Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа)
Изучено влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота на функциональную активность лейкоцитов донорской крови человека после криоконсервирования. Отмечено стимулирующее действие фракции (0,15 мг/мл) в составе реабилитирующей среды для деконсервированных нейтрофи...
Gespeichert in:
| Datum: | 2012 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68480 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) / А.К. Гулевский, Ю.С. Ахатова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Горина, В.В. Чижевский, Л.В. Степанюк // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 71-78. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68480 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-684802014-09-26T03:01:49Z Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) Гулевский, А.К. Ахатова, Ю.С. Моисеева, Н.Н. Горина, О.Л. Чижевский, В.В. Степанюк, Л.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология Изучено влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота на функциональную активность лейкоцитов донорской крови человека после криоконсервирования. Отмечено стимулирующее действие фракции (0,15 мг/мл) в составе реабилитирующей среды для деконсервированных нейтрофилов на их поглотительную и переваривающую активность. Установлено, что использование 5 % диметилацетамида в качестве криопротектора позволяет сохранить до 80 % жизнеспособных лейкоцитов. Вивчали вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби на функціональну активність лейкоцитів донорської крові людини після кріоконсервування. Виявлено стимулюючу дію фракції (0,15 мг/мл) у складі реабілітуючого середовища деконсервованих нейтрофілів на їх поглинальну та переварюючу активність. Визначено, що використання диметилацетаміду (5%) в якості кріопротектора дозволяє зберегти до 80% життєздатних лейкоцитів. The influence of the cattle cord blood low-molecular fraction (below 5 kDa) on the functional activity of leukocytes after cryopreservation was studied. The stimulating effects of the fraction (0.15 mg/ml) on digesting and engulfing activities of frozenthawed neutrophils were observed. It was established that the usage of dimethyl acetamide (5%) as a cryoprotectant allowed preserving up to 80% of viable leukocytes. 2012 Article Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) / А.К. Гулевский, Ю.С. Ахатова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Горина, В.В. Чижевский, Л.В. Степанюк // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 71-78. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68480 611.018.5.013.8:612.112.3.014.43 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гулевский, А.К. Ахатова, Ю.С. Моисеева, Н.Н. Горина, О.Л. Чижевский, В.В. Степанюк, Л.В. Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) Проблемы криобиологии |
| description |
Изучено влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота на функциональную активность лейкоцитов донорской крови человека после криоконсервирования. Отмечено стимулирующее действие фракции (0,15 мг/мл) в составе реабилитирующей среды для деконсервированных нейтрофилов на их поглотительную и переваривающую активность. Установлено, что использование 5 % диметилацетамида в качестве криопротектора позволяет сохранить до 80 % жизнеспособных лейкоцитов. |
| format |
Article |
| author |
Гулевский, А.К. Ахатова, Ю.С. Моисеева, Н.Н. Горина, О.Л. Чижевский, В.В. Степанюк, Л.В. |
| author_facet |
Гулевский, А.К. Ахатова, Ю.С. Моисеева, Н.Н. Горина, О.Л. Чижевский, В.В. Степанюк, Л.В. |
| author_sort |
Гулевский, А.К. |
| title |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) |
| title_short |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) |
| title_full |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) |
| title_fullStr |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) |
| title_full_unstemmed |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) |
| title_sort |
оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кда) |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68480 |
| citation_txt |
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию кордовой крови (до 5 кДа) / А.К. Гулевский, Ю.С. Ахатова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Горина, В.В. Чижевский, Л.В. Степанюк // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 71-78. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT gulevskijak ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda AT ahatovaûs ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda AT moiseevann ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda AT gorinaol ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda AT čiževskijvv ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda AT stepanûklv ocenkafagocitarnojaktivnostikriokonservirovannyhsdimetilacetamidomnejtrofilovlejkokoncentrataposlereabilitaciivsredesoderžaŝejnizkomolekulârnuûfrakciûkordovojkrovido5kda |
| first_indexed |
2025-07-05T18:18:53Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:18:53Z |
| _version_ |
1836832033232388096 |
| fulltext |
71
Эффективным средством лечения пациентов
с гематологическими и онкологическими заболе-
ваниями различного генеза является трансфузия
лейкоцитов. При этом обязательное условие для
достижения лечебного эффекта – введение пациен-
ту больших доз функционально активных зрелых
гранулоцитов, долгосрочное хранение которых не-
возможно при положительных температурах [2, 11,
12]. Поэтому вопросы совершенствования методов
хранения лейкоцитов при ультранизких температу-
рах, а также поиск способов восстановления их
функциональной активности после размораживания
сохраняют свою актуальность.
Transfusion of leukocytes is an effective method
of treatment for patients with hematological and on-
cological diseases of different genesis. Thereat, an
essential condition for achieving the positive effect is
introduction into patient of large doses of functionally
active mature granulocytes, long-term storage of which
is not possible at positive temperatures [2, 11, 12]. So
the problems of improving the methods of leukocytes
storage at ultra low temperatures as well as search of
the ways to recover their functional activity after
thawing are of relevance.
