Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2012
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2012
Назва видання:	Проблемы криобиологии
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68501
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г. // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 186-216. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-68501
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-685012014-09-26T03:01:55Z Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г. 2012 Article Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г. // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 186-216. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68501 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
format	Article
title	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.
spellingShingle	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г. Проблемы криобиологии
title_short	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.
title_full	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.
title_fullStr	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.
title_full_unstemmed	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г.
title_sort	тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "холод в биологии и медицине – 2012. актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". харьков, 22–24 мая 2012 г.
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2012
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68501
citation_txt	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых "Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии". Харьков, 22–24 мая 2012 г. // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 186-216. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии
first_indexed	2025-07-05T18:19:44Z
last_indexed	2025-07-05T18:19:44Z
_version_	1836832086762192896
fulltext	Тезисы 36-й ежегодной конференции молодых ученых «Холод в биологии и медицине – 2012. Актуальные проблемы криобиологии, трансплантологии и биотехнологии», 22–24 мая 2012, г. Харьков Кирилюк А.Л., Гурина Т.М. Температурные интервалы фазовых превращений в криозащитных средах и их роль в криоконсервировании клеточных суспензий на этапе нагрева..................................................................................................... Пахомов А.В., Гурина Т.М., Божок Г.А. Эффективность применения протоколов криоконсервирования с контро- лируемыми скоростями нагрева в температурных интервалах фазовых превращений для клеток интерстиция взрослых крыс............................................................................................................................................................................................................ Зайков В.С., Труфанова Н.А., Петренко Ю.А. Поиск подходов криоконсервирования мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных сферических носителей................................................................................................................... Порожан Е.А., Бабенко Н.Н., Останков М.В. Криоконсервирование как фактор управления структурно-функцио- нальным состоянием фетальных нервных клеток.............................................................................................................................. Венцковская Е.А. Сон в структуре ответа организма на различные виды холодовых воздействий....................................... Димитров А.Ю., Челомбитько О.В., Борисов П.А., Останков М.В. Анализ экспрессии гена ido в мезенхимальных стволовых клетках фетальной печени мышей после криоконсервирования.............................................................................. Борисов П.А., Димитров А.Ю., Челомбитько О.В. Влияние криоконсервирования на уровень экспрессии гена nanog в мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клетках фетальной печени мышей ранних сроков гестации....... Буцкий К.И., Марченко В.С. Изменение структурно-функционального состояния неокортекса хомяков при холодовой акклимации и зимней спячке.................................................................................................................................................................. Пуговкин А.Ю., Копейка Е.Ф. Фотометрический метод оценки качества спермы карпа.................................................... Красникова А.О., Зинченко А.В. Физические состояния водных растворов диметилацетамида и оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 при соотношении R = 1:2 ниже 0°C..................................................................... Челомбитько О.В., Сафранчук О.В., Бондарович Н.А., Останков М.В., Димитров А.Ю. Модификация характеристик клеток аденокарциномы Эрлиха под влиянием факторов криоконсервирования.................................................................. Сидоренко О.С., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. Экспрессия β-III тубулина в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят, полученной из криоконсервированных фрагментов ткани........................................................ Тамарина И.В., Божок Г.А. Влияние различных концентраций ДМСО и ЭТС в составе криозащитных сред на морфо- функциональные свойства клеток надпочечников новорожденных мышей........................................................................... Шевченко М.В. Гипотермическое хранение изолированных нервных клеток новорожденных крыс в средах различ- ного состава............................................................................................................................................................................................. Мединец Е.А., Кирошка В.В., Тищенко Ю.О., Бондаренко Т.П. Сохранность неонатальной овариальной ткани при гипотермическом хранении в зависимости от композиционного состава среды инкубации................................................ Говорова Ю.С., Зинченко А.В. Кинетический анализ плавления гемоглобина в присутствии оксиэтилированного производного глицерина......................................................................................................................................................................... Рогульская Е.Ю., Ревенко Е.Б., Петренко Ю.А. Дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в условиях подавления и стимуляции пролиферации....................................................................................... Борисенко І.Г. Вплив пептидного комплексу шкіри поросят на метаболічну активність фібробластів у культурі.......... Горячая И.П. Исследование реакции делящихся клеток на оксидативный стресс методом хемилюминесценции............ Говор И.В. Исследование реакции гепатоцитов на оксидативный стресс с помощью метода хемилюминесценции......... Бабинец О.М., Высеканцев И.П., Марценюк В.Ф. Технология получения криоконсервированных препаратов пробио- тиков, иммобилизованных на энтеросорбентах............................................................................................................................. Рогоза Л.А. Склад екстрактів кріоконсервованих фрагментів серця свиней та поросят і їх вплив на організм щурів....... Шканд Т.В., Чиж Н.А. Применение альгинатных гидрогелей для замедленной эжекции пептидов сердца поросят в жидкую фазу............................................................................................................................................................................................. Прокопюк В.Ю., Прокопюк О.С. Механизмы влияния криоконсервированных препаратов плаценты на репро- дуктивную функцию в периоде позднего онтогенеза..................................................................................................................... Бабаева А.Г., Чиж Н.А. Влияние экстрактов селезенки и сердца на миокард............................................................................. Кравченко М.А., Сафранчук О.В., Челомбитько О.В. Иммунокорригирующая активность криоэкстракта липидов плаценты в отношении пула CD4+CD25+ Т-клеток крыс при адъювантном артрите............................................................. 186 problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 187 Кожина О.Ю., Порожан Е.А. Роль моноцитарно-фагоцитарной системы в формировании противовирусной резис- тентности после введения компонентов криоконсервированного лейкоконцентрата кордовой крови................................ Ямпольская Е.Е., Шатнева О. М., Бондарович Н. А. Исследование молекулярных механизмов апоптотических про- цессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после применения криоконсервированных клеток фетальной печени............................................................................................................................ Abstracts of the 36th Annual Conference of Young Scientists ‘Cold in Biology and Medicine 2012. Current Problems in Cryobiology, Transplantology and Biotechnology’ May, 22–24th, 2012, Kharkov, Ukraine Kirilyuk A.L., Gurina T.M. Temperature Intervals of Phase Transformations in Cryoprotective Media and Their Role in Cryopreservation of Cell Suspensions at Heating Stage....................................... ............................................................................... Pakhomov A.V. , Gurina T.M., Bozhok G.A. Efficiency of Applying Cryopreservation Protocols with Controlled Heating Rates within Temperature Intervals of Phase Transitions for Adult Rat Interstitial Testicular Cells.............................................. ZaykovV.S., TrufanovaN.A., Petrenko Yu.A. Searching the Approach to Cryopreserve Mesenchymal Stromal Cells Inside Alginate Spherical Carriers......................................................................................................................................................................... Porozhan Ye.A., Babenko N.N., Ostankov M.V. Cryopreservation as Factor Controlling Structural and Functional State of Fetal Neuronal Cells....................................................................................................................................................................................... Ventskovskaya E.A. Sleep in Structure of Organism Response to Different Cold Effects................................................................... Dimitrov A.Yu., Chelombitko O.V., Borisov P.A., Ostankov M.V. Analysis of ido Gene Expression in Mesenchymal Stem Cells of Mice Fetal Liver after Cryopreservation.................................................................................................................................... Borisov P.A., Dimitrov A.Yu., Chelombitko O.V. Effect of Cryopreservation on nanog Gene Expression in Mouse Fetal Liver Mesenchymal and Hemopoietic Stem Cells of Early Gestation Terms....................................................................................... Butsky K.I., Marchenko V.S. Change of Structural-Functional State of Hamster Neocortex During Cold Acclimaton and Hibernation................................................................................................................................................................................................. Pugovkin A.Yu., Kopeyka E.F. Photometric Method for Assessing Quality of Carp Sperm.......................................................... Krasnikova A.O., Zinchenko A.V. Physical States of Aqueous Solutions of Dimethylacetamide and Oxyethylated Glycerol with Polymerization Degree n = 5 at R = 1:2 Ratio below 0°C................................................................................................................ Chelombitko O.V., Safranchuk O.V., Bondarovich N.A., Ostankov M.V., A.Yu. Dimitrov Modification of Ehrlich Carcinoma Cell Properties under Effect of Cryopreservation Factors....................................................................................................................... Sidorenko O.S., Bozhok G.A., Legach E.I., Bondarenko T.P. Expression of β-III-Tubulin in Adrenal Cell Culture of Newborn Piglets Derived from Cryopreserved Tissue Fragments........................................................................................................................ Tamarina I.V., Bozhok G.A. Effect of Different DMSO and FBS Concentrations in Cryoprotective Media on Morphofunctional Properties of Adrenal Cells of Newborn Mice....................................................................................................................................... Shevchenko M.V. Hypothermic Storage of Isolated Nerve Cells of Newborn Rats in Different Composition Media.................... Medinets E.A., Kiroshka V.V., Tischenko Yu.O., Bondarenko T.P. Preservation of Neonatal Ovarian Tissue during Hypothermic Storage Depending on Incubation Medium Composition............................................................................................ Govorova Yu.S., Zinchenko A.V. Kinetic Analysis of Hemoglobin Melting in Presence of Oxyethylated Glycerol...................... Govor I.V. Study of Hepatocyte Response to Oxidative Stress by Chemiluminescence Method................................................ Rogulska O.Yu., Revenko O.B., Petrenko Yu.O. Differentiation of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal Cells under Suppression and Stimulation of Proliferation.................................................................................................................... problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 215 216 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 cold biology medicine current problems in cryobiology, transplantology and biotechnology 188 problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Borisenko I.G. Effect of Peptide Complex of Piglet Skin on Metabolic Activity of Fibroblasts in Culture................................. Goryachaya I.P. Study of Dividing Cells Response to Oxidative Stress by Chemiluminescence Method.............................. Babinets O.M., Vysekantsev I.P., Martsenyuk V.F. Method of Obtaining Cryopreserved Preparations of Probiotics Immobi- lized on Enterosorbents........................................................................................................................................................................ Rogoza L.A.Composition of Extracts of Cryopreserved Pig and Piglet Heart Fragments and Their Effect on Rats......................... Shkand T.V., Chizh N.A. Use of Alginate Hydrogels for Slow Ejection of Pig Heart Peptides into Liquid...................................... Prokopyuk V.Yu., Prokopyuk O.S. Mechanisms of Cryopreserved Placental Preparation Effect on Reproductive Function in Late Ontogenesis.................................................................................................................................................................................. Babayeva A.G., Chizh N.A. Effect of Spleen and Heart Extracts on Myocardium............................................................................. Kravchenko M.A. , Safranchuk O.V. , Chelombitko O.V. Immunocorrecting Activity of Placental Lipids Cryoextract in Relation to Pool of CD4+CD25+ T-Cells in Rats with Adjuvant Arthritis........................................................................................... Kozhyna O.Yu., Porozhan E.A. Role of Monocyte-Phagocytic System in Formation of Antiviral Resistance after Introduction of Cryopreserved Cord Blood Leukoconcentrate Components...................................................................................................... Yampolskaya E.Ye., Shatneva O.M., Bondarovich N.A. Investigation of Molecular Mechanisms of Apoptotic Processes in Cells of Monocyte-Phagocyte System during Development of Adjuvant Arthritis after Application of Fetal Liver Cells.............................................................................................................................................................................................................. 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 Температурные интервалы фазовых превращений в криозащитных средах и их роль в криоконсервировании клеточных суспензий на этапе нагрева А.Л. КИРИЛЮК, Т.М. ГУРИНА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Temperature Intervals of Phase Transformations in Cryoprotective Media and Their Role in Cryopreservation of Cell Suspensions at Heating Stage A.L. KIRILYUK, T.M. GURINA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 189 Криоконсервирование в настоящее время широко используется для долгосрочного хранения биомате- риала. Разнообразие биообъектов, отличающихся ин- дивидуальными особенностями строения и различной резистентностью к низким температурам, не позволяет создать универсальную процедуру криоконсервиро- вания. При этом актуальной задачей является унифи- кация отдельных этапов криоконсервирования путем определения оптимальных скоростей охлаждения-нагре- ва в процессе замораживания-оттаивания. Регулирова- ние этих скоростей в определенных температурных ин- тервалах дает возможность контролировать кинетику фа- зовых превращений и нивелировать их негативный вклад в повреждения клеток. На этапе нагрева к таким фазовым превращениям относятся расстеклование, плавление смеси эвтектической концентрации, плавление основной массы льда, а также рекристаллизация перед соответст- вующими процессами плавления. В последнее время в литературных источниках в про- токолах криоконсервирования используют контролируе- мые скорости охлаждения. В то же время режим оттаива- ния происходит традиционным способом – на водяной бане. Ранее в наших работах [Гурина Т.М., 2011] было показано преимущество использования контролируе- мых скоростей охлаждения в температурных интервалах фазовых превращений на этапе замораживания. Цель данной работы – показать возможность использования контролируемых скоростей на этапе нагрева. Темпера- турные интервалы фазовых превращений, протекающих в криозащитных средах, определяли по эксперимен- тальным термопластическим кривым (ТПД-кривые). С целью выявления вклада фазовых превращений, соот- ветствующих каждому компоненту криозащитной сре- ды, исследовали ТПД-кривые для дистиллированной воды, физиологического раствора, культуральных сред и соответствующих растворов криопротекторов. Сфор- мулированы общие принципы выбора внешнего дефор- мирующего напряжения для определения рассматри- ваемых температурных интервалов и их предельные значения для криозащитных сред. В целях практической апробации определены иссле- дуемые температурные интервалы для криозащитного раствора (10% раствор ДМСО на среде 199 с 20 мМ He- pes), используемого для криоконсервирования клеток интерстиция тестисов взрослых крыс, а именно: рекрис- таллизация перед эвтектическим плавлением раствора криопротектора (–97…–89)°С и соответствующее плав- ление (–89…–67)°С; рекристаллизация перед плавлением эвтектики среды 199 (–45…–37)°С и плавление (–37… –21)°С; рекристаллизация перед плавлением основной массы льда (–21…–15)°С и плавление (–15…–6)°С. Предложенная методика имеет универсальный ха- рактер и может быть использована для любых растворов криопротекторов, приготовленных как на дистиллиро- ванной воде, так и на культуральных средах. Today cryopreservation is widely used for long-term storage of biological material. Variety of bioobjects differing by individual features of structure and various resistance to low temperatures does not allow the development of uni- fied cryopreservation procedure. Herewith an actual task is unification of some cryopreservation stages by means of determining the optimal cooling-warming rates during freeze-thawing. Controlling these rates within certain tempe- rature intervals provides the possibility to regulate the ki- netics of phase transformations and neutralize their negative contribution into cell damage. At the stage of warming these phase transformations include devitrification, melting of mix- ture of eutectic concentration, melting of ice bulk as well as re-crystallization prior to corresponding melting processes are referred. Currently the cryopreservation protocols involve usual- ly the controlled cooling rates. At the same time the thawing is performed in traditional way, i.e. in water bath. Previously we have shown [Gurina T.M., 2011] the advantage of using the controlled cooling rates within the temperature intervals of phase transformations at freezing stage. The aim of this research was to show the possibility of using the controlled rates at the warming stage. Temperature intervals of phase transformations occuring in cryoprotective media were determined from experimental thermoplastic curves. To reveal the contribution of phase transformations corresponding to each component of cryoprotective medium there were examined the thermoplastic curves for distilled water, phy- siological solution, culture media and corresponding solu- tions of cryoprotectants. There were formulated the general principles of selection of external deforming tension to determine the considered temperature intervals and their limit values for cryoprotective media. For practical approbation there were determined the mentioned temperature intervals for cryoprotective solution (10% DMSO solution on the base of medium 199 with 20 mM Hepes) used for cryopreservation of adult rat testicular interstitial cells, namely: re-crystallization prior to eutectic melting of cryoprotectant solution (–97…–89)°C and corres- ponding melting (–89…–67)°C; re-crystallization prior to melting of medium 199 eutectics (–47…–37)°C and melting (–37…–21)°C, re-crystallization prior to melting of ice bulk (–21…–15)°C and melting (–15…–6)°C. Proposed methods are universal and may be used for any cryoprotectant solutions prepared both on the base of distilled water or culture media. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Эффективность применения протоколов криоконсервирования с контролируемыми скоростями нагрева в температурных интервалах фазовых превращений для клеток интерстиция взрослых крыс А.В. ПАХОМОВ, Т.М. ГУРИНА, Г.А. БОЖОК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Efficiency of Applying Cryopreservation Protocols with Controlled Heating Rates within Temperature Intervals of Phase Transitions for Adult Rat Interstitial Testicular Cells A.V. PAKHOMOV, T.M. GURINA, G.A. BOZHOK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 190 Изучение влияния отдельных факторов криоконсер- вирования на жизнеспособность клеточной суспензии и сохранность функциональной способности стероидо- генных клеток может способствовать разработке режи- мов замораживания-оттаивания, позволяющих макси- мально сохранить гормонопродуцирующую составляю- щую тестисов – клеток Лейдига. При разработке прото- колов замораживания-оттаивания биообъектов, как правило, основное внимание уделяется режиму охлажде- ния, в то время выживаемость биообъектов может зави- сеть как от скоростей охлаждения, так и нагрева. Цель данной работы – исследовать эффективность применения протоколов криоконсервирования с контро- лируемыми скоростями охлаждения-нагрева в темпера- турных интервалах фазовых превращений на этапе оттаивания. Образцы замораживали по разработанным ранее [Гурина Т.М., 2007] режимам с контролируемыми скоростями охлаждения. Оттаивание образцов осущест- вляли в программном замораживателе, комбинируя высокие (20 град/мин) и низкие (1 град/мин) скорости нагрева в указанных температурных интервалах. В ка- честве контроля использовали оттаивание образцов на водяной бане (40°С). При анализе результатов определяли сохранность клеток как соотношение количества клеток до и после замораживания-отогрева, а также количество клеток с неповрежденной клеточной мембраной в зави- симости от вариаций скорости нагрева в температурных интервалах плавления основной массы льда, плавления смеси эвтектической концентрации раствора криопро- тектора, плавления эвтектики составляющих культураль- ной среды, а также рекристаллизации перед соответст- вующими процессами плавления. Впервые разработан протокол криоконсервирования клеток интерстиция тестисов, в котором благодаря ис- пользованию контролируемых скоростей нагрева в тем- пературных интервалах фазовых превращений получены высокие показатели сохранности и функциональной активности клеток в суспензии (56,7%) и сохранности популяции клеток Лейдига (78,7%). На примере клеток интерстиция показана возмож- ность создания единого протокола замораживания- оттаивания с контролируемыми скоростями в темпера- турных интервалах фазовых превращений с использо- ванием программных замораживателей, который спо- собствует максимальной сохранности клеток. Предло- женная методика имеет универсальный характер и может быть использована вне зависимости от вида биообъекта и состава криозащитной среды для криоконсервирова- ния различных видов клеток. Работа выполнена при поддержке ДФФД (проект № GP/F44/127) Studying the effect of particular cryopreservation factors on viability of cell suspension and keeping a functional ability of steroidogenic cells could contribute to develop- ment of freeze-thawing protocols, allowing maximum preser- vation of hormone-producing component of testes, Leydig cells. When developing the protocols to freeze-thaw bio- objects as a rule the main attention is paid to cooling regimen, meanwhile the survival of the biological objects could de- pend on both cooling and heating rates. The research aim was to study the efficiency of appli- cation of cryopreservation protocols with controlled cool- ing-heating rates within temperature intervals of phase tran- sitions at the stage of thawing. The samples were frozen according to previously developed regimens with controlled cooling rates [Gurina T.M., 2007]. The samples were thawed in a programmable freezer by means of combination of high (20 deg/min) and low (1 deg/min) heating rates within the mentioned temperature intervals. As the control there was used thawing of the samples in water bath (40°C). Analysis of the results included the assessment of the post-thaw cell survival as the ratio between cell number prior to and after freeze-thawing, as well as the quantity of cells with non- damaged plasma membrane in dependence of variation of heating rate within temperature intervals for melting of bulk of ice, melting of mixture of cryoprotectant solution of eutectic concentration, melting of culture medium compo- nents eutectics, as well as re-crystallization prior to corres- ponding melting processes. For the first we developed the protocol for cryopreserva- tion of testes interstitial cells, which due to the use of control- led rates of heating within the temperature intervals of phase transitions allowed to obtain high indices of survival and functional activity of general cell population (56.7%), and survival of Leydig cells (78.7%) in particular. The possibility of development of unified protocol for freeze-thawing with controlled rates within temperature intervals of phase transitions using programmable freezers, which contributes to maximum preservation of cells has been shown on example of interstitial cells. The proposed methods are universal and could be used independently of the bioobject type and composition of cryoprotective me- dium for cryopreservation of different cell types. The study was supperted by Ukrainian Foundation for Fundamental Research (grant Nr. GP/F44/127). problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Поиск подходов криоконсервирования мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных сферических носителей В.