Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей

Проведен сравнительный анализ направленной остеогенной дифференцировки мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани мышей in vitro по стандартному протоколу и поэтапной их дифференцировки....

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2012
Hauptverfasser:	Кучук, О.В., Кирик, В.М.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2012
Schriftenreihe:	Проблемы криобиологии
Schlagworte:	Краткие сообщения
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68495
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей / О.В. Кучук, В.М. Кирик // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 161-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-68495
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-684952014-09-26T03:02:00Z Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей Кучук, О.В. Кирик, В.М. Краткие сообщения Проведен сравнительный анализ направленной остеогенной дифференцировки мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани мышей in vitro по стандартному протоколу и поэтапной их дифференцировки. Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме «День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в г. Харькове. 2012 Article Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей / О.В. Кучук, В.М. Кирик // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 161-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68495 611.018.26.085.25 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Краткие сообщения Краткие сообщения
spellingShingle	Краткие сообщения Краткие сообщения Кучук, О.В. Кирик, В.М. Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей Проблемы криобиологии
description	Проведен сравнительный анализ направленной остеогенной дифференцировки мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани мышей in vitro по стандартному протоколу и поэтапной их дифференцировки.
format	Article
author	Кучук, О.В. Кирик, В.М.
author_facet	Кучук, О.В. Кирик, В.М.
author_sort	Кучук, О.В.
title	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
title_short	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
title_full	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
title_fullStr	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
title_full_unstemmed	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
title_sort	поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2012
topic_facet	Краткие сообщения
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68495
citation_txt	Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей / О.В. Кучук, В.М. Кирик // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 161-164. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии
work_keys_str_mv	AT kučukov poétapnaâdifferencirovkavosteogennomnapravleniimulʹtipotentnyhkletokžirovojtkanimyšej AT kirikvm poétapnaâdifferencirovkavosteogennomnapravleniimulʹtipotentnyhkletokžirovojtkanimyšej
first_indexed	2025-07-05T18:19:29Z
last_indexed	2025-07-05T18:19:29Z
_version_	1836832071415234560
fulltext	161 Известно, что в эмбриогенезе формирование ске- лета происходит за счет внутримембранной оссифи- кации клеток и окостенения его хрящевой основы с предварительным образованием узелков оссифика- ции. Несмотря на то, что при этих процессах большин- ство клеток хрящевой ткани отмирает, замещаясь ранними остеопрогениторами, было установлено, что часть из них остается, внося свой вклад в развитие костной ткани [6]. В нашей работе показано, что остеодифференцировка мультипотентных стромаль- ных клеток из жировой ткани (МСК ЖТ) мышей с предварительной их хондроиндукцией увеличивает количество узелков оссификации клеток in vitro. В данной работе проведен сравнительный анализ направленной остеогенной дифференцировки МСК ЖТ мышей in vitro по стандартному протоколу и поэтапной их дифференцировки. Фрагменты подкожной жировой клетчатки полу- чали от 3-месячных самцов мышей линии FVB дикого типа, тщательно отмывали от крови в растворе питатель- ной среды RPMI-1640 с антибиотиками «PenStrep» ×100 (все «Sigma», США). После этого ткань перено- сили в раствор 0,1% коллагеназы 1А («РАА», Авст- рия) и инкубировали 2–2,5 ч при 37°С при постоян- ном перемешивании. По истечении срока фермента- ции действие фермента ингибировали добавлением