Our investigations showed [4] that the method of
leukoconcentrate freezing with DMSO in final concen-
УДК 611.018.5.013.8:612.112.3.014.43
А.К. ГУЛЕВСКИЙ, Ю.С. АХАТОВА*, Н.Н. МОИСЕЕВА,
О.Л. ГОРИНА, В.В. ЧИЖЕВСКИЙ, Л.В. СТЕПАНЮК
Оценка фагоцитарной активности криоконсервированных
с диметилацетамидом нейтрофилов лейкоконцентрата
после реабилитации в среде, содержащей низкомолекулярную
фракцию кордовой крови (до 5 кДа)
UDC 611.018.5.013.8:612.112.3.014.43
A.K. GULEVSKY, YU.S. AKHATOVA*, N.N. MOISEEVA,
O.L. GORINA, V.V. CHIZHEVSKY, L.V. STEPANYUK
Assessment of Phagocytic Activity of Leukoconcentrate Neutrophils
Cryopreserved with Dimethyl Acetamide after Post-Thaw Rehabilitation
in Medium Containing Cord Blood Low-Molecular
Fraction (Below 5 kDa)
Изучали влияние низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови крупного рогатого скота на функциональную
активность лейкоцитов донорской крови человека после криоконсервирования. Отмечено стимулирующее действие фракции
(0,15 мг/мл) в составе реабилитирующей среды для деконсервированных нейтрофилов на их поглотительную и переваривающую
активность. Установлено, что использование 5% диметилацетамида (ДМАц) в качестве криопротектора позволяет сохранить
до 80% жизнеспособных лейкоцитов.
Ключевые слова: низкомолекулярная фракция кордовой крови, криоконсервирование, нейтрофилы, реабилитирующая
среда.
Вивчали вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби на функціональну активність
лейкоцитів донорської крові людини після кріоконсервування. Виявлено стимулюючу дію фракції (0,15 мг/мл) у складі
реабілітуючого середовища деконсервованих нейтрофілів на їх поглинальну та переварюючу активність. Визначено, що
використання диметилацетаміду (5%) в якості кріопротектора дозволяє зберегти до 80% життєздатних лейкоцитів.
Ключові слова: низькомолекулярна фракція кордової крові, кріоконсервування, нейтрофіли, реабілітуюче середовище .
The influence of the cattle cord blood low-molecular fraction (below 5 kDa) on the functional activity of leukocytes after
cryopreservation was studied. The stimulating effects of the fraction (0.15 mg/ml) on digesting and engulfing activities of frozen-
thawed neutrophils were observed. It was established that the usage of dimethyl acetamide (5%) as a cryoprotectant allowed
preserving up to 80% of viable leukocytes.
Key words: cattle cord blood low-molecular fraction, cryopreservation, neutrophils, rehabilitating medium.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
julija_veselovskaja@meta.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 41
35, fax: +380 57 373 3084, e-mail: julija_veselovskaja@meta.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
72
tration of 7.5% allowed preserving up to 98.29 ± 0.34%
of lymphocytes and 97.15 ± 1.04% of monocytes. But
in this case according to the data of flow cytofluo-
rimetry using fluorescent DNA dye 7-AAD the number
of viable granulocytes does not exceed 22.22 ± 1.8%,
that could be the reason to choose more effective
cryoprotectant. An effective cryoprotectant for cells
of granulocytic series is dimethyl acetamide (DMAc)
[2, 7, 12].
The damages in the granulocytic cells associated
with their structural peculiarities are known to appear
even under optimal freezing conditions. Therefore the
rehabilitation of frozen-thawed leukocytes in the media
contributing to restoration of their functional activity is
necessary. After incubation of frozen-thawed leuko-
cytes in the medium containing cord blood low-mole-
cular (below 5 kDa) fraction (CBF) a phagocytic acti-
vity of neutrophils increased [4].
Research aim was to study the influence of cord
blood low-molecular fraction on phagocytic activity of
neutrophils frozen-thawed in the presence of 5%
DMAc.
Materials and methods
Research object was leukoconcentrate isolated
from human donated blood of group A (II) by sedimen-
tation of erythrocytes in dextran solution [5].
Concentrate of leukocytes was cryopreserved
under protection of DMAc in final concentration of
5% using slow cooling regimen [2]. Cryoprotective
solution contained DMAc, glucose, EDTA Na2 and
purified water was prepared ex tempora. Ratio of the
volumes of cell suspension and DMAc solution made
3:1 [12]. DMAc solution was added into suspension
by drop infusion at constant mixing. Cell suspension
with leukocytes concentration of 2×107 cells/ml and
of 0.5 ml volume was cooled with programmable
freezer ZP 10 (Special Designing and Technical Bu-
reau of the Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine of the National Academy of Sciences
of Ukraine) according to 3-step program: I – cooling
of leukoconcentrate samples with rate of 3 deg/min
down to the crystallization temperature; II – ‘tempera-
ture stop’ for 3–4 min; III – further cooling with the
rate of 5 deg/min down to –100°С, then containers
with cells were placed into liquid nitrogen (–196°C).
The suspension was thawed in water bath at 38°C,
afterwards the cryoprotectant was removed out of part
of samples by slow dilution with washing solution which
contained dextran and albumin (1:1) with the following
centrifugation by the method of A.K. Gulevsky [6].
Other samples were studied without washing. Cell
survival was assessed with trypan blue staining [13].
Phagocytic activity of neutrophils was investigated
according to the method of Rozanova O.E. et al. [10].