С. ЗАЙКОВ, Н.А. ТРУФАНОВА, Ю.А. ПЕТРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Searching the Approach to Cryopreserve Mesenchymal Stromal Cells Inside Alginate Spherical Carriers V.S. ZAYKOV, N.A. TRUFANOVA, YU.A. PETRENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 191 Криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в составе трехмерных носителей является актуальной задачей современной криобиологии и тка- невой инженерии. В данной работе изучали влияние криоконсервиро- вания путем медленного замораживания и витрифика- ции на жизнеспособность и метаболическую активность МСК человека, инкапсулированных (иМСК) в альгинат- ные сферические носители. Для инкапсуляции МСК смешивали с 1,2% альгината натрия, после чего покапельно вносили в раствор CaCl2. Размер полученных капсул составлял 1,2–1,5 мм. При криоконсервировании иМСК использовали два подхода: 1. «Общепринятый» подход, включавший медленное (1 град/мин) охлаждение образцов под защитой 10% ДМСО и 20% эмбриональной сыворотки до –-80°С и по- следующее погружение в жидкий азот. 2. Витрификация под защитой растворов криопротек- торов ДЭПС (ДМСО, этиленгликоль (ЭГ), 1,2-пропандиол (ПД) и сахароза), путем прямого погружения образцов в жидкий азот. Жизнеспособность и метаболическую активность иМСК до и после криоконсервирования оценивали с по- мощью редокс-индикаторов МТТ и Alamar Blue (АВ). Жизнеспособность иМСК после криоконсервирования с использованием «общепринятого» подхода составляла около 80%, метаболическая активность клеток, оцененная с помощью АВ-теста, – 70%. Витрификацию иМСК осуществляли в растворе ДЭПС-1, состоящим из 10% ДМСО, 20% ЭГ, 20% ПД, 0,5 М сахарозы. В случае двухэтапной экспозиции (2 мин 30 с в 50%-м и 30 с в 100%-м растворе) жизнеспособность и метаболическая активность клеток после девитрифика- ции падали до 25 и 28% соответственно. Отказ от пер- вого этапа экспозиции клеток в 50% ДЭПС-1 и одновре- менное увеличение времени экспозиции иМСК в 100% растворе до 5 мин позволяли повысить показатели жизне- способности клеток до 75%. Увеличение концентрации ЭГ в составе раствора ДЭПС до 30–45% повышало жиз- неспособность иМСК после девитрификации до 80%. Таким образом, результаты работы свидетельствуют о перспективности использования витрификации в ка- честве альтернативного подхода криоконсервирования МСК в составе альгинатных сферических носителей. Cryopreservation of mesenchymal stromal cells (MSCs) inside of 3D carriers is an actual task of current cryobiology and tissue engineering. In this work we studied the effect of cryopreservation using slow freezing or vitrification on viability and metabolic activity of human MSCs encapsulated (eMSCs) in alginate spherical carriers. For encapsulation the MSCs were mixed with 1.2% so- dium alginate and afterwards introduced dropwise into CaCl2 solution. The size of the resulted capsules made 1.2–1.5 mm. During cryopreservation of eMSCs we used two approa- ches: 1. ‘Traditional’ method comprised slow (1 deg/min) cooling of the samples under 10% DMSO protection and 20% fetal serum down to –80°C and the following plunging into liquid nitrogen. 2. Vitrification performed under protection of the solu- tions of DEPS cryoprotectant solutions (DMSO, ethylene glycol (EG), 1,2-propane diol (PD) and sucrose) by means of direct plunging of the samples into liquid nitrogen. Viability and metabolic activity of eMSCs prior to and after cryopreservation were assessed using redox-indicators MTT and Alamar Blue (AB). Viability of eMSCs after cryo- preservation using ‘traditional’ approach made about 80% and metabolic activity of cells according to AB test was 70%. Vitrification of eMSCs was carried-out using DEPS-1 solution, containing 10% DMSO, 20% EG, 20% PD, 0.5 M sucrose. In case of two-stage exposure (2 min 30 s in 50% solution and 30 s in 100% solution) the viability and meta- bolic activity of cells after devitrification felt down to 25 and 28%, correspondingly. Waiving the first stage of cell exposure in 50% DEPS-1 and simultaneous increase of pe- riod of eMSCs exposure in 100% solution up to 5 min allowed to rise the cell viability indices up to 75%. Rise in the concent- ration of EG as a component of DEPS-1 solution up to 30– 45% led to the increase in the viability of eMSCs after devitri- fication up to 80%. Thus the research results testify to a perspective of using vitrification as an alternative approach to cryopre- serve MSCs inside alginate spherical carriers. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Криоконсервирование как фактор управления структурно-функциональным состоянием фетальных нервных клеток Е.А. ПОРОЖАН, Н.Н. БАБЕНКО, М.В. ОСТАНКОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Cryopreservation as Factor Controlling Structural and Functional State of Fetal Neuronal Cells YE.A. POROZHAN, N.N. BABENKO, M.V. OSTANKOV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 192 Реализация механизмов действия фетальных нервных клеток (ФНК) определяется структурно-функциональ- ными особенностями этих клеток [Skardelly M. et al., 2011; Гольцев А.Н. и др., 2011]. Изменение как популяционного состава ФНК, так и их адгезивных свойств после криокон- сервирования непосредственно будет определять функ- циональный потенциал этих клеток. Цель исследования – определение фенотипических характеристик и адгезивных свойств гетерогенной по- пуляции ФНК, криоконсервированных с использованием разных режимов охлаждения. Материалом для исследования служили ФНК белых беспородных крыс 11 суток гестации, криоконсервиро- ванные по трем режимам: Р1 [Грищенко В.И. и др., 2004], Р2 [Redmond D.E. Jr. et al., 1988], Р3 [Гольцев А.Н. и др., 2011]. Субпопуляционный состав ФНК исследовали ме- тодом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител к CD133, nestin, β-tubulin, GFAP (ВD, США). Адгезивный потенциал ФНК до и после крио- консервирования оценивали в системе in vitro при куль- тивировании в среде DMEM/F12 с добавлением 10% фе- тальной телячьей сыворотки в чашках Петри, поверх- ность которых была покрыта белками внеклеточного мат- рикса, обеспечивающими преимущественное прикреп- ление нейрональных элементов (BioCoat Поли-D-лизин/ Ламинин; BD), глиальных клеток (BioCoat Ламинин/Фиб- ронектин; BD). Оценку функционального потенциала стволовых клеток проводили в условиях бессывороточ- ной питательной среды с добавлением митогенов. Проведенные исследования показали, что Р1 способ- ствовал увеличению содержания всех исследуемых суб- популяций ФНК, Р2 – преимущественно глиальных кле- ток (GFAP+); Р3 – стволовых клеток (CD133+ и nestin+) на фоне гибели продвинутых в дифференцировке нейро- нальных предшественников (β-tubulin+). Оценка адгезив- ного потенциала ФНК показала, что используемые ре- жимы замораживания в различной степени модифици- руют экспансию молекул адгезии на ФНК: от стимуляции до ингибирования. Установлена временная задержка появления нейросфер на 1–2 суток вне зависимости от используемого режима криоконсервирования, при этом количество сформированных нейросфер определялось условиями замораживания. Таким образом, низкотемпературное консервирова- ние может рассматриваться как метод модификации структурно-функционального состояния биообъекта, а значит – терапевтического потенциала ФНК. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Realization of mechanism of fetal neuronal cells (FNCs) action is determined by structural and functional peculiarities of these cells [Skardelly M. et al., 2011; Goltsev A.N. et al., 2011]. Changes in both population composition of FNCs and their adhesive properties after cryopreservation will di- rectly determine their functional potential. The research aim was to examine the phenotype charac- teristics and adhesive properties of heterogenic population of FNCs cryopreserved according to different cooling regi- mens. The research was performed in FNCs of white outbred rat fetuses of the 11th gestation day, cryopreserved accor- ding to three regimens: R1 [Grischenko V.I. et al., 2004], R2 [Redmond D.E. Jr. et al., 1988], R3 [Goltsev A.N. et al., 2011]. Subpopulation composition of FNCs was studied by flow cytometry using monoclonal antibodies to CD133, nestin, β-tubulin, GFAP (BD, USA). Adhesive potential of FNCs prior to and after cryopreservation was assessed in vitro during culturing in DMEM-12/F12 supplemented with 10% fetal calf serum in Petri dishes, which surface was coated with the proteins of extracellular matrix, providing the pre- dominant adherence of neuronal elements (BD, BioCoat Poly-D-lysine/Laminin), glial cells (BD, BioCoat Laminin/ Fibronectin). Functional potential of stem cells was estima- ted under conditions of serum-free nutritive medium sup- plemented with mitogens. The performed studies have shown that R1 contributed to an increased content of all the studied subpopulations of FNCs, R2 did predominantly to glial cells (GFAP+); R3 resulted in enrichment with stem cells (CD133+ and nestin+) on the background of death of the more differentiated neu- ronal progenitors (β-tubulin+). The assessment of adhesive potential of FNCs has shown that the applied freezing regimens modify the expansion of adhesion molecules in FNCs in a different extent: either stimulation or inhibiting. There was found a time delay by 1–2 days in appearance of neurospheres independently on the used cryopreservation regimen, thereat the quantity of the formed neurospheres was determined by freezing conditions. Thus low temperature preservation may be considered as the method of modifying the structural and functional state of biological object, allowing to control the therapeutic potential of FNCs. Сон в структуре ответа организма на различные виды холодовых воздействий Е.А. ВЕНЦКОВСКАЯ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Sleep in Structure of Organism Response to Different Cold Effects E.A. VENTSKOVSKAYA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 193 Холод, активируя систему терморегуляции, запускает как автономные, так и поведенческие механизмы, на- правленные на изменение уровня продукции и отдачи тепла. Если метаболические, циркуляторные и гормо- нальные ответы организма на холодовые воздействия хорошо изучены, то многие физиологические проявле- ния этих изменений и в частности изменения сна – изуче- ны недостаточно. Цель работы – изучить влияние различных видов холодовых воздействий, отличающихся уровнем актива- ции тиреоидной системы на адаптационные способнос- ти и цикл сон-бодрствование крыс. Эксперименты одобрены Комитетом по биоэтике при ИПКиК НАН Украины и проведены на крысах-сам- цах линии Вистар. Изучены разные виды воздействий, отличающихся длительностью и кратностью влияния хо- лодового фактора, уровнем активации тиреоидной сис- темы: длительное холодовое воздействие (ДХВ) осущест- влялось содержанием животных при 4°С в течение 30– 40 дней; ритмические (РХВ) – животных подвергали в течение 2-х дней 2-м сериям из 9 охлаждений по 15 мин при –12°С (РХВ1) или 10°С (РХВ2) с интервалами по 45 мин при 23°С. В сыворотке крови измеряли концентрацию тиреоидных гормонов и конечных продуктов обмена ок- сида азота. Адаптационные способности оценивали в тесте вынужденного плавания в холодной воде. Измене- ния цикла бодрствование-сон анализировали по обще- принятым критериям. Во всех случаях холодовые воздействия приводили к формированию акклимации, выражающейся или в уве- личении времени пребывания животных в холодной воде за счет доминирования пассивных форм поведения или повышении устойчивости температуры тела. При этом уровень активации тиреоидной системы, являющейся ведущей в метаболическом обеспечении процессов хо- лодовой акклимации, уменьшался от ДХВ к РХВ1 и был минимальным при РХВ2. Холодовые воздействия приво- дили к изменению глубины и длительности сна: ДХВ увеличивали глубину и длительность как медленновол- нового сна (МВС), так и парадоксального (ПС); РХВ1 – к увеличению длительности только ПС; РХВ2 – длительнос- ти МВС. При РХВ отмечалось изменение концентрации конечных продуктов обмена оксида азота в сыворотке крови, значительное их повышение наблюдалось при РХВ2. Таким образом, холодовые воздействия, повышая адаптационные способности организма, в разной сте- пени активируют тиреоидную систему. Изменения сна при этом могут отражать глубину вовлечения системы терморегуляции в процесс нормализации темпера- турного гомеостаза, а концентрация конечных продуктов обмена оксида азота в крови определяет ее направлен- ность. Cold activates the system of thermoregulation and thereby triggers both autonomous and behavioral mecha- nisms directed to the change in the level of heat production and rejection. Meanwhile metabolic, circulatory and hormo- nal responses of an organism to cold effects have been well studied,many physiological manifestations of these changes and in particular the one in sleep have been insufficiently investigated. The research aim was to study the effect of different kinds of cold effects differing by the level of activation of thyroid system on adaptation abilities and sleep-wake cycle in rats. The experiments approved by the Committee in Bioethics at the IPC&C of the National Academy of Sciences of Ukraine were carried-out in Wistar male rats. There were studied different types of effects altering by the duration and repetition of cold effect, level of thyroid system activa- tion: long-term cold effect (LTCE) was caused by maintaining the animals at 4°C for 30–40 days: rhythmic cold effects (RCE) were performed by subjection of the animals to 2 ses- sions of nine 15-min-long coolings during 2 days at –12°C (RCE1) or 10°C (RCE) with 45-min-long pauses at 23°C. In blood serum there was measured the concentration of thy- roid hormones and final products of nitrogen oxide exchange. Adaptation abilities were tested using test of forced swim- ming in cold water.The changes in sleep-wake were analyzed according to standard criteria. In all the cases the cold effects resulted in the formation of acclimation manifested in either increased time of animals staying in cold water due to dominating passive forms of behavior or in the enhanced resistance of body temperature. Herewith the level of activation of thyroid system, being the leading one in metabolic provision of cold acclimation processes, reduced from LTCE to RCE1 and was minimal at RCE2. Cold effects led to the altered depth and duration of sleep: LTCE increased the depth and duration both of slow wave sleep (SWS) and paradoxical sleep (PS); RCE1 raised the duration only of PS, and RCE2 did the duration of SWS. At RCE there was found the change in concentration of final metabolic products of nitrogen oxide in blood serum, their significant rise was observed at RCE2. Thus the cold effects activate thyroid system in a diffe- rent extent by increasing the adaptation capabilities of an organism. The change in sleep thereat can reflect the depth of involving the thermoregulation system into normalization of temperature homeostasis, and concentration of final products of nitrogen oxide metabolism in blood determines its orientation. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Анализ экспрессии гена ido в мезенхимальных стволовых клетках фетальной печени мышей после криоконсервирования А.Ю. ДИМИТРОВ, О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО, П.А. БОРИСОВ, М.В. ОСТАНКОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Analysis of ido Gene Expression in Mesenchymal Stem Cells of Mice Fetal Liver after Cryopreservation A.YU. DIMITROV, O.V. CHELOMBITKO, P.A. BORISOV, M.V. OSTANKOV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 194 Due to presence of mesenchymal stem cells (MSC) with a unique immunomodulating activity the fetal liver (FL) have taken a key place in cell therapy of autoimmune diseases (AID). One of the mechanisms of MSC effect on recipient’s immune cells is implemented through production of indo- leamine 2,3-dioxygenase. Of importance is that MSC content in FL of different gestation terms is different as well as their structural-functional state including the spectrum of pro- duced mediators affecting their immunomodulating pro- perties. Immunomodulating activity of FL MSC is shown to be changed after low-temperature exposure and could even exceed activity of native cells. Study of FL composition at different gestation terms and analysis of ido gene expres- sion level in native and cryopreserved material will enable its more effective application to treat AID. The research aim was to study comparatively the ido gene functional activity in FL MSC of different gestation terms after cryopreser- vation. Research objects were mice fetal liver cells (FLC) of the 14th and 18th gestation days. CD105+ fraction of FLC was ob- tained by immunomagnetic sorting with BD IMagnet (USA) and monoclonal antibodies (MAB) to the molecules CD105 (BD, USA). Isolated fraction was analyzed by flow cytometry with FACS Calibur (BD, USA) using MAB (BD Bioscience, USA) to the molecules CD105, CD73 and CD44. An adhesive potential was analyzed by standard methods [Sergeeva N.S., 2006]. For induction of osteogenic differentiation we carried out the culturing of isolated CD105+ cells according to [Grinchuk T.M., 2008]. FLC fraction was frozen under 10% DMSO protection using a programmable freezer UOP-6 (Spe- cial Design and Technical Bureau with Experimental Unit of the IPC&C of the National Academy of Sciences of Ukraine) with the cooling rate of 1 deg/min down to –25°C with the following plunging into liquid nitrogen. The samples were thawed on water bath at 40°C. Expression of ido gene in general FL cell suspension as well as the isolated with magnetic sorter CD105– and CD105+ fractions (MSC) prior to and after cryopreservation were determined by RT-PCR method with amplifier ANK-16 (Russia). We have shown that the most part of isolated CD105+ cells carried the markers of CD73 and CD44. Attestation of their functional activity in vitro allowed to refer them to MSC. With increasing a gestation term in the cells of FLC general pool and in isolated fractions the decrease of ido gene expression level was observed. The changes of ido gene expression level in FL MSC after cryopreservation ha- ve been established: MSC after cryopreservation were cha- racterized by higher content of ido transcripts. Благодаря содержанию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с уникальной иммуномодулирующей ак- тивностью фетальная печень (ФП) заняла ключевое место в клеточной терапии аутоиммунных заболеваний (АИЗ). Один из механизмов влияния МСК на иммунные клетки реципиента реализуется через продукцию индо- ламин 2,3-диоксигеназы. Существенно, что на разных этапах гестации ФП изменяется как содержание МСК в органе, так и их структурно-функциональный статус, в том числе спектр продуцируемых медиаторов, что не может не влиять на их иммуномодулирующие свойства. Установлено, что иммуномодулирующая активность МСК ФП изменяется после низкотемпературного воз- действия и может даже превышать активность нативных клеток. Изучение состава ФП на разных этапах гестации, а также анализ уровня экспрессии гена ido в нативном и криоконсервированном материале поможет более эффективно использовать его для лечения АИЗ. Цель исследования – сравнительное изучение функциональ- ной активности гена ido в МСК ФП разных сроков гес- тации после криоконсервирования. Объектом исследования были клетки фетальной пе- чени (КФП) мышей 14 и 18 суток гестации. Фракция CD105+ КФП была получена методом иммуномагнит- ной сортировки на BD IMagnet (BD, США) с использова- нием моноклональных антител (МАТ) к молекулам CD105 (BD, США). Анализ выделенной фракции проводили методом проточной цитометрии на FACS Calibur (BD, США) с использованием МАТ (BD Biosciences, США) к молекулам CD105, CD73 и CD44. Адгезивный потенциал анализировали по стандартным методам [Сергеева Н.С., 2006]. Для индукции остеогенного дифференцирования проводили культивирование выделенных CD105+ клеток по Т.М. Гринчуку (2008). Фракции КФП замораживали под защитой 10% ДМСО на программном заморажи- вателе УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины) со скоростью 1 град/мин до –25°С с последующим погру- жением в жидкий азот. Образцы отогревали на водяной бане при 40°С. Экспрессию гена ido в общей суспензии клеток ФП, а также в выделенных на магнитном сортере фракциях CD105– и CD105+ (МСК) до и после криоконсер- вирования определяли методом ПЦР-РВ на амплифи- каторе АНК-16 (Россия). Показано, что большая часть выделенных CD105+ клеток несет маркеры CD73 и CD44; аттестация функ- циональной активности в системе in vitro позволила от- нести их к МСК. По мере увеличения срока гестации в клетках общего пула КФП, а также в выделенных фракциях наблюдается снижение уровня экспрессии гена ido. Ус- тановлены изменения в степени экспрессии гена ido в МСК ФП после криоконсервирования: МСК после крио- консервирования характеризовались более высоким содержанием транскриптов ido. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 195 Влияние криоконсервирования на уровень экспрессии гена nanog в мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клетках фетальной печени мышей ранних сроков гестации П.А. БОРИСОВ, А.Ю. ДИМИТРОВ, О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Cryopreservation on nanog Gene Expression in Mouse Fetal Liver Mesenchymal and Hemopoietic Stem Cells of Early Gestation Terms P.A. BORISOV, A.YU. DIMITROV, O.V. CHELOMBITKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Биологический материал фетального происхождения широко используется в клеточной терапии. Мезенхи- мальные (МСК) и гемопоэтические (ГСК) стволовые клетки фетальной печени (КФП) положительно зареко- мендовали себя при лечении аутоиммунных заболе- ваний. Показано, что наибольшим потенциалом обла- дают клетки ранних сроков гестации, однако он умень- шается в процессе их дифференцировки, что связано со снижением уровня экспрессии stemness-генов, в част- ности гена nanog. Криоконсервирование позволяет не только сохранить биообъект, но и изменить его свойства, в том числе на геномном и постгеномном уровнях. Цель исследования – изучение влияния криоконсер- вирования на экспрессию гена nanog в субпопуляциях КФП (МСК и ГСК) мышей ранних сроков гестации. В эксперименте использовали КФП мышей линии С57BL. Клеточная суспензия была получена путем гомогенизации фетальной печени мышей 14-х суток гестации в среде 199. Фракции CD105+ (МСК) и CD117+ (ГСК) были выделены иммуномагнитным сортирова- нием с использованием соответствующих моноклональ- ных антител. КФП криоконсервировали под защитой 10% ДМСО в программном замораживателе со скоростью охлаждения 1 град/мин до –25°С с последующим погруже- нием в жидкий азот. Образцы отогревали на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию пропидий иодидом. Экспрессию гена nanog в выделенных субпопуляциях нативных и криокон- сервированных клеток оценивали методом ПЦР-РВ. Статистический анализ был выполнен в программе Ori- gin 6.0 с использованием t-теста Стьюдента. Криоконсервирование позволило сохранить 76,2 ± 2,8 и 88,0 ± 3,2% жизнеспособных МСК и ГСК соответст- венно. Уровень экспрессии nanog в субпопуляциях на- тивных и криоконсервированных стволовых клеток статистически отличался. Замораживание-оттаивание в разной степени снижало уровень экспрессии гена в МСК и ГСК, что может повлиять на терапевтический потен- циал КФП. Следовательно, влияние криоконсервирования на морфологическое и функциональное состояние хранящихся объектов требует дополнительных исследо- ваний, а особенно экспрессии генов, регулирующих плю- рипотентность стволовых клеток. Дальнейшие исследо- вания позволят оптимизировать протоколы криокон- сервирования фетального материала и повысить эффек- тивность клеточной терапии. Biological material of fetal origin is widely used in cell therapy. Mesenchymal (MSC) and hemopoietic (HSC) stem cells of fetal liver (FLC) render a positive effect when treating autoimmune diseases. It was shown, that the biggest poten- tial is presented by cells of early gestation, but it became lower during differentiation, that is associated with decrease of stemness-genes expression level, particularly nanog gene. Cryopreservation allows not only to preserve the biological object, but to change its properties at genome and postge- nome levels. The research aim was to study the cryopreservation ef- fects on nanog gene expression in FLC (MSC and HSC) subpopulations from mouse embryos of early gestation. FLC from С57BL mice were used in the experiment. Cell suspension was obtained by homogenization in medium 199 of mouse fetal liver of the 14th gestation day. CD105+ (МSC) and CD117+ (HSC) fractions were isolated by immu- nomagnetic sorting using corresponding monoclonal anti- bodies. FLC were cryopreserved under protection of 10% DMSO with a programmable freezer with 1 deg/min cooling rate down to –25°С with the following plunging into liquid nitrogen. The samples were thawed on water bath at 37°С. Cell viability was assessed by propidium iodide staining. Expression of nanog gene in isolated native and cryopreser- ved cell subpopulations was examined by qRT-PCR. Statis- tical analysis was performed by Origin 6.0 software using Student’s t-test. Cryopreservation enabled to preserve 76.2 ± 2.8% and 88.0 ± 3.2% of viable MSC and HSC, correspondingly. The level of nanog expression in subpopulations of native and cryopreserved stem cells was statistically different. The free- ze-thawing decreased the gene expression to different ex- tents in MSCs and HSCs, which may affect a therapeutic potential of FLCs. Consequently, cryopreservation effect on morphological and functional state of the stored objects requires additional research. Special attention should be paid to the cryopreservation effect on expression of genes regulating pluripotency of stem cells. Further studies will allow to optimize the protocols for cryopreservation of fetal material and increase efficiency of cell therapy. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 196 Изменение структурно-функционального состояния неокортекса хомяков при холодовой акклимации и зимней спячке К.И. БУЦКИЙ1,2, В.