равного объема полной питательной среды DMEM с 10% FBS (Fetal Bovine Serum, все «Sigma») и ресус- пендировали до получения однородной суспензии. Клетки осаждали центрифугированием при 200g в течение 5 мин. Супернатант, содержащий зрелые ади- поциты, липиды и дебрис, отбрасывали, осадок ре- суспендировали в питательной среде и пропускали через клеточный фильтр с диаметром пор 70 мкм. В полученной суспензии подсчитывали количество кле- It is known that embryogenesis is accompanied by the formation of skeleton due to intramembrane ossi- fication of cells and calcification of its cartilage matrix with pre-formation of ossification nodes. Despite the fact that during these processes the bulk of cells of carti- laginous tissue die and are replaced by early osteoproge- nitors, it is established that the part of them remains intact and contributes to the development of bone tissue [6]. In our work it has been shown that osteodifferentia- tion of mice multipotent stromal cells from adipose tissue (AD MSCs) with their preliminary chondroinduction increases the number of cell ossification nodes in vitro. In this investigation we have comparatively analyzed the directed osteogenic differentiation of mice AD MSCs in vitro according to the standard protocol or their step- wise differentiation. Fragments of subdermal adipose tissue were obtai- ned from FVB male mice of wild type (3-month-old), then thoroughly washed free of blood with solution of nutrient medium RPMI-1640 supplemented with anti- biotics PenStrep×100 (both from Sigma, USA). Then the tissue was transferred into solution of 0.1% collage- nase 1A (PAA, Austria) and incubated for 2–2.5 hrs at 37°C with constant mixing. After termination of fermen- tation the effect of enzyme was inhibited by supplemen- ting with complete nutrient medium DMEM with 10% fetal bovine serum (FBS; both from Sigma) of equal volume, after that it was resuspended until getting homo- geneous. The cells were sedimented by centrifugation at 200g for 5 min. Supernatant with mature adipocytes, lipids and debris was removed, sediment was re- suspended in nutrient medium and was passed through cell filter with 70 mm pores. In the obtained suspension we estimated the number of cells using the test with Trypan blue and seeded them into culture flasks (Sarstedt УДК 611.018.26.085.25 О.В. КУЧУК, В.М. КИРИК Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей# UDC 611.018.26.085.25 O.V. KUCHUK, V.M. KYRYK Stepwise Differentiation of Multipotent Cells from Murine Adipose Tissue in Osteogenic Direction# Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Вышгородская, 67; Киев, Украина 04114; электронная почта: olkups@gmail.com To whom correspondence should be addressed: 67, Vyshgorodska str., Kyiv, Ukraine 04414; e-mail: olkups@gmail.com 1Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the Na- tional Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины» #This reseach was presented at minisimposium Stem Cell Day, held in Kharkov, Ukraine, on the 22th of May, 2012. #Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме «День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в г. Харькове. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 162 Cell+, Germany) with com-plete nutrient medium in an amount of 5×105 cells/cm2. After incubation in 5% CO2 at 37°C and humid air during 4 hrs we changed completely the nutrient culture medium and continued the incubation at standard conditions untill subconfluent monolayer. To expand cell mass the cells were subcul- tured during 1–2 passages using the trypsin solution (2000 U; Sigma) for destruction of monolayer. For phenotyping cell cultures we used monoclonal antibodies to mice membrane antigens labelled with fluorochromes and with corresponding isotope-control: anti-CD44 PE, anti-CD73 PE, anti-CD90 PE, anti-CD34 APC, anti-CD45 PE-Cy7, anti-CD117 PE-Cy7 (Becton Dickinson, USA). The cells were incubated with antibodies in concent- ration of 0.5 µg for 106 cells during 30 min, then centri- fuged in 1 ml BD CellWash solution (Becton Dickinson) at 200 g for 5 min, the sediment was washed twice in CellWash and not less than 10,000 events were analyzed with cell sorter FACSAria with FACSDiva 6.1.2. softwa- re (Becton Dickinson). To adjust the compensation of overlapping fluorochrome