Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс

С использованием методов фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» и стимуляции отдельной пресинаптической терминали были исследованы некоторые особенности высвобождения ГАМК в тормозных синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс....

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2009
Автори:	Шипшина, М.С., Веселовский, Н.С., Федулова, С.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2009
Назва видання:	Нейрофизиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68289
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс / М.С. Шипшина, Н.С. Веселовский, С.А. Федулова // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 3. — С. 199-205. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-68289
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-682892019-05-25T20:24:01Z Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс Шипшина, М.С. Веселовский, Н.С. Федулова, С.А. С использованием методов фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» и стимуляции отдельной пресинаптической терминали были исследованы некоторые особенности высвобождения ГАМК в тормозных синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс. З використанням методів фіксації потенціалу в конфігурації «ціла клітина» та стимуляції окремої пресинаптичної терміналі були досліджені деякі особливості вивільнення ГАМК у гальмівних синапсах культивованих нейронів спинного мозку щурів. Using the whole-cell patch-clamp technique and stimulation of a single presynaptic terminal, we studied peculiarities of GABA release in inhibitory synapses of cultured neurons of the rat spinal cord. Analyzing the amplitude distributions of evoked inhibitory postsynaptic currents, we estimated the main quantum parameters of transmitter release. It was demonstrated that the minimum transmitter release in GABA-ergic synapses of spinal neurons cultured 9 to 11 days is multiquantum (packets containing at least 2 or 3 quanta). The distribution of the number of released quanta sufficiently agreed with that theoretically calculated according to the Poisson law. It is hypothesized that the minimum simultaneous two (three-)-quantum release of GABA in synapses of spinal neurons can be related to synchronous involvement of two closely adjacent excited terminals, each of which possesses one active zone, or of one terminal with two active zones. Using the whole-cell patch-clamp technique and stimulation of a single presynaptic terminal, we studied peculiarities of GABA release in inhibitory synapses of cultured neurons of the rat spinal cord. Analyzing the amplitude distributions of evoked inhibitory postsynaptic currents, we estimated the main quantum parameters of transmitter release. It was demonstrated that the minimum transmitter release in GABA-ergic synapses of spinal neurons cultured 9 to 11 days is multiquantum (packets containing at least 2 or 3 quanta). The distribution of the number of released quanta sufficiently agreed with that theoretically calculated according to the Poisson law. It is hypothesized that the minimum simultaneous two (three-)-quantum release of GABA in synapses of spinal neurons can be related to synchronous involvement of two closely adjacent excited terminals, each of which possesses one active zone, or of one terminal with two active zones. 2009 Article Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс / М.С. Шипшина, Н.С. Веселовский, С.А. Федулова // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 3. — С. 199-205. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68289 577.352+577.338. ru Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	С использованием методов фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» и стимуляции отдельной пресинаптической терминали были исследованы некоторые особенности высвобождения ГАМК в тормозных синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс.
format	Article
author	Шипшина, М.С. Веселовский, Н.С. Федулова, С.А.
spellingShingle	Шипшина, М.С. Веселовский, Н.С. Федулова, С.А. Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс Нейрофизиология
author_facet	Шипшина, М.С. Веселовский, Н.С. Федулова, С.А.
author_sort	Шипшина, М.С.