С. МАРЧЕНКО1 1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков 2Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина Change of Structural-Functional State of Hamster Neocortex During Cold Acclimaton and Hibernation K.I. BUTSKY1,2, V.S. MARCHENKO1 1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 2Kharkov National University, Kharkov, Ukraine Моделирование состояния искусственной гиберна- ции, близкой к естественной, у крупных млекопитающих и человека имеет огромное практическое значение. Од- нако установлено, что при зимней спячке существен- ным образом редуцируется дендритное древо нейро- нальной сети коры головного мозга и многих подкор- ковых структур, что может привести к потере памяти. Цель работы – комплексная оценка влияния гипотер- мии на структуру и функции головного мозга. В первой серии экспериментов изучали морфомет- рические характеристики нейронов коры головного мозга контрольных и опытных животных. Для оценки сложности нейрональной сети и отдельных нейронов гибернирующего мозга был применен фрактальный ана- лиз. Обнаружено, что структура дендритного древа су- щественно редуцируется при гибернации, полностью восстанавливаясь при пробуждении. Представлялось целесообразным выяснить, влияют ли данные структурные изменения на функциональную активность. Поэтому в следующей серии эксперимен- тов изучали влияние разных холодовых воздействий (циклическая и длительная акклимация) на выработку условного рефлекса у хомяков. Было показано, что пос- ле холодовых воздействий у хомяков повышается ско- рость реакции избегания на безусловный раздражитель – поток горячего воздуха 50°С (условный раздражитель – свет, лампа накаливания мощностью 60 Вт). Наиболее ярко этот эффект проявляется при длительной акклима- ции. Для определения причин и механизмов холодовой стимуляции условно-рефлекторной деятельности, уско- рения формирования реакции избегания оценивались изменения частотных характеристик биоэлектрической активности мозга. Спектрально-корреляционный анализ электроэнцефалограмм показал, что биоэлектрическая активность мозга хомяка после длительной температур- ной акклимации (с высокой скоростью выработки реф- лекса) характеризуется высокоамплитудным секундным ритмом и высоким уровнем пространственной коге- рентности тета-ритма электроэнцефалограммы. Высо- кая скорость формирования реакции избегания может быть связана с нейрофизиологическими процессами, обусловленными высоким уровнем пространственной когерентности тета-ритма. Modeling of state of artificial hibernation close to natural one in large mammals and humans is of great practical value. However, it has been established that during hibernation a dendritic tree is significantly reduced in neural net of ce- rebral cortex and in many subcortical structures that could lead to the loss of memory. The research aim was to perform integral assessment of hypothermia effect on the brain structure and functions. Morphometric characteristics of cortical neurons in the control and experimental animals were studied in the first series of experiments. Fractal analysis was applied to assess the complexity of neural net and separate neurons of hyber- nating brain. We have noted that the structure of dendritic tree is significantly reduced during hibernation and comp- letely recovered when awakening. It seemed appropriate to find out whether the structural changes affect the functional activity. Herewith in the next series of experiments we studied the effect of different cold exposures (cyclic and long-term acclimation) on production of conditioned reflex in hamsters. We have shown after cold exposures in hamsters there is increased the rate of avoi- dance response to unconditioned stimulus, flow of 50°C hot air (conditioned stimulus was the light, lamp of 60W capacity). This effect is most pronounced at long-term accli- mation. To determine the causes and mechanisms in cold stimu- lation of conditioned reflex activity, accelerations in forma- tion of avoidance response we assessed the changes in frequency characteristics of brain bioelectrical activity. Spectral-correlation analysis of electroencephalograms has shown that bioelectrical activity of hamster brain after long- term temperature acclimation (with a high rate of reflex formation) was characterized by a high-amplitude second rhythm and high level of spatial coherence of theta-rhythm in electroencephalogram. High rate of avoidance response formation can be associated with neurophysiological pro- cesses stipulated by a high level of theta-rhythm in spatial coherence. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Фотометрический метод оценки качества спермы карпа А.Ю. ПУГОВКИН1,2, Е.Ф. КОПЕЙКА1 1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков 2Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина Photometric Method for Assessing Quality of Carp Sperm A.YU. PUGOVKIN1,2, E.F. KOPEYKA1 1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 2Kharkov National University, Kharkov, Ukraine 197 Предложен экспресс-метод оценки проницаемости мембран сперматозоидов карпа, основанный на анализе динамики светопропускания суспензии клеток, поме- щенных в гипотоничные среды. Скорость изменения объема клетки определяется структурой клеточной мем- браны и будет тем выше, чем выше проницаемость мем- браны. Согласно предложенной модели сперматозоиды карпа – большие шарообразные частицы (a > l) с пока- зателем преломления, близким показателю преломления воды. Для измерения светопропускания клетки поме- щают в кювету с гипотоничным раствором известной осмолярности. С помощью магнитной мешалки содер- жимое кюветы постоянно перемешивается. Фотоэлект- роколориметр измеряет светопропускание, фиксируе- мое на ленте самописца. Поскольку светопропускание увеличивается за счет изменения показателя преломления спермы, можно ут- верждать, что оно изменяется одновременно с увели- чением клеточного объема. Именно этим можно объяс- нить проявление закономерностей, характерных для динамики объема, в динамике светопропускания. В большинстве измерений (n ~ 200) зависимости светопро- пускания от времени корректно аппроксимируются функцией вида T = 1 – e–kt, т. е. динамика светопропус- кания описывается той же функциональной зависимос- тью, что и изменение клеточного объема со временем согласно модели. В зависимости от осмотической кон- центрации среды инкубации наблюдаются различные значения относительного светопропускания: чем боль- ше перепад осмотического давления, тем больше изме- нение светопропускания. С погрешностью приблизи- тельно до 10% выполняется линейная зависимость k = γLpπ out, позволяющая вычислить значение γLp – коэф- фициента проницаемости мембран. Показано, что про- ницаемость клеточных мембран, оцениваемая предло- женным методом, не зависит от концентрации клеток в среде инкубации. С использованием данного метода изучено влияние времени хранения спермы карпа после её получения, влияние гормональной стимуляции самцов и криокон- сервирования на скорость изменения объема клеток, значения которой позволяют судить о проницаемости мембран сперматозоидов и, следовательно, качестве спермы. Начальное качество спермы является одним из важных параметров, влияющих на результат криокон- сервирования. Показано, что после криоконсервирова- ния скорость изменения объема существенно возрас- тает, что свидетельствует о повреждении структуры клеточных мембран, быстрой потере клетками энергети- ческого потенциала, следовательно, возможности ис- пользования того или иного метода криоконсервирова- ния. The express-method of estimation of carp sperm mem- branes permeability, based on the analysis of light trans- mission dynamics in the cell suspension, placed into hypo- tonic medium, is proposed. The rate of cell volume change depends on the structure of cell membrane and would increase, with increasing of membrane permeability. According to the proposed model, the carp spermatozoa are large spherical particles (a > l) with a refractive index close to refractive index of water. To measure the light trans- mission the cells were placed into cuvette with hypotonic solution of known osmolarity. The content of cuvette was constantly mixed with a magnetic stirrer. The transmission was measured with photoelectric calorimeter and recorded automatically. As the light transmission increases due to the changes in the refractive index of the sperm, it can be stated that the transmission is increasing if the cell volume is growing. This can explain the manifestation of regularities that are typical for the dynamics of volume, in the dynamics of light transmission. In the most measurements (n ~ 200) the temporal dependencies of light transmission are quite cor- rectly approximated by the function T = 1 – e–kt , i. e. the dynamics of light transmission is described by the same functional dependence as the change of cell volume accor- ding to the model. Depending on osmotic concentration of incubation medium we observed the different values of relative light transmission: the higher was the difference of osmotic pressure, the higher the change in light transmission was. With error of about 10% the linear dependence k = γLpπ out was realized, that allowed to calculate the value of membrane permeability coefficient γLp . It was shown that the permeability of cell membranes, estimated by the pro- posed method, was not dependent on the concentration of cells in the incubation medium. Using this method, we studied how storage duration of carp sperm after its obtaining as well as hormonal stimulation of males and cryopreservation of sperm affected the rate of cell volume change, the values of which allowed estimating the cell membrane permeability and, consequently, the quality of sperm. The initial quality of sperm is one of impor- tant parameters that affect the final result of cryopreser- vation. It was shown, that after cryopreservation the rate of the volume change increased significantly that testified to the damage of cell membrane structure, rapid loss of cell energy potential, and therefore, the applicability of certain cryopreservation method. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Физические состояния водных растворов диметилацетамида и оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 при соотношении R = 1:2 ниже 0°C А.О. КРАСНИКОВА1, А.В. ЗИНЧЕНКО2 1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина 2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Physical States of Aqueous Solutions of Dimethylacetamide and Oxyethylated Glycerol with Polymerization Degree n = 5 at R = 1:2 Ratio below 0°C A.O. KRASNIKOVA1, A.V. ZINCHENKO2 1Kharkov National University, Kharkov, Ukraine 2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 198 При разработке методов криоконсервирования био- логических объектов важно исследовать фазовые пере- ходы и физические состояния криопротекторных сред при охлаждении и нагреве. Оксиэтилированный глице- рин со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) и диме- тилацетамид (ДМАц) рассматриваются как перспектив- ные криопротекторы. Их комбинация значительно повы- шает сохранность криоконсервированных тромбоцитов по сравнению с результатами замораживания в средах на основе одного криопротектора [Богданчикова О.А., 2009]. В связи с этим целью настоящей работы являлось исследование фазовых и физических состояний водных растворов ДМАц + ОЭГn=5 в соотношении R = 1:2 ниже 0°C методом дифференциальной сканирующей калори- метрии. Водные растворы ДМАц и ОЭГn=5 (1:2) готовили на бидистиллированной воде методом взвешивания. Образ- цы массой 1 г помещали в тонкостенный стакан, после чего погружали в жидкий азот. Средняя скорость охлаж- дения составляла 3,3 град/с. Охлажденные образцы поме- щали в калориметрический блок ДСК, разработанный и изготовленный в ИПКиК НАН Украины. Термограммы регистрировали при нагреве со скоростью сканирования 8,3×10–3 град/с. На термограммах, снятых при нагреве, зарегистрированы экзо- и эндотермические пики и ска- чок теплопоглощения. Формирование стеклообразных включений на этапе охлаждения в растворах ДМАц + ОЭГn=5 (1:2) указывает на то, что часть системы находится в метастабильном состоянии. Скачок теплопоглощения регистрируется во всем концентрационном диапазоне. Слабоинтенсивный экзотермический пик (при концент- рации криопротектора до 40%) интерпретируется как за- вершение кристаллизации льда на этапе нагрева. В раст- ворах ДМАц + ОЭГn=5 с концентрацией от 40 до 65% наличие интенсивного экзотермического пика соответ- ствует кристаллизации льда из переохлажденной жидкос- ти на этапе нагрева. На термограммах растворов ДМАц + ОЭГn=5 с концентрацией выше 65% регистрируется только скачок теплопоглощения, указывающий на про- цесс расстеклования системы. Таким образом, установлены закономерности разви- тия кристаллических и аморфных фаз в исследуемой системе. В зависимости от концентрации ДМАц + ОЭГn=5 растворы затвердевают, при этом они представляют гомогенную стеклообразную или гетерогенную систему, которая включает как кристаллическую, так и метаста- бильную стеклообразную фазы. Благодаря высокой скорости охлаждения образца, начиная с некоторого зна- чения концентрации растворенного вещества, кристал- лизация на этапе охлаждения не происходит. Для скорости охлаждения 3,3 град/с граничная концентрация ДМАц + ОЭГn=5 (1:2) составляет 40%. It is important to combine the development of methods for cryopreservation of biological objects and investigation of phase transitions and physical states of cryoprotective media during cooling and heating. Oxyethylated glycerol with a polymerization degree of n = 5 (OEGn=5) and dime- thylacetamide (DMAc) are considered as promising cryopro- tectants. Their combination significantly increases survival of frozen-thawed platelets if compared to results of freeze- thawing in media based on one cryoprotectant [Bogdanchi- kova O.A., 2009]. Therefore, the research aim was to study phase and physical states of aqueous solutions DMAc + OEGn=5 in the ratio R = 1:2 below 0°C by differential scanning calorimetry. Aqueous solutions of DMAc and OEGn=5 (1:2) were prepared in bidistilled water by weight method. The samples of 1 g were placed in a thin-walled jar, and then plunged into liquid nitrogen. The average cooling rate was 3.3 deg/s. The cooled samples were placed into DSC calorimetric unit, designed and manufactured at the IPC&C of the National Academy of Sciences of Ukraine. Thermograms were recor- ded during heating with a scanning rate 8.3×10–3 deg/s. In the thermograms obtained during heating we revealed exo- and endothermic peaks and the jump in heat absorption. Formation of glass inclusions during cooling of DMAc + OEGn=5 (1:2) solution indicates that a part of system was in a metastable state. The jump in heat absorption was obser- ved in the whole concentration range. Low-intensity exo- thermic peak (at cryoprotectant concentration up to 40%) was interpreted as completion of ice crystallization during heating. In solutions of DMAc + OEGn=5 in concentrations from 40 to 65% the presence of intensive exothermic peak corresponded to ice crystallization in supercooled liquid during heating. In the thermograms of DMAc + OEGn=5 solutions with concentration above 65% there was recorded only a heat absorption jump, indicating devitrification of the system. Thus, we established the regularities of crystal and amor- phous phase development in the studied system. Depend- ing on the concentration of DMAc + OEGn=5 solutions were getting solid, thereat they represented a homogeneous or heterogeneous glass system, including both crystal and metastable glass phase. Due to a high rate of sample cooling no crystallization during cooling occured starting from a certain concentration of solved substance. For cooling rate of 3.3 deg/s this limit concentration of DMAc + OEGn=5 (1:2) was 40%. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Модификация характеристик клеток аденокарциномы Эрлиха под влиянием факторов криоконсервирования О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО, О.В. САФРАНЧУК, Н.А. БОНДАРОВИЧ, М.В. ОСТАНКОВ, А.Ю. ДИМИТРОВ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Modification of Ehrlich Carcinoma Cell Properties under Effect of Cryopreservation Factors O.V. CHELOMBITKO, O.V. SAFRANCHUK, N.A. BONDAROVICH, M.V. OSTANKOV, A.YU. DIMITROV Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 199 Cтволовые раковые клетки в общей популяции транс- формированных клеток могут быть информативным маркером, который является показателем эффектив- ности проведенной терапии. В современной практичес- кой медицине для лечения опухолей используется метод криодеструкции, однако его внедрение не исключает возникновение рецидивов. Поэтому изучение молеку- лярно-генетических механизмов ответа опухолевых кле- ток на действие холода остается актуальным. Одной из удобных экспериментальных моделей онкопатологий является асцитическая форма аденокарциномы Эрлиха (АКЭ), которая представляет собой штамм перевивае- мых клеток спонтанного рака молочной железы мыши. Цель исследования - оценить молекулярно-генетические показатели клеток АКЭ 7- и 14-и суток культивирования, а также характер их изменений после криоконсервиро- вания. Объектом исследования были клетки АКЭ 7- и 14-и суток культивирования, которые вводили внутрибрю- шинно 7-месячным самкам мышей линии BALB/c и сно- ва получали на 7- и 14-е сутки (АКЭ-7, АКЭ-14). Материал замораживали-отогревали в асцитической жидкости без использования криопротекторов по двуэтапной про- грамме. Процентный состав субпопуляций с маркерами CD44hіgh в общей популяции клеток АКЭ определяли на проточном цитофлуориметре FACS Calіbur (Becton Dіckinson, США). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью пропидий йодида (PІ). Аттестацию материала после культивирования іn vіvo осуществляли на 7- и 14-е сутки. Уровень экспрессии генов sox2, nanog, bmі-1 в общей популяции клеток АКЭ-7 и АКЭ-14 определяли методом ОТ-ПЦР, продукты амплификации – на биоана- лизаторе Agіlent 2100 (США). Анализ структурно-функциональных характеристик общей популяции АКЭ до и после замораживания-ото- грева показал, что клетки, которые экспрессировали на своей поверхности маркеры CD44 в культурах изучаемых сроков, по-разному отвечали на действие холода. При анализе генетических характеристик установлено, что уровень экспрессии всех определяемых генов в нативных клетках снижался по мере развития АКЭ, а после замо- раживания-отогрева в АКЭ-7 действие холода вызывало угнетение уровня экспрессии, а в АКЭ-14 наблюдались обратные эффекты. На основании полученных данных возникает необходимость проведения дальнейших исследований по аттестации ответа клеток, индуцирую- щих опухоль, на действие факторов замораживания- отогрева. Cancer stem cells as a part of total population of transfor- med cells may be an informative marker or the efficient indicator for the carried-out therapy. In modern practical medicine the cryodestruction method is applied to treat the tumors but its implementation does not exclude the backset of disease. So the study of molecular-genetic mechanisms of tumor cell response to cold effect has remained an actual one. One of the suitable experimental oncopathology models is an ascitic form of Ehrlich carcinoma (EC) representing the strain of passaged cells of spontaneous cancer in murine mammary gland. The research aim was to evaluate the molecular-genetic indices of EC cells of 7 and 14 culturing days as well as the character of their changes after cryo- preservation. Research objects were EC cells of 7 and 14 culturing days that were injected intraperitoneally into 7-month-old BALB/c female mice and were again isolated to the 7th and 14th days (EC-7, EC-14). The material was frozen-thawed in ascitic liquid without cryoprotectants using two-step cooling program. Percentage of subpopulations with markers CD44high in total EC cell population was determined with flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson, USA). Cell viability was assessed with propidium iodide. Attestation of material after in vivo culture was performed in the 7th and 14th days. Level of sox2, nanog, bmi-1 genes expression in total population of EC-7 and EC-14 cells was determined by PCR-RT method, amplification products were assesses with Agilent 2100 Bioanalyzer (USA). Analysis of structural-functional characteristics of total EC population prior to and after freeze-thawing has shown that cells expressing CD44 markers on their surface in the cultures of the studied terms provided different response to the cold effect. Analyzing the genetic characteristics we have established that expression level of all the determined genes in native cells decreased as EC developed, and after freeze-thawing the cold effect caused suppression of expres- sion level in EC-7 and reverse effects were noted in EC-14. Basing on the obtained data it is necessary to perform fur- ther investigations to attest the response of tumor inducing cells to the effect of freeze-thawing factors. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Экспрессия βββββ-III-тубулина в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят, полученной из криоконсервированных фрагментов ткани О.С. СИДОРЕНКО, Г.А. БОЖОК, Е.И. ЛЕГАЧ, Т.П. БОНДАРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Expression of βββββ-III-Tubulin in Adrenal Cell Culture of Newborn Piglets Derived from Cryopreserved Tissue Fragments O.S. SIDORENKO, G.A. BOZHOK, E.I. LEGACH, T.P. BONDARENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 200 Известно, что хромаффинные клетки надпочечников и симпатические нейроны являются производными кле- ток нервного гребня и развиваются из общей клетки- предшественника. В культуре под действием фактора роста нервов NGF недифференцированные клетки моз- гового вещества надпочечников приобретают морфо- логические и функциональные особенности нейрональ- ных клеток, а зрелые хромаффинные клетки способны к трансдифференцировке в нейрональном направлении. Благодаря способности хромаффинных клеток транс- формироваться в нейроны, они рассматриваются как источник аутогенного клеточного материала для транс- плантации пациентам с болезнью Паркинсона. Источником клеток нейрональной морфологии в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят являются сферические клеточные структуры (сферои- ды), формирующиеся к 5–7-м суткам культивирования. Поскольку криоконсервирование является наиболее удобным способом долгосрочного хранения фрагмен- тов ткани, необходимо изучить его влияние на сохран- ность недифференцированных клеток надпочечников. Целью работы было получить первичную культуру клеток надпочечников новорожденных поросят из крио- консервированных фрагментов ткани и исследовать воз- можность получения сфероидов и клеток нейрональной морфологии. Фрагменты надпочечников криоконсервировали под защитой 10% ДМСО, охлаждая со скоростью 0,5 град/мин до –40°С с последующим погружением в жидкий азот. Клетки получали ферментативным методом после пред- варительного отогрева фрагментов и культивировали в среде DMEM/F12 с 10% фетальной телячьей сыворотки. Для пересева клетки снимали с помощью растворов трипсина и Версена. Для идентификации нейрональных клеток проводили иммуноцитохимическое окрашивание на β-III-тубулин. Жизнеспособность клеток, полученных из криокон- сервированных фрагментов ткани, составляла 93,3 ± 5%. Через сутки культивирования наблюдалось прикрепле- ние и распластывание большей части посаженных кле- ток, а к 5-м суткам – формирование монослоя и сферои- дов. После пересева сфероиды прикреплялись к поверх- ности культивирования, а затем наблюдалось выселение из них нейроноподобных клеток с отростками. Иммуно- цитохимическое окрашивание показало наличие β-III- тубулина в соме и отростках клеток, выселяющихся из сфероидов. Таким образом, криоконсервирование фрагментов ткани надпочечников новорожденных поросят со ско- ростью охлаждения 0,5 град/мин позволяет сохранить популяцию клеток, формирующих сфероиды и их спо- собность к дифференцировке в нейрональном направ- лении. It has been known that adrenal chromaffin cells and sympathetic neurons are derivatives of neural crest cells and are developed from common precursor cell. Non- differentiated cells of adrenal medulla gain morphological and functional peculiarities of neuronal cells in culture under effect of neural growth factor, and mature chromaffin cells are capable of transdifferentiation towards neurons. Due to capability of chromaffin cells to transform into neurons they may be considered as a source of autologic cell material for transplantation to the patients with Parkinson’s disease. The source of cells with neuronal morphology in culture of newborn piglet adrenal cells are spherical cell structures (spheroids) formed to the 5–7th day of culture. Whereas cryopreservation is the most convenient method of tissue fragments long-term storage, it is necessary to study its ef- fect on survival of non-differentiated adrenal cells. The research aim was to obtain primary culture of new- born piglet adrenal cells using cryopreserved tissue frag- ments and to check the possibility to obtain spheroids and cells of neuronal morphology. Adrenal fragments were cryopreserved under protection of 10% DMSO and cooling rate of 0.5 deg/min down to –40°C with further plunging into liquid nitrogen. The cells were obtained by enzymatic method after thawing the fragments and then cultured in DMEM/F12 with 10% fetal calf serum (FCS). Before passaging the cells were detached with trypsin and Versene solutions. Neuronal cells were identified by immunocytochemical staining for β-III tubulin. Viability of cells derived from cryopreserved tissue fragments was 93.3 ± 5%. After one day culture we observed adhesion and flattening of bulk of the seeded cells, and to the 5th day there was formation of monolayer and spheroids. After passaging the spheroids adhered to culture surface, and then we observed the migration of neuron-like cells with processes. Immunocytochemical staining showed the presence of β-III tubulin in soma and processes of cells, migrated from spheroids. Thus, cryopreservation of fragments of adrenal tissue of newborn piglets using the cooling rate of 0.5 deg/min enabled to preserve the cell population, which formed sphe- roids, as well as the ability to differentiate towards neurons. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Влияние различных концентраций ДМСО и ЭТС в составе криозащитных сред на морфо-функциональные свойства клеток надпочечников новорожденных мышей И.В. ТАМАРИНА, Г.