Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні

За допомогою методів флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії та гістохімічного забарвлення вивчено суспензію клітин надниркових залоз дорослих щурів до та після кріоконсервування. Показано, що швидкості охолодження чинять селективну дію на життєздатність клітин наднирників. Низькі шви...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2012
Автори:	Дудецька, Г.В., Божок, Г.А., Зубов, П.М., Гуріна, Т.М., Бондаренко, Т.П.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2012
Назва видання:	Проблемы криобиологии
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68476
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні / Г.В. Дудецька, Г.А. Божок, П.М. Зубов, Т.М. Гуріна, Т.П. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 30-38. — Бібліогр.: 10 назв. — укр., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-68476
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-684762014-09-26T03:01:40Z Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні Дудецька, Г.В. Божок, Г.А. Зубов, П.М. Гуріна, Т.М. Бондаренко, Т.П. Теоретическая и экспериментальная криобиология За допомогою методів флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії та гістохімічного забарвлення вивчено суспензію клітин надниркових залоз дорослих щурів до та після кріоконсервування. Показано, що швидкості охолодження чинять селективну дію на життєздатність клітин наднирників. Низькі швидкості охолодження дозволяють зберегти найбільшу кількість ядровмісних клітин у суспензії після заморожування-відігріву. С помощью методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и гистохимического окрашивания была изучена суспензия клеток надпочечников взрослых крыс до и после криоконсервирования. Показано, что скорости охлаждения оказывают селективное действие на жизнеспособность клеток надпочечников. Низкие скорости охлаждения позволяют сохранить наибольшее количество ядросодержащих клеток в суспензии после замораживания-отогрева. Adrenal cell suspension of adult rats was assessed prior to and after cryopreservation using fluorescence microscopy, flow cytometry and histochemical staining. It was found that cooling rates render a selective effect on viability of the adrenal cells. The low cooling rates allow to preserve the highest number of nucleated cells in the post-thaw suspension. 2012 Article Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні / Г.В. Дудецька, Г.А. Божок, П.М. Зубов, Т.М. Гуріна, Т.П. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 30-38. — Бібліогр.: 10 назв. — укр., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68476 57.043:612.451.014.462.5 uk Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Дудецька, Г.В. Божок, Г.А. Зубов, П.М. Гуріна, Т.М. Бондаренко, Т.П. Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні Проблемы криобиологии
description	За допомогою методів флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії та гістохімічного забарвлення вивчено суспензію клітин надниркових залоз дорослих щурів до та після кріоконсервування. Показано, що швидкості охолодження чинять селективну дію на життєздатність клітин наднирників. Низькі швидкості охолодження дозволяють зберегти найбільшу кількість ядровмісних клітин у суспензії після заморожування-відігріву.
format	Article
author	Дудецька, Г.В. Божок, Г.А. Зубов, П.М. Гуріна, Т.М. Бондаренко, Т.П.
author_facet	Дудецька, Г.В. Божок, Г.А. Зубов, П.М. Гуріна, Т.М. Бондаренко, Т.П.
author_sort	Дудецька, Г.В.
title	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
title_short	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
title_full	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
title_fullStr	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
title_full_unstemmed	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
title_sort	вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2012
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68476
citation_txt	Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні / Г.В. Дудецька, Г.А. Божок, П.М. Зубов, Т.М. Гуріна, Т.П. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 30-38. — Бібліогр.: 10 назв. — укр., англ.
series	Проблемы криобиологии
work_keys_str_mv	AT dudecʹkagv vplivríznihšvidkostejoholodžennânažittêzdatnístʹtaklítinnijskladsuspenzííklítinnadnirkovihzalozprikríokonservuvanní AT božokga vplivríznihšvidkostejoholodžennânažittêzdatnístʹtaklítinnijskladsuspenzííklítinnadnirkovihzalozprikríokonservuvanní AT zubovpm vplivríznihšvidkostejoholodžennânažittêzdatnístʹtaklítinnijskladsuspenzííklítinnadnirkovihzalozprikríokonservuvanní AT gurínatm vplivríznihšvidkostejoholodžennânažittêzdatnístʹtaklítinnijskladsuspenzííklítinnadnirkovihzalozprikríokonservuvanní AT bondarenkotp vplivríznihšvidkostejoholodžennânažittêzdatnístʹtaklítinnijskladsuspenzííklítinnadnirkovihzalozprikríokonservuvanní
first_indexed	2025-07-05T18:18:43Z
last_indexed	2025-07-05T18:18:43Z
_version_	1836832022949003264