emission spectra in multi- parameter analysis we used the control samples of cells without added antibodies (unstained control), the samples with separate antibodies (single stained control) and the samples with combination of several antibodies without one (fluorescence minus one control). It is known that with ageing the cell potential to differentiation decreases. During in vitro culturing the cells senescence more rapidly than in vivo. That is exactly why the cells of early passages (up to 4–6) are recommended for experimental investigations [2, 5]. For the induction of osteogenic differentiation in vitro the obtained AD MSCs at 1–2 passages were seeded into wells of 6 well plates in an amount of 4×104 cells/cm2 and were incubated till formation of subconfluent monolayer. Then the culture medium was changed for the medium for differentiation. Previously described methods were used to perform standard osteoinduction [3]. Nutrient medium DMEM:F12 was supplemented with 7% FBS and L-ascorbate-2-phosphate (0.05 mM), β-glycerophosphate (10 mM) and dexamethasone (100 nm) (Sigma). The medium for osteodifferentiation was completely changed every 3–4 days during 21 days. Stepwise osteogenic differentiation consisted in follows: firstly the cells were induced towards chondrogenic li- neage, then the cells were incubated in standard medium for osteogenic differentiation. The medium for chondro- genic differentiation was prepared by earlier described methods [1, 5]. It contained DMEM with 7% FBS as well as L-ascorbate-2-phosphate (50 mg/ml), dexame- thasone (39 ng/ml), Na pyruvate (100 mg/ml), TGF-β (10 ng/ml) and IGF-I (100 ng/ml) (Sigma). Complete change of the medium for chondrogenic differentiation was performed every 3–4 days during 10 days, thereafter the medium for standard osteogenic differentiation was ток в тесте с трипановым синим и высаживали в куль- туральные флаконы («Sarstedt Cell+», Германия) в пол- ную питательную среду из расчета 5×105 клеток/см2. После инкубации в условиях 5% СО2, 37°С и влаж- ном воздухе на протяжении 4 ч проводили полную замену питательной среды для культивирования и про- должали инкубировать при стандартных условиях до получения субконфлюэнтного монослоя. Для наращи- вания клеточной массы клетки субкультивировали на протяжении 1–2 пассажей; для деструкции монослоя использовали раствор трипсина (2000 U; «Sigma») . Для фенотипирования культур клеток использова- ли моноклональные антитела к мембранным антиге- нам мышей, меченные флуорохромами, с соответст- вующим изотип-контролем: anti-CD44 PE, anti-CD73 PE, anti-CD90 PE, anti-CD34 APC, anti-CD45 PE-Cy7, anti-CD117 PE-Cy7 («Becton Dickinson», США). Клетки инкубировали с антителами в рабочей кон- центрации 0,5 мкг на 106 клеток на протяжении 30 мин, центрифугировали в 1 мл раствора «BD CellWash» («Becton Dickinson») при 200 g на протяже- нии 5 мин, осадок дважды промывали в «CellWash» и анализировали не менее 10 000 событий с помощью проточного цитофлуориметра-сортера «BD FACSAria» с использованием программного обеспечения «BD FACS Diva 6.1.2» («Becton Dickinson»). Для настрой- ки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без внесе- ния антител (unstained control), образцы с каждым антителом отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител без одного (fluo- rescence minus one control). Известно, что с возрастом потенциал клеток к диф- ференцировке снижается. При культивировании in vitro клетки стареют быстрее, чем in vivo. Именно поэтому для экспериментальных исследований реко- мендуется использовать клетки ранних пассажей (до 4–6) [2, 5]. Для индукции остеогенной дифференци- ровки in vitro полученные МСК ЖТ на 1–2 пассаже высаживали в лунки 6-луночных планшетов из рас- чета 4×104 клеток/см2 и инкубировали до получения субконфлюэнтного монослоя. Затем культуральную среду заменяли на среду для дифференцировки. Для проведения стандартной остеоиндукции использовали ранее описанные методики [3]. В питательную среду DMEM:F12 добавляли 7% FBS и дополняли L-аскор- биновой кислоты 2-фосфатом (0,05 мМ), β-глицеро- фосфатом (10 мМ) и дексаметазоном (100 нМ) (все «Sigma»). Полную замену среды для остеодифферен- цировки проводили каждые 3–4 дня на протяжении 21 суток. Процесс поэтапной остеогенной дифферен- цировки заключался в том, что сначала клетки