Object of phagocytosis was the inactivated daily culture
В наших исследованиях было показано [4], что
метод замораживания лейкоконцентрата с ДМСО
в конечной концентрации 7,5% позволяет сохранить
до 98,29 ± 0,34% лимфоцитов и 97,15 ± 1,04% моно-
цитов. Но при этом по данным проточной цито-
флуориметрии с использованием флуоресцентного
ДНК-красителя 7-AAD, количество жизнеспособ-
ных гранулоцитов не превышает 22,22 ± 1,80%, что
является предпосылкой для выбора более эффек-
тивного криопротектора. Одним из эффективных
по отношению к клеткам гранулоцитарного ряда
криопротекторов является диметилацетамид
(ДМАц) [2, 7, 12].
Известно, что даже при оптимальных режимах
замораживания в клетках гранулоцитарного ряда
происходят повреждения, связанные с их структур-
ными особенностями [11, 12]. Поэтому необходима
реабилитация деконсервированных лейкоцитов в
средах, способствующих восстановлению их функ-
циональной активности. После инкубации деконсер-
вированных лейкоцитов в среде, содержащей низ-
комолекулярную (до 5 кДа) фракцию кордовой
крови (ФКК), повышается фагоцитарная актив-
ность нейтрофилов [4].
Цель работы – изучение влияния низкомолеку-
лярной фракции кордовой крови на фагоцитарную
активность нейтрофилов, криоконсервированных
под защитой 5% ДМАц.
Материалы и методы
Объектом для исследования был лейкоконцент-
рат, выделенный из донорской крови человека груп-
пы А(II) методом седиментации эритроцитов декс-
траном [5].
Концентрат лейкоцитов под защитой ДМАц в
конечной концентрации 5% криоконсервировали в
режиме медленного охлаждения [1, 12]. Криоза-
щитный раствор, состоящий из ДМАц, глюкозы,
ЭДТА Na2 и воды для инъекций, готовили ex tem-
pora. Соотношение объемов клеточной суспензии
и раствора ДМАц составляло 3:1 [12]. Раствор
ДМАц в суспензию вносили капельно при постоян-
ном помешивании. Клеточную суспензию с кон-
центрацией лейкоцитов 2×107 клеток/мл и объемом
0,5 мл охлаждали с помощью программного замо-
раживателя ЗП10 (СКТБ ОП ИПКиК НАН Украи-
ны) по 3-этапной программе: I – охлаждение образ-
цов лейкоконцентрата со скоростью 3 град/мин до
температуры кристаллизации; II – «температурная
остановка» 3–4 мин; III – дальнейшее охлаждение
со скоростью 5 град/мин до –100°С, затем контей-
неры с клетками помещали в жидкий азот (–196°С).
Отогревали суспензию на водяной бане при
38°С, после чего из одного образца удаляли крио-
протектор путем медленного разведения отмывоч-
ным раствором, в состав которого входили раство-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
73
ры декстрана и альбумина (1:1), с последующим
центрифугированием по методу Гулевского А.К.
и соавт. [6]. Второй образец исследовали без от-
мывки. Сохранность клеток оценивали с помощью
окрашивания трипановым синим [13].
Фагоцитарную активность нейтрофилов иссле-
довали по методу Розановой О.Е. и соавт. [10].
Объект фагоцитоза – инактивированная суточная
культура Staphylococcus aureus штамм №209 на
физиологическом растворе в концентрации 2 млрд
микробных тел/мл. Фагоцитарную суспензию ин-
кубировали в воздушном термостате при темпе-
ратуре 37°С в течение 45 и 120 мин. Мазки фикси-
ровали раствором эозин-метиленовым синим по
Маю-Грюнвальду, окрашивали раствором азур-
эозина по Романовскому. Критериями оценки функ-
циональной полноценности криоконсервированных
лейкоцитов были следующие показатели: фагоци-
тарный индекс (ФИ) – количество фагоцитирующих
нейтрофилов; фагоцитарное число (ФЧ) – среднее
количество микробных тел на один нейтрофил (по-
сле 45 и 120 мин инкубации), характеризующее
поглотительную активность фагоцитов; индекс
завершенности фагоцитоза (ИЗФ) – отношение ФЧ
после 45 мин инкубации к ФЧ после 120 мин инку-
бации, характеризующее процесс переваривания у
фагоцитов.
Фракцию с компонентами молекулярной массой
до 5 кДа из цельной кордовой крови крупного ро-
гатого скота выделяли методом ультрафильтрации
[3] с использованием мембранного модуля «Sarto-
rius» (Германия). После ультрафильтрации ФКК лио-
филизировали [8] и затем хранили при –80°С. Через
45 и 120 мин инкубации после добавления ФКК в
реабилитирующую среду в количестве 0,15 мг/мл
изучали фагоцитарную активность деконсервиро-
ванных лейкоцитов. При исследовании влияния
ФКК на показатели фагоцитарной активности нейт-
рофилов в качестве контроля были использованы
криоконсервированный лейкоконцентрат без ФКК
(К1) и с добавлением физиологического раствора
в объеме, эквивалентном ФКК (К2).