fulltext	30 Трансплантація кріоконсервованих тканин і клі- тин ендокринних залоз – це метод відновлення гормо- нального потенціалу, втраченого внаслідок хвороби [4–6]. Кріоконсервування дозволяє не тільки зберег- ти життєздатність та функціональну активність клітин надниркових залоз (КНЗ) [3], але й модифікує популяційний склад клітинної суспензії внаслідок неоднакової чутливості клітин до охолодження. Швидкості охолодження також проявляють селек- тивну дію на збереженість клітин кіркової і мозкової речовин наднирників [4]. Це дозволяє видалити не- бажані клітини або збагатити отриманий препарат потрібною популяцією клітин, однак може призвести й до втрати гормональної активності суспензії за рахунок вибіркового видалення з неї ендокриноцитів під час заморожування-відігрівання. У зв’язку з цим питання про вплив кріоконсервування на суб- популяційний склад суспензії клітин, отриманих з надниркових залоз, потребує вивчення. Transplantation of cryopreserved endocrine gland tissues and cells is the method for recovery of hormo- nal potential lost due to disease [4–6]. Cryopreservation enables to preserve viability and functional activity of adrenal gland cells (AGCs) [3] as well as to modify populational composition in cell suspension due to diffe- rent sensitivity of various cell types to cooling. Cooling rates also render a selective effect on survival of adre- nal cortex and medulla cells [4]. This allows to remove unwanted cells or to enrich the resulted preparation with needed cell population, however, it may result in the loss of suspension’s hormonal activity due to selec- tive removal of endocrinocytes during freeze-thawing. Herewith the issues of cryopreservation effect on sub- populational composition of cell suspensions obtained from adrenal glands requires the thorough investigation. The research aim was to study the effect of different cooling rates on viability and changes in cell populations in AGC suspension during cryopreservation. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 УДК 57.043:612.451.014.462.5 Г.В. ДУДЕЦЬКА, Г.А. БОЖОК, П.М. ЗУБОВ, Т.М. ГУРІНА, Т.П. БОНДАРЕНКО Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні UDC 57.043:612.451.014.462.5 G.V. DUDETSKA, G.A. BOZHOK, P.M. ZUBOV, T.M. GURINA, T.P. BONDARENKO Effect of Different Cooling Rates on Viability and Cell Populations in Adrenal Cell Suspensions During Cryopreservation За допомогою методів флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії і гістохімічного забарвлення була вивчена суспензія клітин надниркових залоз дорослих щурів до та після кріоконсервування. Показано, що швидкості охолодження чинять селективну дію на життєздатність клітин наднирників. Низькі швидкості охолодження дозволяють зберегти найбільшу кількість ядровмісних клітин в суспензії після заморожування-відігріву. Ключові слова: суспензія клітин надниркових залоз, ядровмісні клітини, кріоконсервування, швидкість охолодження, життєздатність. С помощью методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и гистохимического окрашивания была изучена суспензия клеток надпочечников взрослых крыс до и после криоконсервирования. Показано, что скорости охлаждения оказывают селективное действие на жизнеспособность клеток надпочечников. Низкие скорости охлаждения позволяют сохранить наибольшее количество ядросодержащих клеток в суспензии после замораживания-отогрева. Ключевые слова: суспензия клеток надпочечников, ядросодержащие клетки, криоконсервирование, скорость охлаждения, жизнеспособность. Adrenal cell suspension of adult rats was assessed prior to and after cryopreservation using fluorescence microscopy, flow cytometry and histochemical staining. It was found that cooling rates render a selective effect on viability of the adrenal cells. The low cooling rates allow to preserve the highest number of nucleated cells in the post-thaw suspension. Key words: adrenal cell suspension, nucleated cells, cryopreservation, cooling rate, viability. * Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію: вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015; тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, електронна пошта: dudetska@mail.ru * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 30 07, fax: +380 57 373 3084, e-mail: dudetska@mail.ru Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків 31 problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 Мета дослідження – вивчити вплив різних швид- костей охолодження на життєздатність і зміну клі- тинного складу суспензії КНЗ при кріоконсерву- ванні. Матеріали і методи Об’єктом дослідження була суспензія КНЗ до- рослих щурів. Подрібнені на фрагменти надниркові залози поміщали в середовище 199, яке містило колагеназу типу V 1 мг/мл («Sigma», США) і ДНКазу І 0,1 мг/мл («Sigma») та інкубували на водяній бані при температурі 37°С в 3 етапи: 30; 10 та 10 хв. Після кожного етапу інкубації супернатант збирали та додавали до нього 0,5 мл сироватки кро- ві великої рогатої худоби (ВРХ, «Біолот», Росія). Деструкцію тканини проводили шляхом піпетуван- ня, після чого об’єднували разом з супернатантом і відмивали середовищем 199, яке містило 0,2% би- чачого сироваткового альбуміну (БСА, «Sigma»). Суспензію клітин фільтрували крізь нейлоновий фільтр з діаметром пор 100 мкм і відмивали. В якості кріопротектора використовували диме- тилсульфоксид (ДМСО). Розчин кріопротектора готували на середовищі 199 у концентрації 10, 14 і 20% з вмістом 10% сироватки ВРХ. Для подаль- шого заморожування кріопротектор додавали по- етапно. До 500 мкл суспензії КНЗ з інтервалом 1 хв при температурі 4°С в 5 етапів додавали по 100 мкл розчину ДМСО. Кінцева концентрація ДМСО в зразках складала 5; 7; 10%. Зразки заморожували в кріоампулах об’ємом 1,8 мл («Nunc», США) в програмному заморожувачі («Cryoson», Німеч- чина). При заморожуванні зразки охолоджували з постійними швидкостями 1; 5; 10; 15; 20 град/хв до температури –40°С, а потім занурювали у рідкий азот (–196°С). Кріоконсервування зі швидкістю охолодження 40 град/хв здійснювали над дзер- калом рідкого азоту при постійній температурі дов- кілля –145...