инду- цировали в хондрогенном направлении, а затем – ин- кубировали в стандартной среде для остеогенной дифференцировки. Среду для хондрогенной диффе- problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 163 ренцировки готовили по ранее описанным методикам [1, 5]. Она состояла из DMEM с добавлением 7% FBS, а также L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (50 мкг/мл), дексаметазона (39 нг/мл), Na пирувата (100 мкг/мл) и факторов роста TGF-β (10 нг/мл) и IGF-І (100 нг/мл) (все «Sigma»). Полную замену сре- ды для хондрогенной дифференцировки проводили каждые 3–4 дня на протяжении 10 суток, а затем на протяжении 12 суток использовали среду для стан- дартной остеогенной дифференцировки. Контролем культур служили клетки, которые культивировали в аналогичных условиях, однако без добавления компо- нентов для дифференцировки. Во время культивиро- вания и направленного дифференцирования клетки находились в инкубаторе при температуре 37°С, 5% СО2 и увлажненной атмосфере. Для цитохимического исследования остеогенной дифференцировки клеток по истечении срока диффе- ренцирования культуры клеток фиксировали в 2%-м параформальдегиде. Для выявления депозитов каль- ция фиксированные монослои клеток окрашивали по методу von Kossa [4]. Проведенные исследования позволили получить следующие результаты. Из подкожной жировой ткани были получены адгезивные клетки фибробластопо- добной морфологии с высокой пролиферативной ак- тивностью. Они экспрессировали CD44, CD90 на вы- соких уровнях (98 и 96% соответственно), для CD73 и CD34 уровень экспрессии был ниже (25 и 15% соответственно), а CD45 и CD117 экспрессировались на минимальных уровнях (3 и 3,5% соответственно) (рис. 1). used during 12 days. The controls were the cells cultured in the same conditions but without the components for differentiation. During culturing and directed differen- tiation the cells were in incubator at 37°C, 5% CO2 and humid atmosphere. To perform cytochemical analysis of cell osteogenic differentiation the cell cultures were fixed in 2% parafor- maldehyde after termination of differentiation. To reveal the deposits of calcium the fixed cell monolayers were stained by von Kossa [4]. The performed investigations allowed to obtain the following results. Adhesive cells of fibroblast-like mor- phology with a high proliferative activity could be derived from subdermal adipose tissue. They expressed CD44, CD90 at high levels (98 and 96%, respectively), CD73 and CD34 expression level was lower (25 and 15%, respectively), and CD45 and CD117 were expressed at the minimal levels (3 and 3.5%, respectively) (Fig. 1). After the change of culture medium for the medium for differentiation there was noted the change of cell morphology from spindle-like to polygonal one, and at the later terms of differentiation the cell boundaries could be hardly revealed. In the control cultures the cell morphology did not change significantly, but there was the increase of cell density that led to the exfoliation of monolayer in some wells. Staining of cells according von Kossa did not revealed any stained elements in the experiment with standard method of differentiation (Fig. 2A), however in the wells with stepwise differentiation of cells we observed silver stained black calcium deposits (Fig. 2, B). Рис. 1. Гистограммы иммунофенотипирования мультипотентных клеток жировой ткани мышей на 2-м (А–F) и 3-м (G–L) пассажах. Контурная линия – изотип-контроль, окрашенный график – уровень флуоресценции окрашенных антителами клеток. Fig. 1. Histograms for immunophenotyping of mice adipose tissue multipotent cells at the 2nd (A–F) and the 3rd (G–L) passage. Contour line is an isotype-control, stained diagram is the fluorescence level of the cells stained with antibodies. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 П ас са ж 3 Pa ss ag e 3 П ас са ж 2 Pa ss ag e 2 164 После замены культуральной среды на среду для дифференцировки было от- мечено изменение морфологии клеток из веретеноподобной на полигональную, а на поздних сроках дифференцировки границы клеток было невозможно оп- ределить. В контрольных культурах мор- фология клеток значительно не изменя- лась, но отмечалось увеличение плот- ности клеток, что по истечении 15–21 дня приводило к отслаиванию моно- слоя в некоторых лунках. Окрашивание клеток по методу von Kossa не дало результатов в эксперимен- те с использованием стандартной мето- дики дифференцирования (рис. 2, А), однако при поэтапной дифференциров- ке в лунках были отмечены депозиты кальция, окрашенные серебром в чер- ный цвет (рис. 2, B). Therefore we have successfully isolated multipotent cells from mice subcutaneous adipose tissue. The cells actively proliferated in vitro in standard culture con- ditions. Analysis of surface markers has shown that these cells expressed antigene set being standard for multi- potent stem cells. In vitro differentiation of AD MSCs in osteogenic lineage under standard protocol yielded no results, however, their preliminary chondrogenic in- duction enabled cells to deposit calcium in extracellular matrix. Литература 1. Danisovic L, Lesny P., Havlas V. et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells // J. Appl. Biomed. – 2007. – Vol. 5. – P. 139–150. 2. Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N- cadherin // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28, №3. – P. 564–572. 3. Li J., Mareddy S., Tan D.M., Crawford R. et al. А minimal com- mon osteochondrocytic differentiation medium for the osteo- genic and chondrogenic differentiation of bone marrow stromal cells in the construction of osteochondral graft // Tissue Engineering. – 2009. – Vol. 15, №9. – P. 2481–2490. 4. Lillie R.D., Fuller H.M. Histopathologic technic and practical histochemistry.– New York: McGraw-Hill, 1976. – 1024 p. 5. Nakahara M., Takagi M., Hattori T. et al. Effect of subcultivation of human bone marrow mesenchymal stem on their capacities for chondrogenesis, supporting hematopoiesis, and telomea length // Cytotechnology. – 2005. – Vol. 47, №1–3. – P. 19–27. 6. Taniguchi N., Yoshida K., Ito T. et al. Stage-specific secretion of HMGB1 in cartilage regulates endochondral ossification // Mol. Cell. Biol. – 2007. – Vol. 27, №16. – P. 5650–5663. Поступила 01.06.2012 Рис. 2. Окрашивание МСК ЖТ, дифференцированных в остеогенном направлении in vitro, окрашивание по методу von Kossa, ×100: А – с применением стандартного протокола дифференцировки; B – с при- менением предварительной хондроиндукции. Fig. 2. Staining of AD MSCs differentiated in osteogenic lineage in vitro by von Kossa, ×100: A – using standard protocol of differentiation; B – using preliminary chondroinduction. Таким образом, нами были успешно выделены мультипотентные клетки из подкожной жировой ткани мышей, которые активно пролиферировали in vitro при стандартных условиях культивирования. Анализ поверхностных маркеров показал, что эти клетки экспрессируют стандартный для мультипотентных ство- ловых клеток набор антигенов. Дифференцировка МСК ЖТ в остеогенном направлении in vitro с при- менением стандартного протокола не дала положи- тельных результатов, однако их предварительная хонд- рогенная индукция способствовала отложению клет- ками депозитов кальция во внеклеточном матриксе. References 1. Danisovic L, Lesny P., Havlas V. et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells // J. Appl. Biomed. – 2007. – Vol. 5. – P. 139–150. 2. Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N- cadherin // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28, N3. – P. 564–572. 3. Li J., Mareddy S., Tan D.M., Crawford R. et al. А minimal com- mon osteochondrocytic differentiation medium for the osteo- genic and chondrogenic differentiation of bone marrow stromal cells in the construction of osteochondral graft // Tissue Engineering. – 2009. – Vol. 15, N9. – P. 2481–2490. 4. Lillie R.D., Fuller H.M. Histopathologic technic and practical histochemistry.– New York: McGraw-Hill, 1976. – 1024 p. 5. Nakahara M., Takagi M., Hattori T. et al. Effect of subcultivation of human bone marrow mesenchymal stem on their capacities for chondrogenesis, supporting hematopoiesis, and telomea length // Cytotechnology. – 2005. – Vol. 47, N1–3. – P. 19–27. 6. Taniguchi N., Yoshida K., Ito T. et al. Stage-specific secretion of HMGB1 in cartilage regulates endochondral ossification // Mol. Cell. Biol. – 2007. – Vol. 27, N16. – P. 5650–5663. Accepted 01.06.2012 A B problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2

Поэтапная дифференцировка в остеогенном направлении мультипотентных клеток жировой ткани мышей

Institution

Ähnliche Einträge