Статистический анализ экспериментальных
данных проводили при помощи компьютерной
обработки с использованием программного пакета
«Statgraphics plus» версии 2.1 по непараметричес-
кому критерию Манна-Уитни. Экспериментальные
данные приведены как среднее арифметическое ±
среднее квадратическое отклонение. Достоверны-
ми считали различия при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
В ходе экспериментальной работы с помощью
теста с суправитальным красителем трипановым
синим нами был изучен показатель жизнеспособ-
ности лейкоцитов, криоконсервированных под за-
of Staphylococcus aureus N209 in physiological so-
lution in concentration of 2 billion bacterial bodies/ml.
Phagocytic suspension was incubated in thermostated
air bath at 37°C during 45 and 120 min. Blood smears
were fixed with eosin methylene blue according May-
Grunwald, then stained with eosin-methylene blue
according Romanovsky method. Assessment criteria
of functional capacity of cryopreserved leukocytes
were the following indices: phagocytic index (PhI)
which is the number of phagocytizing neutrophils;
phagocytic number (PhN) being the average number
of bacterial bodies per one neutrophil (after 45 and
120 min of incubation) characterizing absorptive ac-
tivity of phagocytes; and phagocytosis completeness
index (PhCI) which is the ratio of PhN after 45-min
incubation to PhN after 120-min incubation characteri-
zing the digestion in phagocytes.
Fraction with components of molecular mass below
5 kDa from whole cattle cord blood was isolated by
ultrafiltration method [3] using membrane module from
Sartorius (Germany). After ultrafiltration the CBF was
frozen-dried [8] and then stored at –80°C. In 45 and
120 min of incubation after addition of 0.15 mg/ml CBF
in rehabilitation medium the phagocytic activity was
studied. Investigation of CBF effect on the indices of
neutrophils phagocytic activity utilized as the controls
the cryopreserved leukoconcentrate without CBF (C1)
and the one supplemented with physiological solution
in amount equal to CBF (C2).
Statistical analysis of experimental data was per-
formed by computer processing with software package
Statgraphics plus 2.1 by non-parametric criterion of
Mann-Whitney. Experimental data were presented as
arithmetic mean ± mean square deviation. The diffe-
rences were assumed as significant at p < 0.05.
Results and discussion
Performing the experiments we have assessed via-
bility index of leukocytes cryopreserved under protec-
tion of DMAc (5%) using supravital dye trypan blue.
Results of investigations showed that this cryopro-
tectant allowed preserving 79.96 ± 1.75% of viable
cells (Table). Previously [4, 6] we have shown that
after leukoconcentrate cryopreservation with 7.5%
DMSO this index did not exceed 69.06 ± 2.63%.
Further removal of DMAc by described above method
slightly decreased the number of viable cells.
It was shown [7] that DMAc has an advantage to
allow preserving up to 80 ± 1.49% of leukocytes in
viable state even in comparatively low concentrations
(1.5–2.5%) [7]. Moreover, when using DMAc the du-
ration of hyperosmotic stress for cells was less expres-
sed enabling to increase the number of viable granulo-
cytes by 7–10% if compared to the case of 10% DMSO
as a cryoprotectant [7]. It is worth noting that in case
of DMAc there was no need of long-lasting incubation
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
74
of cells with cryoprotective solution and washing of
the sample after thawing, that decreased the period of
cryoprotectant exposure to cells and allowed to preser-
ve the higher number of viable granulocytes.
Investigation of phagocytosis indices has shown that
there was a tendency to the decrease of neutrophils
absorptive activity in the presence of 5% DMAc in
incubation medium (Fig. 1B). DMAc did not affect
significantly the number of phagocytizing neutrophils
and phagocytosis completeness index in the used
concentration (Fig. 1A, C).
In further experiments we studied the indices of
phagocytic activity of neutrophils cryopreserved under
protection of DMAc (Fig. 2). We established that cryo-
preservation had significantly decreased the number
of phagocytizing neutrophils after 45 and 120 min in-
cubation by 29.5 and 28.81%, accordingly (Fig. 2A).
Absorptive activity of frozen-thawed neutrophils
(PhN) after 45 min incubation also significantly
(p < 0.05) decreased by 42.45% comparing with the
control (Fig. 2B).
Moreover, the decrease of phagocytic activity was
reflected in digesting activity (PhCI) of neutrophils
which decreased by 36.92% in average (Fig. 2C).
In further experiments there was investigated the
possibility of rehabilitation of frozen-thawed neutrophils
after incubation in the medium containing cord blood
щитой ДМАц (5%). Результаты иссле-
дований показали, что этот криопро-
тектор позволяет сохранять до 79,96 ±
1,75% жизнеспособных клеток (таб-
лица). Ранее было показано [4, 6], что
после криоконсервирования лейкокон-
центрата с 7,5% ДМСО данный пока-
затель не превышал 69,06 ± 2,63%. Даль-
нейшее удаление ДМАц описанным
выше методом незначительно умень-
шало количество жизнеспособных кле-
ток.
Одно из преимуществ ДМАц в том,
что даже в сравнительно низких кон-
центрациях (1,5–2,5%) он позволяет
сохранять в жизнеспособном состоя-
нии до 80 ± 1,49% лейкоцитов [7]. Кроме
того, при использовании ДМАц дли-
тельность гиперосмотического стрес-
са для клеток менее выражена, что
позволяет увеличить количество жиз-
неспособных гранулоцитов на 7–10%
по сравнению с использованием 10%
ДМСО в качестве криопротектора [7].