–150°С. Зразки заморожували також прямим зануренням у рідкий азот (↓LN2). Всі зраз- ки відігрівали на водяній бані (37°С) до зникнення твердої фази (візуальне оцінювання). Кріопротек- тор після заморожування-відігріву видаляли поетап- но. До суспензії КНЗ з інтервалом 1 хв при темпе- ратурі 4°С додавали 500; 500; 1000; 2000 мкл сере- довища 199, яке містило 10% сироватки ВРХ і 2,5% БСА. Суспензію центрифугували протягом 3 хв при 225g. Для контролю загальної кількості клітин в сус- пензії їх підраховували в гемоцитометрі [1]. Збере- женість клітин після кріоконсервування визначали як загальну їх кількість після відігріву по відношен- ню до загальної кількості клітин до заморожування, виражену у відсотках, життєздатність клітин – як Materials and methods The research object was AGC suspension of adult rats. Fragments of adrenal glands were placed into medium 199 containing V-type collagenase of 1mg/ml (Sigma, USA) and DNAase I of 1 mg/ml (Sigma) and incubated in water bath at 37°C by 3 steps: 30, 10 and 10 min. After each incubation step the supernatant was collected and supplemented with 0.5 ml bovine blood serum (Biolot, Russia). Tissue was destructed by pipetting and after that mixed with supernatant and washed with medium 199 containing 0.2% bovine serum albumin (BSA, Sigma). Cell suspension was sieved through nylon filter with 100 µm pore diameter and washed. Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as a cryopro- tectant. Cryoprotectant solution of 10, 14 or 20% concentration was prepared on the base of medium 199 supplemented with 10% bovine blood serum. For further freezing cryoprotectant was added stepwise. 500 µl of AGC suspension was supplemented with 100 µl of DMSO solution with 1 min interval at 4°C by 5 steps. Final DMSO concentration in the samples made 5; 7; 10%. The samples were frozen in 1.8 ml volume cryoampoules (Nunc, USA) in a programmable free- zer (Cryoson, Germany). Freezing of samples was per- formed with constant cooling rates 1; 5; 10; 15; 20 deg/min down to –40°C, and following plunging into liquid nitrogen (–196°C). Cryopreservation with cooling rate of 40 deg/min was performed above a mirror of liquid nitrogen at constant environmental temperature of –145...–150°C. The samples were also frozen by direct plunging into liquid nitrogen (↓LN2). All the samples were thawed in water bath (37°C) until solid phase disappeared (visual assessment). After freeze- thawing the cryoprotectant was removed stepwise. Every minute AGC suspension was supplemented with 500; 500; 1000; and 2000 µl of medium 199 containing 10% bovine blood serum and 2.5% BSA. Procedure was performed at 4°C. Suspension was centrifuged during 3 min at 225g. To control the total number of cells in suspension they were calculated in hemocytometer [1]. Cell sur- vival after cryopreservation was determined as their total number after thawing in relation to the total number of cells prior to freezing and expressed in percents, viability of cells was expressed as the number of viable cells in relation to total cell number and expressed in percents. Percent of viable cells was determined by supravital staining with 0.2% aqueous solution of trypan blue and fluorescent dyes, fluorescent diacetate (FDA, Sigma) and propidium iodide (PI, Sigma) [7]. Fluores- cence was recorded with luminescent microscope Olympus IX-71 with excitation at 488 nm. If the cell was stained with FDA and a green fluorescence was 32 problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 кількість життєздатних клітин по відношенню до загальної їх кількості, виражену у відсотках. Відсо- ток життєздатних клітин визначали за допомогою суправітального забарвлення з використанням 0,2%-го водного розчину трипанового синього, а також флуоресцентних барвників – флуоресцеїну діацетату (ФДА, «Sigma») і пропідіум йодиду (ПІ, «Sigma») [7]. Реєстрацію флуоресценції проводили на люмінесцентному мікроскопі «Olympus IX-71» при збудженні світловим пучком з довжиною хвилі 488 нм. При забарвленні клітин ФДА спостерігалась зелена флуоресценція, яка свідчила про їх життє- здатність, а при забарвленні клітин ПІ – червона флуоресценція, що було ознакою їх нежиттєздатнос- ті. Підрахунок флуоресціюючих об’єктів при збу- дженні з довжиною хвилі 488 нм, а також одночасно загальної кількості клітин в прохідному світлі дозво- ляв виявити наявність без’ядерних клітин. Для візуалізації в клітинах ліпідних включень проводили забарвлення нільським червоним (НЧ, «Acros Organics»). В 1 мл ДМСО розчиняли 1 мг барвника. Перед забарвленням розчин барвника розводили 1:100 фізіологічним розчином на фосфат- ному буфері (рН 