title	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
title_short	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
title_full	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
title_fullStr	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
title_full_unstemmed	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
title_sort	квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в гамк-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс
publisher	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate	2009
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68289
citation_txt	Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс / М.С. Шипшина, Н.С. Веселовский, С.А. Федулова // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 3. — С. 199-205. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series	Нейрофизиология
work_keys_str_mv	AT šipšinams kvantovyeharakteristikivysvoboždeniânejroperedatčikavgamkérgičeskihsinapsahkulʹtiviruemyhnejronovspinnogomozgakrys AT veselovskijns kvantovyeharakteristikivysvoboždeniânejroperedatčikavgamkérgičeskihsinapsahkulʹtiviruemyhnejronovspinnogomozgakrys AT fedulovasa kvantovyeharakteristikivysvoboždeniânejroperedatčikavgamkérgičeskihsinapsahkulʹtiviruemyhnejronovspinnogomozgakrys
first_indexed	2025-07-05T18:08:13Z
last_indexed	2025-07-05T18:08:13Z
_version_	1836831363781623808
fulltext	НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3 199 УДК 577.352+577.338. М. С. ШИПШИНА1, Н. С. ВЕСЕЛОВСКИЙ1, С. А. ФЕДУЛОВА1 КВАНТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ НЕЙРОПЕРЕДАТЧИКА В ГАМК-ЭРГИЧЕСКИХ СИНАПСАХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НЕЙРОНОВ СПИННОГО МОЗГА КРЫС Поступила 15.03.09 С использованием методов фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» и сти- муляции отдельной пресинаптической терминали были исследованы некоторые особен- ности высвобождения ГАМК в тормозных синапсах культивируемых нейронов спинно- го мозга крыс. В ходе анализа распределений амплитуд вызванных тормозящих постси- наптических токов были определены основные квантовые параметры выброса медиато- ра. Показано, что в ГАМК-эргических синапсах спинальных нейронов, культивируемых в течение девяти–11 дней, минимальное высвобождение передатчика осуществляется пакетами квантов (не менее двух-трех). При этом распределение количества высво- бождаемых квантов достаточно хорошо соответствовало таковому, теоретически рас- считанному в соответствии с законами Пуассона. Предполагается, что одновременный минимально двухквантовый выброс ГАМК в синапсах нейронов спинного мозга может быть связан с одновременным вовлечением в процесс возбуждения двух близко рас- положенных терминалей, каждая из которых обладает одной активной зоной, или одной терминали с двумя активными зонами. КЛюЧЕВЫЕ СЛОВА: спинной мозг, ГАМК, синаптическая передача, квантовый анализ, закон Пуассона, активные зоны. 1 Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев (Украина). Эл. почта: shipshina@ya.ru (М. С. Шипшина). ВВЕДЕНИЕ Исключительно важная роль нейронных систем спинного мозга в восприятии и обработке проприо- цептивной, тактильной, висцеральной, темпера- турной и ноцицептивной информации очевидна. В нейронных сетях спинного мозга, как и в дру- гих отделах ЦНС, обработка афферентных сигна- лов в значительной степени основывается на тор- мозных процессах в ходе межнейронной передачи. ГАМК-эргические синаптические влияния игра- ют основную роль в регуляции такой передачи как в центральных, так и в периферических отделах нервной системы; механизмы этих влияний в на- стоящее время активно изучаются. Успешная раз- работка методических подходов к исследованию синаптической передачи через отдельные синапсы культивируемых нейронов ЦНС открывает возмож- ности непосредственного изучения феноменоло- гии и механизмов высвобождения нейромедиатора в таких