Следует также отметить, что при при-
менении ДМАц не требуются экспо-
зиция клеток с криозащитным раство-
ром и отмывка образца после размора-
Жизнеспособность лейкоцитов до и после криоконсервирования
под защитой 5% ДМАц
Viability of leukocytes prior to and after cryopreservation under
protection of 5% DMAc
цезарбО
nemicepS
%,ьтсонбосопсензиЖ
%,ytilibaiV
тартнецнококйелйыннеледывежевС
etartnecnocokuelhserF
6=n
24,0±18,79
цАМДсиицабукниелсоптартнецнококйеЛ
cAMDhtiwnoitabucniretfaetartnecnocokueL
5=n
87,0±57,49
елсоптартнецнококйеЛ
цАМД%5сяинаворивреснокоирк
noitavreserpoyrcretfaetartnecnocokueL
cAMD%5htiw
6=n
*57,1±69,67 #
елсоптартнецнококйеЛ
яинаворивреснокоирк
иквымтоицАМД%5с
noitavreserpoyrcretfaetartnecnocokueL
gnihsawdnacAMD%5htiw
6=n
*98,1±28,96 #
Примечания: * – отличия достоверны по отношению к свежевыделенному
лейкоконцентрату (р < 0,05); # – отличия достоверны по отношению
к лейкоконцентрату после инкубации с 5% ДМAц в среде (р < 0,05).
Notes: * – the differences are significant if compared to the fresh leukocon-
centrate (p < 0.05); # – differences are significant if compared to the leukocon-
centrate after incubation with 5% DMAc in the medium (p < 0.05).
живания, что уменьшает время воздействия крио-
протектора на клетки и позволяет сохранить боль-
шее количество жизнеспособных гранулоцитов.
Изучение показателей фагоцитоза показало, что
в присутствии 5% ДМАц в инкубационной среде
имеется тенденция к снижению поглотительной
активности нейтрофилов (рис.1, B). На количество
фагоцитирующих нейтрофилов и индекс завершен-
ности фагоцитоза ДМАц в используемой концент-
рации не оказывал достоверного влияния (рис.
1A, C).
В дальнейших экспериментах нами были изуче-
ны показатели фагоцитарной активности нейтрофи-
лов, криоконсервированных под защитой ДМАц
(рис. 2). При этом было установлено, что крио-
консервирование достоверно снижало количество
фа-гоцитирующих нейтрофилов через 45 и 120 мин
инкубации на 29,5 и 28,81% соответственно
(рис. 2, A).
Поглотительная активность деконсервирован-
ных нейтрофилов (ФЧ) после 45 мин инкубации так-
же достоверно (р < 0,05) снижалась на 42,45% по
сравнению с контролем (рис. 2, B).
Кроме того, уменьшение фагоцитарной актив-
ности отражалось на переваривающей активности
(ИЗФ) нейтрофилов, которая снижалась в среднем
на 36,92% (рис. 2, C).
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
75
В последующих экспериментах была исследо-
вана возможность реабилитации деконсервирован-
ных нейтрофилов после инкубации в среде, содер-
жащей низкомолекулярную фракцию кордовой
крови (до 5 кДа) в концентрации 0,15 мг/мл. При
этом было обнаружено, что ФКК не оказывала до-
стоверного влияния на количество нейтрофилов,
low-molecular fraction (below 5 kDa) in 0.15 mg/ml
concentration. Thereat, we noted that CBF did not
significantly affect the neutrophils number involved into
phagocytic reaction (Fig. 3A) that correlated with our
recent data [6].
Analysis of the absorptive activity of frozen-thawed
neutrophils revealed other dynamics. Supplementing
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
К1 К2 ДМАЦ
0
10
20
30
40
50
60
70
К1 К2 ДМАЦ
DMAc
Ф
аг
оц
ит
ар
ны
й
ин
де
кс
,%
Ph
ag
oc
yt
ic
in
de
x,
%
Ф
аг
оц
ит
ар
но
е
чи
сл
о,
а
бс
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
n
um
be
r,
ab
s.
u
ni
ts
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
К1 К2 ДМАЦ
И
нд
ек
с
за
ве
рш
ен
но
ст
и
ф
аг
оц
ит
оз
а,
о
тн
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
c
om
pl
et
en
es
s
in
de
x,
a
rb
.
un
its
DMAc DMAcC1 C2 C1 C2C1 C2
Рис. 1. Влияние инкубации в 5%-м растворе ДМАц на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов лейко-
концентрата донорской крови человека: A – фагоцитарный индекс; B – фагоцитарное число; C – индекс завершенности
фагоцитоза (К1– свежевыделенный лейкоконцентрат и К2 – свежевыделенный лейкоконцентрат с добавлением
физиологического раствора); – 45 мин инкубации; – 120 мин инкубации.
Fig. 1. Effect of exposure in 5% DMAc solution on indices of phagocytic activity of human donated blood leukoconcentrate
neutrophils: A – phagocytic index; B – phagocytic number; C – phagocytosis completeness index (C1 – fresh leukocon-
centrate and C2 – fresh leukoconcentrate with physiological solution); – 45 min of incubation; – 120 min of incubation.