7,4) і додавали 15 мкл цього роз- чину до 1 мл клітинної суспензії (106 кл/мл). Забар- влювали 10 хв при 37°C, після чого одноразово відмивали від надлишку барвника фізіологічним розчином на фосфатному буфері. Реєстрацію флуо- ресценції проводили при збудженні світловим пуч- ком з довжиною хвилі 455–500 нм. Збереження НЧ+-клітин до та після кріоконсервування визнача- ли за вмістом у цитоплазмі клітин забарвлених включень і виражали у відсотках по відношенню до загальної кількості клітин у зразку після відігріву. Для виявлення в клітинах активності 3β-гідрок- систероїддегідрогенази (3βГСД) суспензію клітин (106 кл/мл) інкубували в 2,5 мл фізіологічного розчину на фосфатному буфері (рН 7,4), що містив 0,2 мг/мл нітросинього тетразолію («Chemapol», Чехія), 1 мг/мл НАД («Fluka», Німеччина) і 0,12 мг/мл дегідроепіандростерону («Sigma») про- тягом 90 хв при 37°C. Позитивно забарвлені клітини (3βГСД+-клітини) мали фіолетове забарвлення відновленого тетразолію, їх підрахунок здійснювали в полі зору мікроскопа і виражали у відсотковому співвідношенні до загальної кількості клітин у зраз- ку після відігріву. Для виявлення кількості еритроцитів у суспензії КНЗ було проведено мічення моноклональними антитілами, а саме фенотиповим маркером еритро- цитів «TER119 PE-conjugated» («BD Biosciences», США). Клітини відмивали фізіологічним розчином на фосфатному буфері та інкубували з антитілами 20 хв при 4°С. Зразки повторно відмивали і аналі- observed, the cell was considered as viable, and stained with PI and fluoresced red was non-viable. Calculation of fluorescing objects at 488 nm exitation and simulta- neously the total cell number in transmitted light allo- wed to reveal the presence of non-nucleated cells. To reveal lipid inclusions in cells we performed stai- ning with Nile Red (NR, Acros Organics). Dye of 1 mg was dissolved in 1 ml of DMSO. Prior to staining a dye solution was diluted in 1:100 ratio with physiological saline on phosphate buffer (pH 7.4) and 1 ml of cell suspension (106 cells/ml) was supplemented with 15 µl of this solution. The specimen was stained for 10 min at 37°C, then once washed free of excessive dye with phosphate based saline (PBS). Fluorescence was re- corded at excitation of 455–500 nm. Survival of NR+ cells prior to and after cryopreservation was evaluated by the content of stained inclusions in cell cytoplasm and expressed in percents in relation to the total number of cells in the sample after thawing. To reveal the activity of 3β-hydroxysteroid dehyd- rogenase (3βHSD) in cells the cell suspension (106 cells/ml) was incubated in 2.5 ml of PBS (pH 7.4) with 0.2 mg/ml of nitroblue tetrazolium (Chemapol, Po- land), 1 mg/ml of NAD (Fluka, Germany) and 0.12 mg/ml of dehydroepiandrosterone (Sigma) for 90 min at 37°C. Positively stained cells (3βHSD+ cells) had a purple color of recovered tetrazolium, they were calculated in the vision field of microscope and expres- sed in percent ratio to the total amount of cells in the sample after thawing. To reveal the erythrocyte number in AGC suspen- sion we used labeling with monoclonal antibodies, i. e. phenotype label of erythrocytes TER119 PE-conjugated (BD Biosciences, USA). The cells were washed with PBS and incubated with antibodies for 20 min at 4°C. The samples were repeatedly washed and analyzed with flow cytofluorimeter BD FACSCalibur (BD Bio- sciences) and WinMDI Version 2.8 software. The data were statistically processed using single- factor disperse analysis and Student’s t-criterion. The differences were considered significant at p < 0.05. Results and discussion At the first stage to evaluate the cryopreservation efficiency we had to determine the AGC survival and viability after the use of different DMSO concentrations and cooling rates. The cells exposed to all the stages of processing except supplementation with DMSO and freeze-thawing served as the control. The highest cell survival was observed after using cooling rates of 1; 5; 10 deg/min and 5 and 7% DMSO; 10 deg/min with 10% DMSO; 15 deg/min with 7% DMSO and 40 deg/min and ↓LN2 with 10%DMSO (Fig. 1). 33 зували на проточному цитофлуориметрі BD FACS Calibur («BD Biosciences») з використанням про- грамного забезпечення WinMDI Version 2.8. Статистичну обробку даних проводили за допо- могою однофакторного дисперсійного аналізу і t-критерію Стьюдента. Вірогідними вважали від- мінності при р<0,05. Результати та їх обговорення На першому етапі роботи для оцінки ефектив- ності кріоконсервування необхідно було визначити збереженість та життєздатність КНЗ після вико- ристання різних концентрацій ДМСО і швидкостей охолодження. Контролем були клітини, які прохо- дили всі етапи обробки, крім додавання ДМСО і процесів заморожування-відігріву. Найбільшу збереженість клітин виявлено при швидкостях охолодження 1; 5; 10 град/хв з 5 і 7% ДМСО; 10 град/хв з 10 % ДМСО; 15 град/хв з 7% ДМСО та 40 град/хв і ↓LN2 з 10% ДМСО (рис. 1). Найбільше зменшення життєздатності відносно незаморожених клітин було виявлено при швидкості охолодження 40 град/хв і охолодженні зануренням у рідкий азот при всіх використаних концентраціях ДМСО, найбільшу життєздатність клітин виявлено при швидкостях охолодження 1; 5; 10; 20 град/хв з 7% ДМСО і 10 град/хв з 10% ДМСО (рис. 2). The maximum viability decrease if compared to the non-frozen cells was observed after using cooling rate of 40 deg/min and cooling by plunging into liquid nitro- gen with all the used DMSO concentrations, the highest cell viability was at cooling rates of 1; 5; 10; 20 deg/min with 7% DMSO and 10 deg/min with 10% DMSO (Fig. 2). Assessment with fluorescent dyes revealed that the cell viability decreased after cryopreservation by all the programs. But the maximum decrease of cell via- bility was found after using cooling rates higher than 10 deg/min. The highest number of viable cells was preserved after using cooling rates of 1; 5; 10 deg/min and 7% DMSO concentration (Fig. 3). Generally the dynamics of viability change assessed by two methods coincided, i. e. the decrease of cell viability was observed along with increase of cooling rate. However, absolute values of viability were higher in the case of trypan blue staining (40.11 ± 6.37 to 77.74 ± 3.88% in trypan blue test vs. 9.85 ± 0.91 to 56.45 ± 5.65% in fluorescent dye test). Higher cell viability index observed in trypan blue test was likely due to restrictions of the method, reflecting only the membrane integrity of both nucleated and non-nuc- leated cells [9]. The suspension obtained from adrenal glands con- tained several types of cells differing by their sensitivity �� * ** * * * * 0 20 40 60 80 100 120 Швидкості охолодження, град/хв Cooling rates, deg/min Зб ер еж ен іс ть к лі ти н, % C el l s ur vi va l, % Рис. 1. Збереженість КНЗ після кріоконсервування з різ- ними швидкостями охолодження і концентраціями ДМСО: – 5%; – 7%; – 10%; K – контроль; * – відмінності вірогідні по відношенню до контролю, р < 0,05. Fig. 1. AGC survival after freeze-thawing with different cooling rates and DMSO concentrations: – 5%; – 7%; – 10%; K – control; * – the differences are significant if compared with the control, p < 0.05. �� * * * * * * * * * * * * * * * * 0 20 40 60 80 100 Рис. 2. Життєздатність КНЗ (за трипановим синім) після кріоконсервування з різними швидкостями охолодження і концентраціями ДМСО: – 5%; – 7%; – 10%; K – контроль; * – відмінності вірогідні по відношенню до контролю, р < 0,05. Fig. 2. AGC viability (trypan blue test) after freeze-thawing with different cooling rates and DMSO concentrations: – 5%; – 7%; – 10%; K – control; * – the differences are significant if compared with the control, p < 0.05. K 1 5 10 15 20 40 ↓LN2 Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % C el l v ia bi lit y, % problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 K 1 5 10 15 20 40 ↓LN2 Швидкості охолодження, град/хв Cooling rates, deg/min 34 Аналіз з використанням флуоресцентних барв- ників виявив зниження життєздатності клітин після кріоконсервування за всіма програмами. Однак найбільше падіння життєздатності суспензії клітин було виявлено після використання швидкостей охолодження вище 10 град/хв. Найбільша кількість життєздатних клітин зберігалась при використанні швидкостей 1; 5; 10 град/хв і концентрації ДМСО 7% (рис. 3). У цілому динаміка зміни життєздатності, яка була оцінена двома методами, співпадала, тобто спостерігалося зменшення життєздатних клітин з ростом швидкості охолодження. Однак абсолютні значення життєздатності були вищими у випадку, коли цей показник вимірювали за допомогою три- панового синього (від 40,11 ± 6,37 до 77,74 ± 3,88% за забарвленням трипановим синім та від 9,85 ± 0,91 до 56,45 ± 5,65% – флуоресцентними барвни- ками). Це може бути пов’язано з тим, що при забар- вленні трипановим синім спостерігається підви- щення показника життєздатності клітин, оскільки цей метод відображає цілісність клітинної мембра- ни як ядровмісних, так і без’ядерних клітин [9]. Суспензія, яка отримана з надниркових залоз, містить декілька типів клітин, які можуть відрізня- тися за своєю чутливістю до факторів кріоконсер- вування. Це, в свою чергу, може підвищувати або знижувати результат кріоконсервування щодо «субпопуляції інтересу», наприклад гормонопроду- куючих клітин. Відомо, що надниркові залози мають високий рівень кровопостачання. Тому еритроцити скла- дають значну кількість у суспензії, отриманої з за- лоз. Для оцінки вмісту без’ядерних клітин в суспен- зії ми застосували метод проточної цитофлуори- метрії. Суспензію КНЗ було помічено антитілами TER119, який експресується на клітинах еритроїд- ного ряду [8]. За допомогою метода проточної цитофлуори- метрії було встановлено, що клітини надниркових залоз розподілені на 2 клітинні популяції з різним розміром клітин (рис. 4, A, B): R1 (85–94%) та R2 (6–15%). Популяція клітин середнього розміру має значну кількість TER119+-клітин, що ідентифікує ці клітини як еритроцити. Встановлено, що початкова контрольна суспензія КНЗ містить біля 77% TER119+-клітин з популяції середнього розміру (рис. 4, C). Аналіз клітинної суспензії методом проточної цитофлуориметрії показав, що субпопуляції без’ядер- них та ядровмісних клітин у суспензії мають неод- накову чутливість до режимів кріоконсервування. Встановлено, що зі збільшенням швидкості охо- лодження зменшується кількість ядровмісних і зростає кількість без’ядерних клітин (таблиця). to the cryopreservation factors. In its turn this may in- crease or decrease the post-thaw yield after