Binding behavior of calcium to polyuronates: Comparison of pectin with alginate // Carbohydrate Polymers. — 2008. — 72, N 2. — P. 334—341. Fiori E., Mazzotti M., Guerrini F., Pistocchi R. Combined effects of the herbicide terbuthy- lazine and temperature on different flagellates from the Northern Adriatic Sea // Aquat. Toxicol. —2012. — 128—129C. — P. 79—90. А.И. Божков и др. 246 ISSN 0868-8540. Algologia. 2013. V. 23. N 3 Garcia-Gonzalez M., Moreno J., Canavate J.P. et al. Condition for open-air outdoor of Du- naliella salina in souther Spain // Appl. Phycol. — 2003. — 15. — Р. 177—184. Geun G.B., Baek G., Jin C.D. et al. Characterization of a renewable extracellular polysac- charide from defatted microalgae Dunaliella tertiolecta // Biores. Technol. — 2012. — 129C. — P. 343—350. Graziani G., Schiavo S., Nicolai M.A. et al. Microalgae as human food: chemical and nutri- tional characteristics of the thermo-acidophilic microalga Galdieria sulphuraria // Food Funct. — 2013. — 4, N 1. — P. 144—152. Horiuchi J., Ohba I., Tada K. et al. Effective cell harvesting of halotolerant micoalgae Du- naliella tartiolecta with pH control // Biosci. Bioeng. — 2003. — 95, N 4. — P. 412— 415. Jeong B.E., Ko E.J., Joo H.G. Cytoprotective effects of fucoidan, an algae-derived polysac- charide on 5-fluorouracil-treated dendritic cells // Food Chem. Toxicol. — 2012. — 50, N 5. — P. 1480—1484. Jiang Y., Yoshida T., Quigg A. Photosynthetic performance, lipid production and biomass composition in response to nitrogen limitation in marine microalgae // Plant. Physiol. Biochem. — 2012. — 54. — P. 70—77. Lowry O.B., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall B.J. Protein measurement with Folin phe- nol reagent // Biol. Chem. — 1957. — 93. — P. 265—273. Micheletti E., Pereira S., Mannelli F. et al. Sheathless mutant of cyanobacterium Gloeothece sp. strain PCC 6909 with increased capacity to remove copper ions from aqueous solu- tions // Appl. Environ. Microbiol. — 2008. — 74, N 9. — P. 2797—2804. Mimouni V., Ulmann L., Pasquet V. et al. The potential of microalgae for the production of bioactive molecules of pharmaceutical interest // Curr. Pharm. Biotechnol. — 2012. — 13, N 15. — P. 2733—2750. Mohamed Z.A. Polysaccharides as a protective response against microcystin-induced oxida- tive stress in Chlorella vulgaris and Scenedesmus quadricauda and their possible signifi- cance in the aquatic ecosystem // Ecotoxicology. — 2008. — 17, N 6. — P. 504—516. Paperi R., Micheletti E., De Philippis R. Optimization of copper sorbing—desorbing cycles with confined cultures of the exopolysaccharide-producing cyanobacterium Cyanospira capsulate // J. Appl. Microbiol. — 2006. — 101. — P. 1351—1356. Roleda M.Y., Slocombe S.P., Leakey R.J. et al. Effects of temperature and nutrient regimes on biomass and lipid production by six oleaginous microalgae in batch culture employ- ing a two-phase cultivation strategy // Biores. Technol. — 2013. — 129. — P. 439—449. Samorì G., Samorì C., Guerrini F., Pistocchi R. Growth and nitrogen removal capacity of Desmodesmus communis and of a natural microalgae consortium in a batch culture system in view of urban wastewater treatment: Pt I // Water Res. — 2013. — 47, N 2. — P. 791—801. Soeder C.J. Massive cultivation of microalgae: results and prospects // Hydrobiolgia. — 1980. — 72. — P. 197—209. Soontornchaiboon W., Joo S.S., Kim S.M. Anti-inflammatory effects of violaxanthin isolated from microalga Chlorella ellipsoidea in RAW 264.7 macrophages // Biol. Pharm Bull. — 2012. — 35, N 7. — P. 1137—1144. Динамика функциональных эпигенотипов ISSN 0868-8540. Альгология. 2013. Т. 23. № 3 247 Tafresh А.Н., Shariat М. Pilot culture of three strains of Dunaliella salina for β-carotene production in open ponds in the central region of Iran // Microbiol. & Biotechnol. — 2006. — 22. — Р. 1003—1006. Yang Z., Li J.J. Effects of abiotic factors on algal extracellular polysaccharides content // Ying Yong Sheng Tai Xue Bao. — 2008. — 19, N 1. — P. 198—202. Yao C., Ai J., Cao X., Xue S., Zhang W. Enhancing starch production of a marine green microalga Tetraselmis subcordiformis through nutrient limitation // Biores. Technol. — 2012. — 118. — P. 438—444. Поступила 13 февраля 2013 г. Подписала в печать Е.И. Шнюкова A.I. Bozhkov, E.I. Sysenko, N.G. Menzyanova, V.Yu. Kizilova Research Institute of Biology, V.N. Karazin Kharkov National University, 4, Svobody Sq., 61022 Kharkov, Ukraine e-mail: bozhkov@univer.kharkov.ua DYNAMIC OF FUNCTIONAL EPIGENOTYPES DUNALIELLA VIRIDIS TEODOR. AT CUMULATIVE AND QUASICONTINUOUS CULTIVATION The dynamics of Dunaliella viridis epigenotypes at cumulative and quasicontinuous cultivation was studied. It was found that the pattern of nucleic acids, proteins, triacyl- glycerides, β-carotene, which characterizes epigenotype depends on the conditions of cultivation of microalgae. Quasicontinuous cultivation of D. viridis can increase bio- mass yield by 23 % compared to the cumulative cultivation, with the specific produc- tivity was 3 times less than the cumulative cultivation. It was found that the growth rate of the microalgae correlates with the accumulation exopolysaccharides in the cul- ture medium. K e y w o r d s : Dunaliella viridis, epigenotype, biomass composition, cumulative culti- vation, quasicontinuous cultivation.

Динамика функциональных эпигенотипов Dunaliella viridis Teodor. при накопительном и квазинепрерывном культивировании

Репозитарії

Схожі ресурси