соединениях [1, 2]. В подобных экспериментах начал широко приме- няться метод локальной внеклеточной электриче- ской стимуляции. В ответ на стимуляцию пресинап- тической терминали происходит кальцийзависимое высвобождение ГАМК, что в свою очередь при- водит к открыванию постсинаптических хлорсе- лективных ионных каналов, ассоциированных с ГАМКА-рецепторами [3]. Пиковые значения ампли- туд тормозящих постсинаптических токов (ТПСТ), входящих при этом через мембрану постсинапти- ческой клетки, как правило, варьируют. Согласно теории квантового выброса, вызываемое приходя- щим пресинаптическим потенциалом действия вы- свобождение нейропередатчика осуществляется дискретно (квантами) и имеет вероятностный ха- рактер [4]. Постсинаптический ответ в данном слу- чае отражает сумму квантовых выбросов медиато- НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3200 ра во всех локусах высвобождения (релиз-сайтах) в синапсе. Таким образом, важнейшим параметром вызванной синаптической передачи является веро- ятность высвобождения кванта трансмиттера. В нашей работе охарактеризованы особенности квантового высвобождения ГАМК в тормозных си- напсах культивируемых спинальных нейронов в условиях локальной стимуляции аксонной терми- нали в непосредственной близости от синаптиче- ского контакта. МЕТОДИКА Эксперименты проводились на нейронах спинного мозга, выращиваемых в условиях культуры низкой плотности (примерно 35 ⋅ 103 см–2) на девятый–11-й день культивирования. Культивировались клет- ки, полученные из ткани спинного мозга новорож- денных крыс линии Вистар, согласно методике, описанной ранее [5]. В данных условиях культи- вируемые нейроны устанавливают между собой синаптические контакты, хорошо различимые ви- зуально под микроскопом; компартменты синапти- чески связанных пар нейронов при этом доступны для микростимуляции и микроэлектродного отве- дения. Для регистрации вызванных ТПСТ (вТПСТ) ис- пользовались метод локальной электрической сти- муляции аксона в непосредственной близости (на расстоянии 10–20 мкм) от терминали и метод фик- сации потенциала на мембране постсинаптического нейрона в конфигурации «целая клетка». Иденти- фикация пресинаптической терминали синаптиче- ского соединения производилась под визуальным контролем с применением фазово-контрастной микроскопии при суммарном увеличении ×350. Стимуляция осуществлялась короткими (0.3–1.0 мс) толчками тока, пропускаемого через стеклян- ную микропипетку, которую подводили к терми- нали; амплитуду стимула варьировали от 12 до 30 В. Стимулирующие пипетки с сопротивлением 10 МОм заполняли внеклеточным базовым раствором следующего состава (в миллимолях на 1 л): NaCl – 140, KCl – 3, CaCl2 – 2, МgCl2 – 2, глюкоза – 30, HEPES – 20 (pH доводили до 7.4 путем добавления NaOH). Внутриклеточный раствор в пэтч-пипетках содержал в себе во всех случаях (в миллимолях на 1 л): калия глюконат – 100, KCl – 40, EGTA – 10, MgCl2 – 2.5, HEPES – 20 (pH доводили до 7.4 путем добавления КOH). Заполненные таким раствором пипетки имели сопротивление 6–8 МОм. Во вне- клеточный раствор добавляли блокаторы возбужда- ющей синаптической передачи (20 мкМ DNQX и 20 мкМ D-APV). Для блокирования ГАМКА-рецепто- ров использовался их селективный антагонист би- кукуллин (2.0 мкМ). Все реактивы были получены от фирмы «Sigma» (США). Смена растворов осу- ществлялась с помощью метода быстрой локаль- ной суперфузии, описанного ранее [3]. Сигналы, соответствующие постсинаптическим токам, подвергали фильтрации с частотой среза 5 кГц, оцифровывали и записывали с применением АЦП TL-1 и программного пакета «pClamp 9.0» (“Axon Instruments”, США); частота оцифровки со- ставляла 104 с–1. РЕЗУЛЬТАТЫ Характеристики вТПСТ и спонтанных ТПСТ (сТПСТ). Постсинаптические токи, возникающие в ответ на приложение деполяризующих стимулов к пресинаптической терминали в непосредственной близости от синаптического