cryopre- servation as for target subpopulations, for example of hormone-producing cells. Adrenal glands are known to have a high level of blood supply. So erythrocytes are the significant popu- lation among the suspension obtained from the glands. To estimate the content of non-nucleated cells in sus- pension we applied the method of flow cytofluorimetry. AGC suspension was labeled with antibodies to TER119, expressed on the erythroid cell membranes [8]. Flow cytofluorimetry analysis revealed within ad- renal cell suspension two cell populations with different cell size: R1 (85–94%) and R2 (6–15%) (Fig. 4A, B). Cell population of middle size had a significant amount of TER119+ cells, i. e. erythrocytes. It has been estab- lished that initial control AGC suspension contained about 77% of TER119+ cells within the population of middle sized cells (Fig. 4C). Flow cytofluorimetry analysis of cell suspension showed that subpopulations of nucleated and non- Рис. 3. Життєздатність КНЗ (за включенням ФДА і ПІ) після кріоконсервування з різними швидкостями охо- лодження і концентраціями ДМСО: – 5%; – 7%; – 10%; K – контроль; відмінності вірогідні (р < 0,05) по відношенню до: * – контролю; + – зразків, кріоконсерво- ваних з 5% ДМСО зі швидкістю охолодження 10 град/хв; # – 7% ДМСО та 1; 10 град/хв; ̂ – 10% ДМСО та 1; 5; 10 град/хв.; @ – 5% ДМСО та 5; 20; 40 град/хв. Fig. 3. AGC viability (FDA/PI test) after freeze-thawing with different cooling rates and DMSO concentrations: – 5%; – 7%; – 10%; K – control; the differences are significant (p < 0.05) if compared with: * – the control ; + – 5% DMSO with 10 deg/min cooling rate; # – 7% DMSO with 1; 10 deg/min cooling rates; ^ – 10% DMSO with 1; 5; 10 deg/min cooling rates; @ – 5% DMSO with 5; 20; 40 deg/min cooling rate. �� * * * * * + * + * + @ * * * # * # * # 0 20 40 60 80 100 K 1 5 10 15 20 40 ↓LN2 Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % C el l v ia bi lit y, % problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 Швидкості охолодження, град/хв Cooling rates, deg/min 35 Формування цитоплазматичних ліпідних кра- пель у стероїдпродукуючих клітинах надниркових залоз є обов’язковим процесом. Це скупчення нейт- ральних ліпідів, в основному тригліцеридів або холе- стеринових ефірів, які застосовують як засоби запа- сання енергії в організмі або як депо холестерину nucleated cells in suspension had different sensitivity to cryopreservation regimens. We have established that along with the increasing of the cooling rate the number of nucleated cells decreased and number of non-nucleated ones increa- sed (Table). Quad Stats X Parameter: FSC (Log) Y Parameter: SSC (Log) Quad % Gated 1 UL 0.00 2 UR 0.00 3 LL 85.39 4 LR 14.61 Quad Stats X Parameter: FSC (Log) Y Parameter: SSC (Log) Quad % Gated 1 UL 76.93 2 UR 7.90 3 LL 7.49 4 LR 7.68 Рис. 4. Цитофлуориметричний аналіз суспензії КНЗ: A, B – пряме та бокове світлорозсіювання клітин; C – TER119+- клітини у суспензії КНЗ. Fig. 4. Cytofluorimetric analysis of AGC suspension: A, B – forward and side light scattering of cells; C – TER119+-cells in AGC suspension. Вміст ядровмісних і без’ядерних клітин (%) в суспензії КНЗ до (контроль) і після кріоконсервування Amount of nucleated and non-nucleated cells (%) in AGC suspension prior to (control) and after cryopreservation яiцартнецноK %,ОСМД OSMD %,noitartnecnoc вх/дарг,яннеждолохоьтсiкдивШ nim/ged,etargnilooC NL 2 ьлортноK lortnoC 1 5 01 51 02 04 %,sllecdetaelcuN%,инитiлкiнсiмвордЯ 5 29,1±3,78 12,3±72,28 89,2±52,84 01,4±67,53 11,3±34,13 58,0±98,42 24,1±16,3 12,1±46,967 01,0±69,88 60,1±5,48 3,4±45,65 11,0±80,22 62,2±4,71 13,4±58,52 74,0±19,4 01 55,8±56,08 49,1±44,05 67,2±45,14 99,6±6,51 38,2±14,82 71,4±3,52 60,1±52,8 noN%,инитiлкiнредя'зеБ - %,sllecdetaelcun 5 29,1±3,7 20,1±72,9 55,0±57,53 04,3±62,54 59,3±34,65 83,3±98,26 24,1±16,36 81,1±44,127 27,0±99,4 60,1±5,41 66,1±14,14 24,8±95,66 01,4±9,27 11,3±4,97 23,3±58,68 01 92,1±42,11 49,1±44,03 11,3±97,25 37,5±2,96 96,0±19,57 96,1±8,17 06,3±55,47 Примітка: * – відмінності вірогідні по відношенню до контролю, р < 0,05. Note: * – the differences are significant if compared to the control, p < 0.05. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 A B C �� * # * # * # # * # * # # * # * # * # # * # # # 0 20 40 60 80 100 36 для синтезу стероїдних гормонів у стероїдогенних тканинах [10]. Для візуалізації клітин, які мають ліпідні включення, використовували флуоресцент- ний барвник нільський червоний. Отримані дані (рис. 5) свідчать про значне зни- ження кількості клітин, що містять ліпідні краплі, після заморожування зі швидкостями 15; 20; 40 град/хв і неконтрольованою швидкістю охоло- дження (↓LN2). Зразки, кріоконсервовані зі швид- кістю охолодження нижче 10 град/хв і концентра- цією ДМСО 5; 7 і 10%, в цілому зберігають кіль- кість клітин, забарвлених нільським червоним, на рівні контрольних значень (63,98 ± 9,52%). Одним з методів оцінки гормональної функції стероїдпродукуючих клітин в суспензії є визначення активності ферменту 3βГСД, який забезпечує один з ключових етапів синтезу стероїдних гормонів – конверсію прегненолону в прогестерон. Як видно з рис. 6, вміст 3βГСД+-клітин після кріоконсервування залишалася на рівні контрольних значень (42,05 ± 2,40%) у разі