* *
0
10
20
30
40
50
60
70
*
0
1
2
3
4
5
6
7
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
ПослеДо
криоконсервирования
ПослеДо
криоконсервирования
ПослеДо
криоконсервирования
AfterPrior to
cryopreservation
AfterPrior to
cryopreservation
AfterPrior to
cryopreservation
Рис. 2. Влияние криоконсервирования под защитой ДМАц на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов
лейкоконцентрата донорской крови человека: A – фагоцитарный индекс; B – фагоцитарное число; С – индекс
завершенности фагоцитоза; – 45 мин инкубации; – 120 мин инкубации; * – отличия достоверны по сравнению
с контролем до криоконсервирования (р<0,05).
Fig. 2. Effect of cryopreservation under DMAc protection on indices of phagocytic activity of human donated blood
leukoconcentrate neutrophils: A – phagocytic index; B – phagocytic number; C – phagocytosis completeness index; –
45 min of incubation; – 120 min of incubation;* – the differences are significant if compared to the control prior to
cryopreservation (p < 0.05).
Ф
аг
оц
ит
ар
ны
й
ин
де
кс
,%
Ph
ag
oc
yt
ic
in
de
x,
%
Ф
аг
оц
ит
ар
но
е
чи
сл
о,
а
бс
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
n
um
be
r,
ab
s.
u
ni
ts
И
нд
ек
с
за
ве
рш
ен
но
ст
и
ф
аг
оц
ит
оз
а,
о
тн
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
c
om
pl
et
en
es
s
in
de
x,
a
rb
.
un
its
А B C
А B C
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
#
*
# # #
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
K1 K2 ФКК K1 K2 ФКК
76
вступивших в фагоцитарную реакцию (рис. 3, A),
что согласуется с данными предыдущего исследо-
вания [6] .
При изучении поглотительной активности декон-
сервированных нейтрофилов была отмечена совер-
шенно иная динамика. Добавление в среду инкуба-
ции ФКК (0,15 мг/мл) способствовало увеличению
поглотительной активности нейтрофилов после
45 мин инкубации на 62,67% по сравнению с К1
и К2 (рис. 3, B). При этом показатель ФЧ после
120 мин инкубации в тех же условиях был на уровне
контрольных значений. Необходимо отметить тот
факт, что после 120 мин инкубации деконсервиро-
ванных нейтрофилов без добавления ФКК их погло-
the incubation medium with CBF (0.15 mg/ml) contri-
buted to the increase of neutrophils absorptive activity
after 45 min incubation by 62.67% if compared with
the controls C1 and C2 (Fig. 3B). Herewith, PhN index
after 120-min incubation in the same conditions was
at the level of the control indices. It is worth noting
that after 120 min incubation of frozen-thawed netro-
phils without CBF their absorptive activity was higher
than after 45 min incubation, that obviously testified to
the worsening of microorganisms digestion (Fig. 3B).
This suggestion about worsened neutrophils digestive
activity was well confirmed by the data of PhCI reflec-
ting the ability of phagocytes to the killing-effect [9].
Completeness of phagocytosis is final index by which
0
10
20
30
40
50
60
К1 K2 ФКК K1 K2 ФКК
*
0
1
2
3
4
5
6
7
K1 K2 ФКК K1 K2 ФКК
C1 C2 CBF C1 C2 CBF
До отмывки
Prior to washing
После отмывки
After washing
C1 C2 CBF C1 C2 CBF
До отмывки
Prior to washing
После отмывки
After washing
C1 C2 CBF C1 C2 CBF
До отмывки
Prior to washing
После отмывки
After washing
Ф
аг
оц
ит
ар
ны
й
ин
де
кс
,%
Ph
ag
oc
yt
ic
in
de
x,
%
Ф
аг
оц
ит
ар
но
е
чи
сл
о,
а
бс
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
n
um
be
r,
ab
s.
u
ni
ts
И
нд
ек
с
за
ве
рш
ен
но
ст
и
ф
аг
оц
ит
оз
а,
о
тн
. е
д.
Ph
ag
oc
yt
ic
c
om
pl
et
en
es
s
in
de
x,
a
rb
.
un
its Рис. 3. Влияние ФКК на показатели фагоцитарной актив-
ности криоконсервированных нейтрофилов лейкокон-
центрата: A – фагоцитарный индекс; B – фагоцитарное
число ( – 45 мин инкубации; – 120 мин инкубации);
C – индекс завершенности фагоцитоза ( – у нативных
нейтрофилов; К1 – лейкоконцентрат, криоконсерви-
рованный с 5% ДМАц; К2 – лейкоконцентрат с заменой
ФКК на эквивалентный объем физиологического
раствора и криоконсервированный с 5% ДМАц); * –
отличия достоверны по сравнению с контролем после
криоконсервирования (р < 0,05); # – отличия достоверны
по сравнению с контролем до криоконсервирования
(р < 0,05).
Fig. 3. CBF effect on indices of phagocytic activity in cryo-
preserved leukoconcentrate neutrophils: A – phagocytic
index; B – phagocytic number (45 min of incubation; 120
min of incubation); c – phagocytosis completeness index
( – in native neutrophils; C1 – leukoconcentrate
cryopreserved with 5% DMAc; C2 – leukoconcentrate with
physiological solution instead equal CBF volume and
cryopreserved with 5% DMAc ); * – the differences are
significant if compared to the control after cryopreservation
(p < 0.05); # – the differences are significant if compared to
the control prior to cryopreservation (p < 0.05).