контакта, отводились от исследованных клеток при поддерживаемом по- тенциале –65 мВ. Их кинетические характеристи- ки соответствовали таковым, описанным ранее для ГАМКА-активируемых тормозящих токов [1, 2, 11, 12]. Синаптическая задержка вТПСТ в условиях на- ших экспериментов составляла в среднем 4.3 ± 0.1 мс (n = 10). Значения амплитуд ТПСТ обнаружи- вали линейную зависимость от величины поддер- живаемого потенциала на мембране постсинапти- ческой клетки. Рассчитанный потенциал реверсии этих постсинаптических токов составлял –30 ± 3 мВ (n = 3), что соответствовало равновесному по- тенциалу для ионов хлора в используемых раство- рах, определенному в соответствии с уравнением Нернста (рис. 1, А). Спад вТПСТ наилучшим образом аппроксими- ровался одной экспонентой со средней постоянной времени 30.7 ± 2.8 мс (n = 10) (рис. 1, А). Локаль- ная аппликация селективного антагониста ГАМКА- рецепторов бикукуллина в концентрации 2.0 мкM почти полностью и обратимо угнетала вТПСТ (Б). Приложение стрихнина в концентрации 1.0 мкМ не приводило к достоверному изменению амплиту- ды этих токов, что позволяло исключить наличие в них глицинергического компонента. Значения амплитуд сТПСТ флуктуировали от- носительно кратных величин, соответствующих М. С. ШИПШИНА, Н. С. ВЕСЕЛОВСКИЙ, С. А. ФЕДУЛОВА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3 201 пикам амплитудного распределения (рис. 2). При этом значение первой моды, отражающей эффект высвобождения единичного кванта, составляло –31.6 ± 0.8 пА (n = 4). Спад сТПСТ также хорошо аппроксимировался одной экспонентой со средней постоянной времени 30.5 ± 8.6 мс (n = 4). Таким образом, временной ход вТПСТ соответ- ствовал таковому сТПСТ, однако пиковые значения амплитуд вТПСТ при поддерживаемом потенциале –65 мВ варьировали в широких пределах (от –20 до –350 пА). Квантовые свойства вТПСТ в культуре кле- ток спинного мозга. Анализ числа квантовых со- бытий проводили на основании распределений пиковых амплитуд вТПСТ. Известно, что ампли- туда постсинаптического ответа пропорциональ- на количеству выброшенного нейропередатчика; при этом последний высвобождается дискретны- ми приблизительно равными порциями. Эффек- ты такого высвобождения, суммируясь, приво- дят к полимодальному распределению амплитуд. В условиях локальной стимуляции аксона ампли- туды регистрируемых вТПСТ флуктуировали от- Р и с. 1. Свойства вызванных тормозящих постсинаптических токов (вТПСТ), регистрируемых в культуре клеток спинного мозга. А – вольт-амперная характеристика вТПСТ. Равновесный потенциал для ионов хлора, рассчитанный по уравнению Нернста, составляет –30.49 мВ; регистрации проводились при t = 20 °С. На верхнем фрагменте – записи постсинаптических токов, регистрируемых при значениях поддерживаемого потенциала, который изменялся в пределах –90 … –0 мВ с шагом 10 мВ. На нижнем фрагменте – аппроксимация спада вТПСТ средней амплитуды с помощью одной экспоненты. Б – блокирующее действие бикукуллина (2.0 мкM) на вТПСТ в культивируемом нейроне спинного мозга: 1 – в условиях контроля, 2 – при аппликации бикукуллина, 3 – после отмывания. Р и с. 1. Властивості викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів, зареєстрованих у культурі клітин спинного мозку. КВАНТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ НЕЙРОПЕРЕДАТЧИКА -100 -80 -60 -40 -20 0 20 –400 –300 –200 –100 0 100 200 20 пА 20 мс 50 пА 20 мс 0 мВ пА 1 2 3 50 пА 20 мс А Б Р и с. 2. Кинетические характеристики спонтанных тормозящих постсинаптических токов (сТПСТ). 