охолодження зі швидкостями до 15 град/хв в присутності 5 та 7% ДМСО. При вико- ристанні 10% ДМСО цей показник був дещо нижче. Охолодження суспензії зі швидкостями 20; 40 град/хв і занурення в рідкий азот призвело до зниження Formation of cytoplasmic lipid drops in steroid- producing cells of adrenal glands is a mandatory pro- cess. This is the accumulation of neutral lipids, usually triglycerides and cholesterol esters which are used as the energy accumulation means of an organism or depot of cholesterol for synthesis of steroid hormones in ste- roidogenic tissues [10]. To visualize the cells with lipid inclusions we used a fluorescent dye Nile Red. The obtained data (Fig. 5) testified to a significant decrease of cell number having lipid drops after freezing with cooling rates of 15; 20; 40 deg/min and non-cont- rolled cooling rate (↓LN2). Generally the samples cryo- preserved with cooling rate below 10 deg/min and DMSO concentration of 5; 7; 10% preserved the number of cells stained with Nile Red at the level of control indices (63.98 ± 9.52%). One of the methods for evaluation of steroid-pro- ducing cells’ hormonal function in suspension is reveal- ing the activity of enzyme 3βHSD providing one of the key stages of steroid hormones synthesis, transfor- mation of pregnenolone into progesterone. Fig. 6 shows that the content of 3βHSD+ cells after cryopreservation remained at the level of control indices (42.05 ± 2.40%) in the case of cooling rate up to 15 deg/min and 5 and 7% DMSO. In the case of using 10% DMSO this in- �� * # * # * # * # * # * # * # * # * * # * * # * # 0 20 40 60 80 100 Рис. 5. Кількість НЧ+-клітин до (контроль) і після кріокон- сервування з різними швидкостями охолодження і концентраціями ДМСО: – 5%; – 7%; – 10%; K – контроль; відмінності вірогідні (р < 0,05) по відношенню до: * – контролю; # – до зразків, кріоконсервованих з 5; 7; 10% ДМСО зі швидкостями охолодження 1; 5; 10 град/хв відповідно. Fig. 5. Number of NR+-cells prior to (control) and after freeze- thawing with different cooling rates and DMSO concen- trations: – 5%; – 7%; – 10%; K – control; the differences are significant (p < 0.05) if compared with: * – the control ; # – data of freeze-thawing with 5; 7; 10% DMSO and with 1; 5; 10 deg/min cooling rates, correspondingly. Вм іс т Н Ч+ -к лі ти н, % N R + c el l c on te nt , % Рис. 6. Кількість 3β-ГСД+-клітин до (контроль) і після кріоконсервування з різними швидкостями охолодження і концентраціями ДМСО: – 5%; – 7%; – 10%; K – контроль; відмінності вірогідні (р < 0,05) по відношенню до: * – контролю; # – до зразків, кріоконсервованих з 7% ДМСО зі швидкістю охолодження 10 град/хв. Fig. 6. Number of 3β-HSD+-cells prior to (control) and after freeze-thawing with different cooling rates and DMSO concentrations: – 5%; – 7%; – 10%; K – control; the differences are significant (p < 0.05) if compared with: * – the control ; # – data of freeze-thawing with 7% DMSO and with 10 deg/min cooling rate. K 1 5 10 15 20 40 ↓LN2 Швидкості охолодження, град/хв Cooling rates, deg/min Вм іс т 3β ГС Д+ -к лі ти н, % 3β H SD + c el l c on te nt , % problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 K 1 5 10 15 20 40 ↓LN2 Швидкості охолодження, град/хв Cooling rates, deg/min 37 кількості 3βГСД+-клітин. Слід підкреслити, що після заморожування-відігріву суспензії зі швидкістю охо- лодження 10 град/хв та в присутності 7% ДМСО збереженість 3βГСД+-клітин в порівнянні з конт- ролем була достовірно вищою. Таким чином, вико- ристання швидкості охолодження 10 град/хв і 7% ДМСО для заморожування надниркових залоз щу- рів сприяє збереженню найбільшої кількості клітин, які мають активність 3βГСД. Враховуючи дані про вплив швидкості охоло- дження на життєздатність та клітинний склад сус- пензії КНЗ щурів, можна зробити висновок, що за- морожування зі швидкістю охолодження більше за 10 град/хв і використання прямого занурення у рід- кий азот значно знижують показники життєздатнос- ті КНЗ щурів. Швидкості охолодження до 10 град/хв знижують показник життєздатних клітин після від- тавання, однак дозволяють зберегти їх найбільшу кількість в суспензії. Цитофлуориметричний аналіз показав, що суспензія КНЗ, отримана з надниркових залоз щурів, містить значну частину еритроїдних клітин. Вміст цієї популяції змінюється залежно від використаної швидкості охолодження. Висновки 1. Кріоконсервування суспензії клітин наднирко- вих залоз щурів має проводитися з використанням низьких (до 10 град/хв) швидкостей охолодження, які дозволяють отримати після відігріву найбільшу кількість життєздатних і функціонально активних клітин. 2. Встановлено, що зі збільшенням швидкості охолодження зменшується вміст ядровмісних і зростає – без’ядерних клітин. 