А B
C
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
77
тительная активность была выше, чем после
45 мин инкубации, что, по-видимому, свидетель-
ствует об ухудшении процесса переваривания мик-
роорганизмов (рис. 3, B). Это предположение об
ухудшении переваривающей активности нейтро-
филов хорошо подтверждается данными изучения
ИЗФ, который отражает способность фагоцитов
к киллинг-эффекту [9]. Завершенность фагоцитоза
является итоговым показателем, по которому мож-
но косвенно судить об эффективности всех преды-
дущих этапов фагоцитоза – хемотаксисе, адгезии,
поглощении, образовании фагосом и переваривании
поглощенных микроорганизмов. В наших исследо-
ваниях показано, что после криоконсервирования
переваривающая активность нейтрофилов досто-
верно снижалась до 0,82 ± 0,05 по сравнению с конт-
ролем до криоконсервирования (не менее 1). Добав-
ление в среду инкубации ФКК (0,15 мг/мл) приво-
дило к повышению ИЗФ криоконсервированных
нейтрофилов до значений данного показателя для
свежевыделенных клеток (1,39 ± 0,04) (рис. 3, C).
Удаление криопротектора из лейкоконцентрата,
подвергнутого криоконсервированию, не оказывало
достоверного влияния на все изучаемые показа-
тели фагоцитарной активности лейкоцитов.
Таким образом, на основании проведенных на-
ми исследований было установлено, что использо-
вание ДМАц в качестве криопротектора позво-
ляет увеличить количество жизнеспособных лейко-
цитов, а также показано, что ФКК в составе реаби-
литирующей среды оказывает стимулирующее
действие на фагоцитарную активность деконсер-
вированных нейтрофилов. Для выяснения механиз-
ма действия низкомолекулярной ФКК на процесс
фагоцитоза необходимо дальнейшее его изучение.
Выводы
1. Использование в качестве криопротектора
5% ДМАц позволяет увеличить количество жизне-
способных лейкоцитов после замораживания-ото-
грева до 80%.
2. Установлено, что после добавления в среду
инкубации низкомолекулярной фракции (до 5 кДа)
кордовой крови в концентрации 0,15 мг/мл повы-
шается поглотительная активность деконсервиро-
ванных нейтрофилов на 62,67 %.
3. После инкубации деконсервированных нейт-
рофилов в среде, содержащей низкомолекулярную
фракцию (до 5 кДа) кордовой крови в концентрации
0,15 мг/мл, на 69,51% повышается их перевариваю-
щая активность.
4. Показано, что низкомолекулярная фракция (до
5 кДа) кордовой крови в концентрации 0,15 мг/мл
в среде инкубации не оказывает влияния на коли-
чество нейтрофилов, вступивших в фагоцитарную
реакцию.
one may indirectly evaluate the efficiency of all pre-
vious phagocytosis stages, i. e. hemotaxis, adhesion,
absorption, formation of phagosomes and digestion of
absorbed microorganisms. Our research showed that
neutrophils digestive activity significantly decreased
down to 0.82 ± 0.05 post cryopreservation comparing
to the non-frozen-thawed control (not less than 1).
Supplementing of incubation medium with CBF
(0.15 mg/ml) led to the increase of PhCI of cryopreser-
ved neutrophils up to the values of this index for fresh
cells (1.39 ± 0.04) (Fig. 3C).
Cryoprotectant removal out of leukoconcentrate
after cryopreservation did not significantly affect all
the studied indices of leukocytes phagocytic activity.
Thus basing on the performed investigations we
established that using DMAc as a cryoprotectant al-
lowed the increasing of viable leukocytes number post
cryopreservation, and that CBF as a component of
rehabilitation medium had a stimulatory effect on
phagocytic activity of frozen-thawed neutrophils.
Further investigation is necessary to elucidate the me-
chanism of low-molecular CBF action on phagocytosis.
Conclusions
1. Using of 5% DMAc as a cryoprotectant allows
to increase the post-thaw number of viable leukocytes
up to 80%.
2. We established after supplementing of incubation
medium with cord blood low-molecular fraction (below
5kDa) in 0.15 mg/ml concentration the absorptive acti-
vity of frozen-thawed neutrophils increased by 62.67%.
3. After incubation of frozen-thawed neutrophils in
the medium containing cord blood low-molecular frac-
tion (below 5kDa) in 0.15 mg/ml concentration their
digestive activity increases by 69.51%.
4. It has been shown that cord blood low-molecular
fraction (below 5kDa) in 0.15 mg/ml concentration as
a part of incubation medium does not affect the number
of neutrophils involved in phagocytic reactions.
References
1. Agranenko V.A., Abezgauz N.N., Troshina V.M. et al. Cryo-
preservation of granulocytes using ‘Leukocryodmac’ solution //
Hematologiya i Transfuziologiya. – 1986. – Vol. XXXI, N12. –
P. 26–29.
2. Balashov D.N. Therapeutic granulocyte transfusions for treat-
ment of severe infectional complications in patients with neutro-
penia: Author's abstract of thesis of candidate of medical
sciences. – Moscow, 2001. – 23 p.
3. Brock T.D. Membrane filtration. – Moscow: Mir, 1987. – 464 p.
4. Gorina O.L. Rehabilitation of cryopreserved leukocytes in medium
containing cord blood low-molecular fraction: Author's abstract
of candidate of biological sciences. – Kharkov, 2011. – 143 p.