1 – наложенные записи сТПСТ, регистрируемых при значении поддерживаемого потенциала –65 мВ; 2 – аппроксимация спада сТПСТ минимальной амплитуды с помощью одной экспоненты; 3 – гистограмма распределения амплитуд сТПСТ (по оси абсцисс – амплитуда сТПСТ, пА; по оси ординат – число событий). Р и с. 2. Кінетичні характеристики спонтанних гальмуючих постсинаптичних струмів. -150 -120 -90 -60 -30 0 0 5 10 15 30 пА 100 мс 10 мс 20 пА пА 1 2 3 НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3202 М. С. ШИПШИНА, Н. С. ВЕСЕЛОВСКИЙ, С. А. ФЕДУЛОВА –240 –210 –180 –150 –120 –90 –60 –30 0 0 5 10 15 30 пА 20 мс пА –350 –300 –250 –200 –150 –100 –50 0 0 5 10 15 20 25 30 пА 20 мс пА Б Р и с. 3. Амплитудные распределения вызванных тормозящих постсинаптических токов (вТПСТ). А – гистограмма амплитуд вТПСТ, возникающих в результате минимального одновременного выброса двух квантов ГАМК, и аппроксимация амплитудного распределения семью нормальными распределениями. Б – гистограмма амплитуд вТПСТ, возникающих в результате минимального одновременного выброса трех квантов ГАМК, и аппроксимация амплитудного распределения шестью нормальными распределениями. Над каждой гистограммой представлены наложенные записи анализируемых вТПСТ. По оси абсцисс на А и Б – амплитуда вТПСТ, пА; по оси ординат – число событий. Р и с. 3. Амплітудні розподіли викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів. Р и с. 4. Применение пуассоновской статистики для описания вероятности высвобождения ГАМК в синапсах культивируемых нейронов спинного мозга. А – распределение количества синаптических событий, соответствующих высвобождению различного числа квантов. Распределение построено на основе гистограммы, представленной на рис. 3, А. Б – такое же распределение, которое было построено на основе гистограммы, изображенной на рис. 3, Б. Заштрихованные столбцы соответствуют экспериментальным данным, белые – величинам, полученным при описании экспериментальных данных законом Пуассона. По оси абсцисс на А и Б – количество одновременно выбрасываемых квантов нейромедиатора; по оси ординат – число событий, соответствующих выбросу того или иного количества квантов. Р и с. 4. Застосування пуассоновської статистики для опису імовірності вивільнення ГАМК у синапсах культивованих нейронів спинного мозку. А Б НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3 203 носительно неких кратных величин, соответству- ющих модам гистограмм распределений амплитуд этих токов [2, 6]. Аппроксимация эксперименталь- ных распределений пиковых значений амплитуд суммой нескольких гауссовых (нормальных) рас- пределений продемонстрировала наличие несколь- ких равно отстоящих друг от друга мод в диапазо- не –20 … –350 пА (рис. 3, А). Среднее расстояние между этими модами составляло 30.2 ± 3.4 пА (n = 5), а количество явных мод варьировало от двух до шести. Первая мода (на нуле) соответ- ствует отсутствиям реализации постсинаптиче- ского тормозного ответа; следовательно, пред- полагается, что в данных случаях квантового выброса в ответ на стимуляцию пресинаптическо- го участка аксона не происходит. Исходя из того, что расстояние между модами соответствует ве- личине эффекта высвобождения одного кванта в составе интегрального ТПСТ, можно заключить, что средняя величина эффекта выброса единич- ного кванта при поддерживаемом потенциале –65 мВ составляет порядка –30 пА. Это полностью соответствует величине эффекта, рассчитанной для сТПСТ (около –31 пА). Следует обратить особое внимание на то, что в условиях локальной стимуляции аксона высво- бождения единичного кванта нейротрансмитте- ра не происходило. Об этом свидетельствует пол- ное отсутствие на гистограммах амплитудного распределения вТПСТ моды на уровне –30 пА (n = 5) (pис. 3, А). В ряде экспериментов также не наблюдалось одновременного выброса двух кван- тов ГАМК– на амплитудных гистограммах отсут- ствовали две моды в районах значений –30 и –60 пА (n = 5). Таким образом, можно предположить, что в ГАМК-эргических синапсах нейронов спинного мозга крыс на девятый–11-й день культивирования высвобождение передатчика осуществляется груп- пами («пакетами»), состоящими как минимум из двух-трех квантов. Описание вероятности выброса ГАМК в синап- сах культивируемых нейронов спинного