3. Для отримання суспензії клітин надниркових залоз щурів, збагаченої стероїдпродукуючими клі- тинами, потрібно використовувати режим заморо- жування зі швидкістю охолодження 10 град/хв і концентрацією ДМСО 7%. dex was slightly lower. The cooling of suspension with the cooling rates of 20; 40 deg/min and plunging into liquid nitrogen resulted in the decrease of 3βHSD+ cells number. It should be emphasized that after freezing of suspension with 10 deg/min cooling rate and presence of 7% DMSO the 3βHSD+ cells content was signifi- cantly higher if compared to the control. So, using 10 deg/min cooling rate and 7% DMSO for freezing of rat adrenal glands contributed to the survival of highest number of cells with 3βHSD activity. Considering the data about effect of cooling rate on viability and cell population distribution in rat AGC suspension we may conclude that the freezing with cooling rates higher than 10 deg/min and the use of di- rect plunging into liquid nitrogen significantly decrea- ses the indices of rat AGC viability. Cooling rates lower than 10 deg/min decrease the cell viability but enable to preserve the higher cell quantity in suspension. Cyto- fluorimetric analysis showed that AGC suspension ob- tained from rat adrenal glands contain a significant erythroid cell population. The post-thaw content of this population changes depending on the cooling rates used. Conclusions 1. Cryopreservation of rat adrenal cell suspension should be performed with low cooling rates (not higher than 10 deg/min) allowing obtaining the highest post thaw quantity of viable and functionally active cells. 2. We have established that increasing of cooling rate led to decrease in content of nucleated cells and to increased non-nucleated cell content. 3. Obtaining of rat adrenal cell suspension enriched with steroid-producing cells was provided by applica- tion of freezing regimen with 10 deg/min cooling rate and 7% DMSO concentration. Литература 1.Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков – М.: Мир, 1983. – 263 с. 2.Дудецкая Г.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние ско- рости охлаждения на сохранность зонально-дифференци- рованных популяций клеток надпочечников крыс // Проблемы криобиологии. – 2010. – Т. 20, №4. – С. 379–387. 3.Дудецкая Г.В., Гурина Т.М., Бондаренко Т.П. Изучение воз- можности криоконсервирования клеток надпочечников взрослых крыс // Вестник ХНУ им. В.Н. Каразина. – 2010. – Вып. 12, №920. – С. 111–117. 4.Dunn J.C., Chu Y., Lam M.M. et al. Adrenal cortical cell trans- plantation // J. Pediatr. Surg. – 2004. – Vol. 39, №12. – P. 1856– 1858. 5.Dunn J.C., Chu Y., Qin H.H., Zupekan T. Transplantation of adrenal cortical progenitor cells enriched by Nile red // J. Surg Res. – 2009. – Vol. 156, №2. – Р. 317–324. References 1.Adams R. Methods of cell cultures for biochemists. – Moscow: Mir, 1983. – 263 p. 2.Dudetskaya G.V., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Effect of cooling rate on integrity of zone-differentiated adrenal cell populations of rats // Problems of Cryobiology. – 2010. – Vol. 20, N4. – P. 379-387. 3.Dudetskaya G.V., Gurina T.M., Bondarenko T.P. The study of the possibility of rat adrenal gland cells cryopreservation // Visnyk KhNU im. V.N. Karazina. Series: Biology. – 2010. – Issue 12, N920. – P. 111–117. 4.Dunn J.C., Chu Y., Lam M.M. et al. Adrenal cortical cell transplan- tation // J. Pediatr. Surg. – 2004. – Vol. 39, N12. – P. 1856–1858. 5.Dunn J.C., Chu Y., Qin H.H., Zupekan T. Transplantation of adrenal cortical progenitor cells enriched by Nile red // J. Surg Res. – 2009. – Vol. 156, N2. – Р. 317–324. 6.Hornsby P.J. Transplantation of adrenocortical cells // Rev. En- docr. Metab. Disord. – 2001. – Vol. 2, N3. – P. 313–321. 7.Jones K.H., Senft J.A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate- propidium iodide // J. Histochem. Cytochem. – 1985. – Vol. 33, N1. – Р. 77–79. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1 38 6.Hornsby P.J. Transplantation of adrenocortical cells // Rev. En- docr. Metab. Disord. – 2001. – Vol. 2, №3. – P. 313–321. 7.Jones K.H., Senft J.A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate- propidium iodide // J. Histochem. Cytochem. – 1985. – Vol. 33, №1. – Р. 77–79. 8.Kina T., Ikuta K., Takayama E. et al. The monoclonal antibody TER119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erytroid linea- ge // Br. J. Hematol. – 2000. – Vol. 109, №2. – Р. 280–287. 9.Sharpe R.L., Milligan C.L. Lactate efflux from sarcolemmal vesicles isolated from rainbow trout Oncorhynchus mykiss white muscle is via simple diffusion // J. Exp. Biol. – 2003. – Vol. 206, Pt. 3. – Р. 543–549. 10.Stanley D.F., Greenspan P. Application of nile red, a fluores- cent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O // J. His- tochem. Cytochem. – 1985. – Vol. 33, №8. – Р. 833–836. Надійшла 10.01.2012 8.Kina T., Ikuta K., Takayama E. et al. The monoclonal antibody TER119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erytroid linea- ge // Br. J. Hematol. – 2000. – Vol. 109, N2. – Р. 280–287. 9.Sharpe R.L., Milligan C.L. Lactate efflux from sarcolemmal vesicles isolated from rainbow trout Oncorhynchus mykiss white muscle is via simple diffusion // J. Exp. Biol. – 2003. – Vol. 206, Pt. 3. – Р. 543–549. 10.Stanley D.F., Greenspan P. Application of nile red, a fluores- cent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O // J. His- tochem. Cytochem. – 1985. – Vol. 33, N8. – Р. 833–836. Accepted 10.01.2012 problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №1 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №1

Вплив різних швидкостей охолодження на життєздатність та клітинний склад суспензії клітин надниркових залоз при кріоконсервуванні

Репозитарії

Схожі ресурси