5. Grishina V.V., Timokhina E.V., Andreeva L.Yu. System of col-
lecting and fractioning of umbilical blood stem cells // Voprosy
Ginekologii, Akusherstva i Perinatologii. – 2004. – Vol. 3, N6. –
P. 50–54.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
78
Литература
1. Аграненко В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. и др. Криоконсер–
вирование гранулоцитов с раствором «Лейкокриодмац» //
Гематология и трансфузиология. – 1986. – Т. XXXI, №12. –
С. 26–29.
2. Балашов Д.Н. Лечебные трансфузии гранулоцитов для
лечения тяжелых инфекционных осложнений у пациентов
с нейтропенией: Автореф. дис. ...канд.мед. наук. – М.,
2001. – 23 с.
3. Брок Т.Д. Мембранная фильтрация. – М.: Мир, 1987. – 464 с.
4. Горина О.Л. Реабилитация криоконсервированных лейко-
цитов в среде, содержащей низкомолекулярную фракцию
кордовой крови: Дис. ... канд. биол. наук. – Харьков, 2011.–
143 с.
5. Гришина В.В., Тимохина Е.В., Андреева Л.Ю. Система сбо-
ра и фракционирования стволовых клеток пуповинной кро-
ви // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. –
2004. – Т. 3, №6. – С. 50–54.
6. Гулевский А.К., Горина О.Л., Моисеева Н.Н., Степанюк Л.В.
Стимулирующее действие низкомолекулярной фракции (до
5 кДа) кордовой крови и Actovegin на фагоцитарную актив-
ность деконсервированных лейкоцитов // Укр. журнал ге-
матології та трансфузіології. – 2010. – №1. – С. 22–29.
7. Леонтович В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. Метод замо-
раживания гранулоцитов с диметилацетамидом // Со-
временные проблемы криобиологии и криомедицины. – М.,
1975. – С. 77–84.
8. Медичні імунобіологічні препарати: Методичні рекоменда-
ції щодо викладення технологічних регламентів на препара-
ти крові [Настанова з якості 42-3002-011-2005]. – Київ, МОЗ
України [Наказ МОЗ України № 376 від 26.07.2005]. – 144 с.
9. Пинегин Б.В., Маянский Н.А. Нейтрофилы: структура
и функция // Иммунология. – 2007. – №6. – С. 374–382.
10.Розанова О.Е., Серова Л.Д., Шабалин В.Н. Влияние цито-
статических и гормональных препаратов на фагоцитарную
активность нейтрофилов больных лейкозом // Гематология
и трансфузиология. – 1989. – №4. – С. 15–20.
11.Сведенцов Е.П., Щеглова О.О., Туманова Т.В. и др. Со-
хранность лейкоцитов в условиях криоанабиоза (–40°С) //
Journal of Stress Physiology and Biochemistry. – 2006. – Vol. 2,
№1. – P. 29–34.
12. Цуцаева А.А., Аграненко В.А., Федорова Л.И. и др. Криокон-
сервирование клеточных суспензий. – Киев: Наук.думка,
1983. – 240 с.
13.Kusaba N., Kumashiro R., Ogata H. et al. In vitro study of
neutrophil apoptosis in liver cirrhosis // Intern. Med. – 1998. –
Vol. 37, №1. – P. 11–17
Поступила 06.03.2012
6. Gulevsky A.K., Gorina O.L., Moiseeva N.N., Stepanyuk L.V.
Stimulating effect of cord blood low-molecular fraction (below
5 kDa) and Actovegin on phagocytic activity of frozen-thawed
leukocytes // Ukrainskiy Zhurnal Gematologii i Transfusiologii. –
2010. – N1. – P. 22–29.
7. Leontovich V.A., Abezgauz N.N., Troshina V.M. Use of dimethyl
acetamide as a cryoprotective agent in granulocyte freezing //
Current Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – Moscow,
1975. – P. 77–84.
8. Medical immunobiological preparations: Methodical recom-
mendations for presentation of technical regulations for blood
preparations [Quality instruction of 42-3002-011-2005]. – Kyiv,
Ministry of Health Care of Ukraine [Order of the Ministry of
Health Care of Ukraine N376 dated of 26.07.2005]. – 144 p.
9. Pinegin B.V., Mayansky A.N. Neutrophils: structure and func-
tion // Immunologiya. – 2007. – N6. – P. 374–382.
10.Rozanova O.E., Serova L.D., Shabalin V.N. Effect of cytosta-
tic and hormonal drugs on the phagocytic activity of neutrophils
of leukemia patients // Gematologiya i Transfuziologiya. –
1989. – N4. – P. 15–20.
11.Svedentsov E.P., Shcheglova O.O., Tumanova T.V. et al. Pre-
servation of leukocytes in conditions of cryoanabiosis (–40°C) //
Journal of Stress Physiology and Biochemistry. – 2005. – Vol. 2,
N1. – P. 29–34.
12.Tsutsaeva A.A., Agranenko V.A., Fedorova L.I. et al. Cryopre-
servation of cell suspensions. – Kiev: Naukova Dumka, 1983. –
240 p.
13.Kusaba N., Kumashiro R., Ogata H. et al. In vitro study of
neutrophil apoptosis in liver cirrhosis // Intern. Med. – 1998. –
Vol. 37, N1. – P. 11–17
Accepted 06.03.2012
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
|