мозга. Ис- пользование амплитудного распределения ТПСТ позволяет применить вариационную статистику для описания процессов высвобождения нейроме- диатора. В ходе анализа квантовой синаптической передачи вероятность высвобождения нейротранс- миттера при условии низких вероятностей выброса может быть описана статистическим законом Пу- ассона [7]. Для этого необходимы переход от не- прерывного амплитудного распределения к рас- пределению дискретных квантовых событий [2, 6] и выявление эффекта высвобождения единично- го кванта. Учитывая то обстоятельство, что в на- ших экспериментах единичные квантовые события не реализовались (см. выше), амплитуды вТПСТ в пределах –50 ... –80 пА соответствовали одновре- менному выбросу двух квантов передатчика, ам- плитуды данных токов в пределах –80 ... –110 пА – высвобождению трех квантов и т. д. Вероятность наблюдения любого данного коли- чества квантовых единиц (x) в одной регистрации вТПСТ имеет вид: P(x) = e–mmx/x!, где m – среднее квантовое содержание, т. е. среднее количество квантов нейротрансмиттера, высвобождаемых в ответ на единичную стимуляцию. Эта величина мо- жет быть представлена как отношение общего ко- личества реализаций вызванных ответов к общему количеству регистраций (N) [2]. На рис. 4 сопостав- лены экспериментально определенные количества событий, отражающих реализацию соответствую- щего числа квантов, с аналогичными значениями, КВАНТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ НЕЙРОПЕРЕДАТЧИКА m 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Р и с. 5. График линейной регрессии (коэффициент корреляции 0.87), который отражает соответствие величин m и m' (n = 12), где m – среднее квантовое содержание, рассчитанное с применением метода подсчета пропусков (ось ординат), m' – среднее квантовое содержание, определяемое отношением средней амплитуды вызванных тормозящих постсинаптических токов к средней величине кванта (ось абсцисс). Р и с. 5. Графік лінійної реґресії (коефіцієнт кореляції 0.87), що відображує відповідність величин m і m' (n = 12), де m – середній квантовий вміст, розрахований із застосуванням методу підрахунку пропусків (вісь ординат), m' – середній квантовий вміст, визначений відношенням середньої амплітуди викликаних гальмуючих постсинаптичних струмів до середньої величини кванта (вісь абсцисс). m' НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3204 полученными при описании этих эксперименталь- ных данных статистическим законом Пуассона. Та- ким образом, дискретное распределение количе- ства квантов ГАМК, высвобождающихся в ответ на пресинаптическую стимуляцию, достаточно хоро- шо соответствует таковому, теоретически рассчи- танному в соответствии с законом Пуассона. Проверка применимости пуассоновской стати- стики. При соблюдении пуассоновских условий квантовое содержание m пропорционально лога- рифму относительного количества нулевых реали- заций (отсутствий ТПСТ после нанесения стимула) [7]: m = ln N/n0. Кроме того, m может быть рас- считано как отношение средней амплитуды вТПСТ (Iср) к средней величине постсинаптического от- вета, эквивалентного выбросу (высвобождению) единичного кванта (q) [2]. О применимости зако- на Пуассона для описания экспериментальных дан- ных будет свидетельствовать соответствие величин квантового содержания, рассчитанных с использо- ванием и первого, и второго подхода. Согласно ре- зультатам наших исследований, корреляция вели- чины m, рассчитанной с использованием метода подсчета пропусков, с таковой, определенной по отношению средней амплитуды ТПСТ к величине эффекта выброса единичного кванта, подтвержда- ет гипотезу применимости пуассоновской стати- стики для описания вероятности выброса ГАМК в синапсах культивируемых нейронов спинного моз- га крыс (рис. 5). ОБСУЖДЕНИЕ Результаты анализа особенностей квантового вы- броса ГАМК в тормозных синапсах культивируе- мых нейронов спинного мозга крыс подтвердили положение о том, что высвобождение нейропере- датчика из терминалей нейронов ЦНС в ряде слу- чаев является многоквантовым. Показана также применимость пуассоновской статистики для опи- сания вероятности этого процесса. Величина эф- фекта выделения одного кванта, полученная в ре- зультате анализа характеристик вызванных ответов, соответствует минимальной амплитуде сТПСТ, от- ражающих потенциалнезависимое случайное вы- свобождение содержимого одной или нескольких синаптических везикул. Кинетические характе- ристики вТПСТ соответствовали таковым сТПСТ. Таким образом, амплитуда вТПСТ определяется количеством одновременно высвобождаемых кван- тов ГАМК во всех активных зонах терминали ак- сона нейрона спинного мозга, вовлеченных в воз- буждение. Основоположники базисной теории квантово- го выброса постулировали, что одна пресинапти- ческая терминаль обладает, как правило, одной ак- тивной зоной (АЗ) – участком пресинаптической мембраны, вблизи которого сосредоточены синап- тические везикулы, готовые к выбросу находяще- гося в них нейропередатчика [4]. Результаты не- которых исследований, однако, показали, что в отдельном центральном синапсе при существова- нии только одной АЗ на мембране пресинаптиче- ской терминали выброс нейротрансмиттера может носить мультивезикулярный характер [8]. Однако в соответствии с такими представлениями следу- ет ожидать, что наряду с многоквантовым выбро- сом при минимальной амплитуде стимуляции пре- синаптической зоны все же может происходить и выброс единичного кванта. В наших же экспери- ментах высвобождения единичного кванта ГАМК в условиях стимуляции пресинаптической термина- ли вообще не наблюдалось (рис. 3, А, Б). Это позво- ляет поставить под серьезное сомнение гипотезу о наличии единичной АЗ на отдельной терминали в группе синаптических контактов, исследованной в описанных выше экспериментальных условиях. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что одиночная синаптическая терминаль не всегда обладает только одной АЗ с одним местом выброса, позволяющим реализовывать высвобож- дение только одной везикулы в данный момент вре- мени [2]. Так, статистическая оценка количества АЗ на пресинаптических окончаниях интернейро- нов дорсальных рогов спинного мозга (по данным электронной микроскопии) показала наличие не- скольких сайтов выброса нейротрансмиттера в си- напсах, образуемых аксонами этих нейронов [9]. Не исключено, что в нашем случае в процесс возбуж- дения одновременно могли вовлекаться две близ- ко расположенные терминали, на каждой из кото- рых имеется по одной АЗ, или же одна терминаль с двумя АЗ. В данном случае каждая АЗ обладает несколькими местами выброса везикул, что и обес- печивает мультивезикулярный минимальный вы- брос. В таких условиях при наличии двух АЗ (при- чем часть из них может иметь более одного сайта) возможным становится выброс как минимум двух квантов ГАМК, по одному из каждой зоны. Оче- видно, что в данном случае также возможно одно- временное высвобождение трех и более квантов. М. С. ШИПШИНА, Н. С. ВЕСЕЛОВСКИЙ, С. А. ФЕДУЛОВА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 3 205 Это заключение согласуется с современными уль- траструктурными данными о наличии более одной АЗ на пресинаптических окончаниях ГАМК-эрги- ческих синапсов между нейронами ядра диафраг- мального нерва в спинном мозгу крыс [10]. Как видно из рис. 3 и 4, в условиях нашего пре- парата, исследуемого с применением внеклеточной стимуляции единичного аксона в непосредствен- ной близости от синаптической терминали, наибо- лее вероятными являются одновременные выбросы нескольких квантов передатчика, причем мини- мально возможным представляется двухквантовое высвобождение. По-видимому, высокоамплитуд- ные ТПСТ, обусловленные выбросом нескольких квантов медиатора, даже при минимальной интен- сивности пресинаптической активации обеспечи- вают достаточно высокий уровень гиперполяри- зации/шунтирования мембран постсинаптических нейронов спинного мозга, тем самым гарантируя высокую надежность передачи тормозных сигна- лов и безотказность системы модуляции и преоб- разования афферентной импульсации. М. С. Шипшина1, М. С. Веселовський1, С. А. Федулова1 КВАНТОВІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИВІЛЬНЕННЯ НЕЙРОПЕРЕДАВАЧА В ГАМК-ЕРГІЧНИХ СИНАПСАХ КУЛЬТИВОВАНИХ НЕЙРОНІВ СПИННОГО МОЗКУ ЩУ- РІВ 1 Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ (Україна). Р е з ю м е З використанням методів фіксації потенціалу в конфігурації «ціла клітина» та стимуляції окремої пресинаптичної термі- налі були досліджені деякі особливості вивільнення ГАМК у гальмівних синапсах культивованих нейронів спинного мозку щурів. У перебігу аналізу розподілів амплітуд викли- каних гальмівних постсинаптичних струмів були визначе- ні основні квантові параметри викиду медіатора. Показано, що в ГАМК-ергічних синапсах спінальних нейронів, куль- тивованих протягом дев’яти–11 діб, мінімальне вивільнен- ня передавача здійснюється пакетами квантів (не менш за два-три). При цьому розподіл кількості вивільнених квантів достатньо добре відповідав такому, що теоретично розрахо- ваний відповідно до закону Пуасона. Передбачається, що одночасний мінімально двоквантовий викид ГАМК у синап- сах нейронів спинного мозку може бути пов’язаний з одно- часним залученням у процес збудження двох близько розта- шованих терміналей, кожна з яких має одну активну зону, або однієї терміналі з двома активними зонами. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. S. A. Fedulova and N. S. Veselovsky, “Quantal GABA release in hippocampal synapses: role of local Ca2+ dynamics within the single terminals,” Eur. J. Pharmacol., 447, Nos. 2/3, 163- 171 (2002). 2. Н. С. Веселовский, С. А. Федулова, П. Г. Костюк, Биофизика одиночного синапса, Наук. думка, Киев (2004). 3. N. S. Veselovsky, F. Engert, and H. D. Lux, “Fast local superfusion technique,” Pflügers Arch., 432, No. 2, 351-354 (1996). 4. B. Katz, The Release of Neural Transmitter Substances, Liverpool Univ. Press, Liverpool (1969). 5. Yu. O. Kolodin, A. O. Moskalyuk, N. S. Veselovsky, et al., “Synaptic connections in a dissociated mixed culture of rat dorsal root ganglion and spinal cord neurons,” Нейрофизиология/ Neurophysiology, 38, № 4, 358-360 (2006). 6. S. A. Fedulova and N. S. Veselovsky, “Multiquantal transmission at single inhibitory synapse in cultured rat hippocampal neurons,” in: Calcium Signaling, M. Morad, P. G. Kostyuk (еds.), IOS Press, Amsterdam (2001), pp. 190- 195. 7. J. S. Isaacson and B. Walmsley, “Counting quanta: direct measurements of transmitter release at a central synapse,” Neuron, 15, 875-884 (1995). 8. C. Auger and A. Marty, “Quantal currents at singlesite central synapses,” J. Physiol., 526, No. 1, 3-11 (2000). 9. Д. А. Русаков, “Статистическая оценка площади мембраны и количества активных зон в пресинаптических окончаниях”, Нейрофизиология, 22, № 1, 29-36 (1990). 10. Q. Tai and H. G. Goshgarian, “Ultrastructural quantitative analysis of glutamatergic and GABAergic synaptic terminals in the phrenic nucleus after spinal cord injury,” J. Comp. Neurol., 372, No. 3, 343-355 (1996). 11. A. Takahashi, A. Tokunaga, H. Yamanaka, et al., “Two types of GABAergic miniature inhibitory postsynaptic currents in mouse substantia gelatinosa neurons,” Eur. J. Pharmacol., 553, 120-128 (2006). 12. A. Maximov, Z. P. Pang, D. Tervo, et al., “Monitoring synaptic transmission in primary neuronal cultures using local extracellular stimulation,” J. Neurosci. Meth., 161, 75-87 (2007). КВАНТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ НЕЙРОПЕРЕДАТЧИКА

Квантовые характеристики высвобождения нейропередатчика в ГАМК-эргических синапсах культивируемых нейронов спинного мозга крыс

Репозитарії

Схожі ресурси