А. БОЖОК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Different DMSO and FBS Concentrations in Cryoprotective Media on Morphofunctional Properties of Adrenal Cells of Newborn Mice I.V. TAMARINA, G.A. BOZHOK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 201 Данное исследование посвящено разработке состава криозащитной среды для суспензии клеток надпочечни- ков (СКН) новорожденных мышей, которая позволила бы достичь максимальной сохранности морфофункцио- нальных характеристик клеток после замораживания-от- таивания. Клетки надпочечников новорожденных мышей являются объектом для исследования процессов синтеза и секреции гормонов, дифференцировки и трансдиффе- ренцировки клеток, происходящих из нервного гребня, а также для тестирования фармакологических препара- тов, поэтому их криоконсервирование является актуаль- ной задачей. Целью нашей работы было исследовать влияние раз- личных концентраций ДМСО (5; 7,5; 10; 15; 20 и 30%) и ЭТС (0; 10 и 25%) в составе криозащитных сред на морфо- функциональные свойства клеток надпочечников ново- рожденных мышей. Образцы СКН охлаждали со скоростью 1 град/мин до –40°С на программном замораживателе «Cryoson» (Германия) с последующим погружением в жидкий азот. Клетки подвергались ступенчатой отмывке от криопро- тектора, определялись их жизнеспособность по методу исключения трипанового синего и сохранность коли- чества. Функциональное состояние суспензии оцени- вали по способности клеток к адгезии и распластыванию в условиях культивирования, а также секреции альдосте- рона в культуральную среду. Культивирование проводи- ли на среде, содержащей амфотерицин, гентамицин, 10% ЭТС, в атмосфере с 5% СО2 при постоянной влажности и температуре 37°С. В результате проведенных исследований было уста- новлено, что в присутствии 15 и 20% ДМСО, с ЭТС и без нее для клеток были характерны высокие показатели жизнеспособности (63–76%) и сохранности количества (78–99%). В культурах клеток, замороженных-отогретых в бессывороточных средах, количество прикрепленных клеток составляло 10–36% от контроля, уровень секре- ции альдостерона – 0,1% от контроля. В культурах клеток, замороженных с ЭТС, количество прикрепленных клеток составляло 30–95% от контроля, секреция альдостерона – 1,5–20% от контроля. Наивысшие показатели секреции альдостерона (20%), количества распластанных и при- крепленных клеток были в образцах, замороженных-отог- ретых с 20% ДМСО и 25% ЭТС. По-видимому, это связано с тем, что криопротекторные свойства ДМСО в концент- рации 20% для данного типа клеток оптимальны, тогда как цитотоксические эффекты криопротектора могут нивелироваться присутствием ЭТС. This research was devoted to formulation of cryopro- tective medium composition for newborn mice adrenal cell suspension (ACS), which would enable to preserve maximal- ly the morphofunctional characteristics of cells after freeze- thawing. Adrenal cells of newborn mice are the objects to study hormone synthesis and secretion, differentiation and transdifferentiation of cells, derived from neural crest, as well as to test the pharmacological preparations, therefore their cryopreservation is an actual task. The research aim was to study the effect of different DMSO (5; 7.5; 10; 15; 20 and 30%) and FBS (0; 10 and 25%) concentrations in cryoprotective media on morphofunc- tional properties of adrenal cells of newborn mice. The samples of ACS were cooled with rate of 1deg/min down to –40°C with a programmable freezer Cryoson (Germa- ny) with the following plunging into liquid nitrogen. After thawing the cells were stepwise washed free of cryoprotec- tant, then we assessed their viability using trypan blue exclusion as well as the number of survived cells. Functional state of suspension was assessed by ability of cells to adhe- re and to flatten during culture, as well as aldosterone sec- retion into cultural medium. Culturing was performed in the medium, containing amphotericin, gentamicin, 10% FBS in 5% CO2 atmosphere with constant humidity and temperature of 37°C. As a result of performed research we established high indices of post thaw cell viability (63–76%) and survival (78–99%) in cases of 15 and 20% DMSO solutions supple- mented with FBS or FBS free. In cell cultures frozen-thawed in serum-free media a number of adhered cells was 10–36% from the control, aldosterone secretion level made 0.1% from the control. In cell cultures frozen-thawed in FBS enri- ched media the number of adhered cells made 30–95% from the control, and aldosterone secretion was 1.5–20% from the control. The highest indices of aldosterone secretion (20%), number of flattened and adhered cells were in samples frozen-thawed in solution of 20% DMSO and 25% FBS. Ob- viously it was associated with fact that the 20% concent- ration of DMSO possessed optimal cryoprotective proper- ties for this type of cells, whereas the cytotoxic effects of cryoprotectant may be neutralized by FBS. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Гипотермическое хранение изолированных нервных клеток новорожденных крыс в средах различного состава М.В.ШЕВЧЕНКО Харьковский национальный педагогический университет им. Г.С. Сковороды Hypothermic Storage of Isolated Nerve Cells of Newborn Rats in Different Composition Media M.V. SHEVCHENKO G.S. Skovoroda Kharkov National Pedagogical University, Kharkov, Ukraine 202 The investigation of hypothermic conditions effect on postnatal isolated nerve cells (NCs) is actual for cryobiology, transplantology and medicine. The research aim was to study the effect of hypothermic storage (HS) on the behavior in culture in vitro of isolated newborn rat NCs in different composition media. NCs were isolated from the brain of newborn rats, washed and cultured in the concentration of 2×106 cells/ml in DMEM/ F12 enriched with 10% rat serum. The cells were stored during 1, 2, 3 and 4 days at 8°C in saline (DMEM/F12) and sucrose- saline media (SSM) supplemented with or without rat blood serum. After HS the cells were cultured in the same way as fresh cells. During 1 day of HS in SSM both with or without serum we observed a sharp increase of cell viability index which almost did not change during further storage. Thereat one day storage in SSM led to a sharp decrease of NC number which did not change during the following storage. During HS of NCs in DMEM/F12 the number of cells decreased rather intensively, and their viability increased insignificantly. Presence of serum did not significantly affect the viability and number of cells. Twenty-four-hour HS in DMEM/F12 with or without serum and in SSM without serum did not affect the cell behavior in culture if compared to the control. Two-day HS in DMEM/ F12 in the presence of serum almost did not influence the cell behavior in culture. In the absence of serum the NCs formed only small glial monolayer areas. In this case no neuroblasts and colonies were formed. The cells stored in SSM without serum formed few neuroblasts and colonies during culturing but they appeared later than in the control. When culturing the NCs stored in SSM with serum there were formed the small loose aggregates not attached to the surface. The cells died during culturing. Culturing of NCs after 3 days of HS in all the investigated media was characterized by the formation of small loose aggregates that did not attached to the surface. Afterwards the cells of aggregates died. Thus the NCs can be stored in hypothermic conditions for 2 days. Thereat the presence of serum is desirable in the case of DMEM/F12 and its absence is necessary in the case of SSM. Исследование влияния гипотермических условий на постнатальные изолированные нервные клетки (НК) яв- ляется актуальным для криобиологии, трансплантологии и медицины. Целью работы явилось изучение влияния гипотермического хранения (ГХ) на поведение в куль- туре in vitro изолированных НК новорожденных крыс в средах различного состава. НК получали из мозга новорожденных крыс, отмы- вали и культивировали в концентрации 2×106 клеток/мл в среде DMEM/F12, обогащенной 10% сыворотки крыс. Клетки хранили в течение 1, 2, 3 и 4-х суток при темпе- ратуре 8°С в солевой (DMEM/F12) и сахарозо-солевой средах (ССС) в присутствии или при отсутствии сыворот- ки крови крыс. После ГХ клетки культивировали анало- гично свежевыделенным. В течение одних суток ГХ в ССС с или без сыворотки наблюдалось резкое увеличение жизнеспособности клеток, которая при дальнейшем хранении практически не изменялась. При этом 1 сутки хранения в ССС приво- дили к резкому снижению количества НК, которое не изменялось в процессе дальнейшего хранения. При ГХ НК в среде DMEM/F12 достаточно интенсивно уменьша- лось количество клеток и незначительно повышалась жизнеспособность. Присутствие сыворотки достовер- ного влияния на жизнеспособность и количество клеток не оказывало. Гипотермическое хранение в течение суток в средах DMEM/F12 в присутствии или при отсутствии сыворотки и в ССС без добавления сыворотки не оказывало влияния на поведение клеток в культуре по сравнению с контро- лем. Двухсуточное ГХ в среде DMEM/F12 в присутствии сыворотки практически не влияло на поведение клеток в культуре. При отсутствии сыворотки НК формировали лишь небольшие островки монослоя глии. Нейробласты и колонии при этом не образовывались. Клетки, хранив- шиеся в ССС без сыворотки, в процессе культивирования формировали небольшое количество нейробластов и колоний, однако они появлялись в более поздние сроки по сравнению с контролем. При культивировании НК, хранившихся в ССС с сывороткой, формировались мел- кие рыхлые агрегаты, которые не прикреплялись к под- ложке; в процессе культивирования клетки погибали. Культивирование НК после 3-х суток ГХ во всех иссле- дованных средах характеризовалось формированием мелких рыхлых агрегатов, которые не прикреплялись к подложке; в дальнейшем клетки агрегатов погибали. Таким образом, НК можно хранить в гипотермичес- ких условиях на протяжении 2-х суток. При этом жела- тельно присутствие сыворотки в среде DMEM/F12 и обязательно ее отсутствие в ССС. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Сохранность неонатальной овариальной ткани при гипотермическом хранении в зависимости от композиционного состава среды инкубации Е.А. МЕДИНЕЦ, В.В. КИРОШКА, Ю.О. ТИЩЕНКО, Т.П. БОНДАРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Preservation of Neonatal Ovarian Tissue during Hypothermic Storage Depending on Incubation Medium Composition E.A. MEDINETS, V.V. KIROSHKA, YU.O. TISCHENKO, T.P. BONDARENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 203 В настоящее время одной из основных проблем в репродуктивной медицине при консервировании ова- риальной ткани остается сохранение достаточного пула фолликулов, необходимого для восстановления детород- ной функции у женщин. Для решения этой задачи раз- рабатываются новые протоколы консервирования и ме- тоды трансплантации как половозрелой, так и феталь- ной овариальной ткани. Цель данной работы – провести сравнительный ана- лиз морфологической трансформации неонатальной овариальной ткани крыс при гипотермическом хранении (ГХ) в электролитных (фосфатно-солевой буфер – ФСБ) и неэлектролитных средах (маннитолосодержащий раст- вор – МСР) в присутствии эмбриональной телячьей сы- воротки (ЭТС) и без нее, а также оценить ее функцию в условиях гетеротопической трансплантации. Для дости- жения поставленной цели неонатальные яичники для ГХ (4°С) были разделены на группы в зависимоcти от состава среды инкубации: группа 1 – ФСБ (130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4); группа 2 – ФСБ + 10% ЭТС; группа 3 – МСР (250 мМ маннита, 10 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4); группа 4 – МСР + 10% ЭТС. Динамику морфологической транс- формации фолликулов на 1-е, 2-е, 3-и, 5-е сутки ГХ ана- лизировали микроскопически на полутонких срезах. Функцию неонатальной овариальной ткани после 1-х су- ток ГХ в исследуемых средах изучали методом гетерото- пической трансплантации под капсулу левой почки. По- казано, что после 1-х суток ГХ количество морфологи- чески нормальных фолликулов оставалось достаточно высоким (80–90%) во 2, 3 и 4-й группах, тогда как в 1-й группе этот показатель был достоверно ниже (66%). На 2-е сутки ГХ максимум сохранности морфологической структуры неонатальной овариальной ткани наблюдался в инкубационных средах, содержащих 10% ЭТС (группы 2 и 4). Увеличение сроков ГХ приводило к снижению количества нормальных фолликулов до 10–15% во всех исследуемых группах. При этом на 3-и сутки ГХ мини- мум дегенеративных форм фолликулов с необратимы- ми изменениями выявлен в группе 2. Анализ роста и развития трансплантатов неонатальной овариальной ткани после ГХ на 30-е сутки наблюдения показал на- личие фолликулов различной степени зрелости и желтых тел в группах 1-3, тогда как в группе 4 отсутствовали пре- антральные и антральные фолликулы, а также желтые тела. При этом фолликулярная плотность (количество фолликулов на 1 мм3) в группе 3 составляла 20,4 ± 2,6, что было сравнимо с контрольной (24,6 ± 3,3). Таким образом, сохранность морфологической струк- туры неонатальной овариальной ткани при ГХ наиболее выражена в средах инкубации в присутствии 10% ЭТС, тогда как полноценное развитие трансплантатов после 1-х суток ГХ отмечено после инкубации в среде МСР. One of the main problems in reproductive medicine during cryopreservation of ovarian tissue is the preservation of sufficient pool of follicles, needed for recovery of fertility in women. To solve this task the new protocols of preser- vation and transplantation for either mature or fetal ovarian tissues have been developed. The research aim was to analyze comparatively the mor- phological transformation of neonatal ovarian tissue of rats during hypothermic storage (HS) in electrolyte (phosphate- based saline (PBS)) and non-electrolyte media (mannitol- containing solution (MCS)) in the presence of fetal bovine serum (FBS) and in serum free ones, as well as to estimate its function during heterotopic transplantation. To do this the neonatal ovaries supposed for HS (4°C) were divided into the groups depending on the incubation medium com- position: group 1 – PBS (130 mM NaCl, 20mM KCl, 20 mM phosphate buffer, pH 7.4); group 2 – PBS + 10% FBS; group 3 – MCS (250 mM mannit, 10 mM NaCl, 20 mM KCl, 20 mM phosphate buffer, pH 7.4); group 4 MCS + 10% FBS. The dynamics of morphological transformation of follicles to the 1st, 2nd, 3rd and 5th days of HS was microscopically ana- lyzed in semi-thin sections. The function of neonatal ovarian tissue after 24 hrs of HS in the studied media was examined by heterotopic transplantation under left kidney capsule. It has been shown that after 24-hour-long HS the number of morphologically normal follicles has remained quite high (80–90%) in the groups 2–4, meanwhile in the group 1 this index was statistically and significantly lower (66%). To the 2nd day of HS the maximal preservation of morphological structure of neonatal ovarian tissue was observed in incu- bation media containing 10% FBS (groups 2 and 4). The increased HS duration led to a reduced number of normal follicles down to 10–15% in all the studied groups. Herewith to the 3rd day of HS the minimal content of degenerative forms of follicles with irreversible changes was found in group 2. The analysis of growth and development of the neonatal ovarian tissue grafts after HS to the 30th day of observation has demonstrated the presence of follicles of different maturity and yellow bodies in groups 1–3, whilst in group 4 there was no pre-antral and antral follicles, as well as no yellow bodies. Herewith the follicular density (number of follicles per 1mm3) in group 3 made 20.4 ± 2.6 which was comparable with the control one (24.6 ± 3.3). Thus the preservation of morphological structure of neonatal ovarian tissue during HS was the most manifested in incubation media supplemented with 10% FBS, while a proper development of the grafts after 24 hrs HS was noted after incubation in MCS medium. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Кинетический анализ плавления гемоглобина в присутствии оксиэтилированного производного глицерина Ю.С. ГОВОРОВА, А.В. ЗИНчЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Kinetic Analysis of Hemoglobin Melting in Presence of Oxyethylated Glycerol YU.S. GOVOROVA, A.V. ZINCHENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 204 Состав среды и температура играют существенную роль в поддержании нативной конформации белков. Эти факторы очень важны в криобиологии при разработке технологий криоконсервирования биологических систем в присутствии криозащитных сред. В настоящей работе методом дифференциальной сканирующей калори- метрии проведено исследование влияния оксиэтилиро- ванного производного глицерина со степенью полимери- зации n = 5 (ОЭГn=5) на термодинамические и кинетичес- кие параметры плавления гемоглобина человека на основе анализа пика плавления. Гемоглобин получали по известной методике [Fair- banks, 1971] с некоторыми модификациями, оксиэтили- рованный глицерин (Ивано-Франковск, «Барва») был очищен в Институте проблем криобиологии и криомеди- цины НАН Украины. Термограммы регистрировали на дифференциаль- ном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (СКБ БП Пущино, Московская область, Россия). Область сканирования – от 25 до 90°С при избыточном давлении 2,5 атм. Скорость нагрева 1 град/мин. Как показано ранее [B. Sengupta, 2005], процесс плав- ления гемоглобина (HbA) необратим и описывается двухстадийной моделью N 1k ↔U 2k →D, включающей частич- ное обратимое разворачивание белка (1-я стадия) и необ- ратимую денатурацию (2-я стадия). В случае необрати- мого плавления белков более предпочтительным является кинетический анализ [Любарев, Курганов, 2000]. В настоящей работе для определения энергии актива- ции мы воспользовались одним из четырех подходов, описанных Sanchez-Ruiz (1992), в котором отношение Ea/R может быть определено как тангенс угла наклона зависимости ln[vCpex/(∆H – Q)] от 1/T, где Ea – энергия активации; R – универсальная газовая постоянная; T – текущая температура; ∆H – энтальпия плавления (опре- деляется как площадь под кривой зависимости избыточ- ной теплоемкости от температуры); Q – текущее коли- чество теплоты, поглощаемое в процессе денатурации. Нами рассчитаны значения калориметрической эн- тальпии плавления, энергии активации и температуры плавления для растворов гемоглобина с добавлением различных концентраций ОЭГn=5. Увеличение содержа- ния криопротектора в растворе гемоглобина приводит к росту значений энергии активации и уменьшению кало- риметрической энтальпии и температуры плавления ге- моглобина. Таким образом, можно предположить, что увеличение концентрации криопротектора вызывает раз- рыхление молекул гемоглобина, позволяя тем самым снизить термостабильность белка. The composition of medium and its temperature play an important role in maintaining the native conformation of proteins. These factors are very important in cryobiology for the development of technologies for low temperature preservation of biological systems in the presence of cryo- protective media. Using differential scanning calorimetry we studied the effect of oxyethylated glycerol with polymeri- zation degree of n = 5 (OEGn = 5) on thermodynamic and ki- netic parameters of human hemoglobin melting, basing of the melting peak analysis. Hemoglobin was derived according to the standard me- thods [Fairbanks, 1971] with some modifications, oxyethy- lated glycerol (Barva, Ukraine) was purified at the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine. Thermograms were recorded with differential adiabatic scanning microcalorimeter DASM-4 (Special Design Bureau for Biological Instrumentation, Pushchino, Moscow Region, Russia). Scan area was from 25 to 90°C and surplus pressure of 2.5 atm. Heating rate was 1 deg/min. B. Sengupta (2005) showed that the process of hemo- globin (HbA) melting was irreversible and could be described by two-stage model N 1k ↔ U 2k →D, included the partial reversible unfolding of the protein (Stage 1) and irreversible denatu- ration (Stage 2). Kinetic analysis is more preferrable in the case of irreversible protein melting [Lyubarev, Kurganov, 2000]. To determine the activation energy we have used in this research one of the four described by Sanchez-Ruiz (1992) approaches, where the ratio of Ea/R can be defined as slope of the dependence ln[vCpex/(∆H – Q)] vs. 1/T, where Ea is activation energy, R is universal gas constant, T is current temperature, ∆H – enthalpy of melting (defined as the area under the curve of dependence of excessive heat capacity vs. temperature), Q is current amount of heat absorbed du- ring denaturation. We calculated the values of the calorimetric enthalpy of melting, activation energy and melting temperatures for he- moglobin solutions supplemented with of various concent- rations of OEG n = 5. Rising content of cryoprotectant in the hemoglobin solution led to the increase in the values of activation energy and decrease in the calorimetric enthalpy and temperature of hemoglobin melting. Thus, we can assu- me that increasing of the cryoprotectant concentration resulted in the loosening of hemoglobin molecules, enabling a reduction of protein thermal stability. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в условиях подавления и стимуляции пролиферации Е.Ю. РОГУЛЬСКАЯ, Е.Б. РЕВЕНКО, Ю.А. ПЕТРЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Differentiation of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal Cells under Suppression and Stimulation of Proliferation O.YU. ROGULSKA, O.B. REVENKO, YU.O. PETRENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 205 Despite a large number of studies on biological proper- ties of mesenchymal stromal cells (MSCs), the tasks regar- ding the correlation between cells proliferative activity and their ability to differentiate in vitro have remained open. The aim of this study was to evaluate the ability of human adipose tissue-derived (ATD) MSCs to differentiate in adipogenic and osteogenic directions under suppression and stimulation of cell proliferation. Human ATD MSCs of the 3rd–4th passages were used in this study. For the inhibition of cell proliferation the cell suspensions were treated with mitomycin-C (MTM-C, 10 µg/ml). Platelet lysate (PL) (in concentrations of 5 and 10%) obtained from whole blood of adult donors was used as a stimulator of cell proliferation. Culture medium contai- ning 10% fetal bovine serum (FBS) was used as the control. To assess metabolic activity of ATD MSCs we used Alamar Blue; proliferation was estimated by cell number increase using direct counting of nuclei. Adipogenic and osteogenic differentiation was induced in media supplemented with spe- cific differentiation factors, and their efficiency was assessed by expression of alkaline phosphatase and accumulation of the lipids, positively stained with Oil Red O. MTM-C treatment led to a complete arrest of cell pro- liferation, while their metabolic activity was preserved. When ATD MSCs were cultured in the control medium (in the pre- sence of FBS), the number of cells to the 7th day increased in 2.7–3.4 times. In the medium containing PL, cell pro- liferative activity was significantly higher, and the number of cells increased in 8–14 times. It was established that after adipogenic and osteogenic induction of cell cultures in the medium containing FBS, the number of differentiated cells was about 35% and 60%, respectively. In MTM-C-treated ATD MSC cultures, the cells preserved the ability to adipo- genic and osteogenic differentiation, but the efficiency of differentiation was lower (about 20% and 35%, respectively). ATD MSCs cultured in the presence of PL had the most pronounced ability to differentiation towards the mentioned directions. In this case more than 95% of the cells were dif- ferentiated. Thus, proliferation arrest of ATD MSCs led to a reduc- tion but not complete loss of cell ability to an induced diffe- rentiation. PL is a promising natural substitute to xenogeneic FBS for the development of MSC culturing technology in regenerative medicine and tissue engineering. Несмотря на большое количество работ, посвящен- ных изучению биологических свойств мезенхимальных стромальных клеток (МСК), вопросы о взаимосвязи про- лиферативной активности клеток и их способности к на- правленной дифференцировке in vitro остаются откры- тыми. Целью настоящего исследования являлась оценка способности МСК жировой ткани (ЖТ) человека к диф- ференцировке в адипогенном и остеогенном направле- ниях в условиях подавления и стимуляции пролиферации. В работе использовали МСК ЖТ человека 3–4 пасса- жей. Для ингибирования пролиферации суспензию МСК ЖТ обрабатывали митомицином-С (МТМ-С, 10 мкг/мл). В качестве стимулятора пролиферации клеток применяли тромбоцитарный лизат (в концентрациях 5 и 10%), по- лученный из цельной крови взрослых доноров. В качест- ве контроля использовали среду культивирования, содер- жащую 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота. Для оценки метаболической активности МСК ЖТ использовали индикатор Alamar Blue, проли- феративную активность определяли по приросту коли- чества клеток путем прямого подсчета ядер. Адипоген- ную и остеогенную дифференцировку проводили в сре- дах, содержащих специфические индукторы, а их эффек- тивность оценивали по экспрессии клетками щелочной фосфатазы или накоплению липидов, позитивно окраши- вающихся Oil Red O. Обработка клеток МТМ-С приводила к полной оста- новке пролиферации, при этом их метаболическая актив- ность сохранялась. При культивировании МСК ЖТ в контрольной среде (в присутствии ЭС) количество клеток на 7-е сутки увеличивалось в 2,7–3,4 раза. В среде, содер- жащей ТЛ, пролиферативная активность клеток была значительно выше, а их количество в культуре увеличи- валось в 8–14 раз. При индукции дифференцировки куль- тур клеток в адипогенном и остеогенном направлениях было выявлено, что в среде, содержащей ЭС, количество дифференцированных клеток составляло около 35 и 60% соответственно. В культурах МСК ЖТ, обработанных МТМ-С, клетки сохраняли способность к адипогенной и остеогенной дифференцировке, однако ее эффектив- ность была ниже (около 20 и 35% соответственно). Наи- более выраженной способностью к дифференцировке в указанных направлениях обладали клетки, культивиро- ванные в присутствии ТЛ. При этом дифференцирова- лось более 95% клеток. Таким образом, остановка пролиферации МСК ЖТ приводит к снижению, однако не к полной потере способ- ности клеток к направленной дифференцировке. ТЛ яв- ляется перспективным природным заменителем ксено- генной ЭС при разработке технологии культивирования МСК для регенеративной медицины и тканевой инжене- рии. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Вплив пептидного комплексу шкіри поросят на метаболічну активність фібробластів у культурі І.Г. БОРИСЕНКО Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків Effect of Peptide Complex of Piglet Skin on Metabolic Activity of Fibroblasts in Culture I.G. BORISENKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 206 Відомо, що пептидний комплекс кріоконсервованих фрагментів шкіри поросят (ПКШП) нормалізує процес репараційної регенерації при опікових і холодових трав- мах. Культура фібробластів може бути зручною моделлю для вивчення тканинноспецифічної біологічної активнос- ті пептидних комплексів даного виду клітин. Мета роботи – вивчити склад і вплив ПКШП на мета- болічну активність фібробластів шкіри щурів в культурі. Одержували ПКШП шляхом інкубації нативних або кріо- консервованих фрагментів шкіри шляхом їх інкубації в фізіологічному розчині протягом 60 хв та видалення термолабільних білків. Для визначення молекулярно-ма- сового розподілу речовин пептидної природи в екстрак- тах використовували високоефективну гельпроникаючу хроматографію. Фібробласти шкіри новонароджених щу- рів культивували в живильному середовищі DMEM/F12 з додаванням сироватки плодів великої рогатої худоби та антибіотиків. Дослідні зразки доповнювали ПКШП у кін- цевій концентрації пептидів 0,1 або 1 мкг/мл, контрольні – еквівалентним об’ємом фізіологічного розчину. Окремі культури витримували протягом 30 хв при температурі 5°С. Метаболічну активність клітин оцінювали по віднов- ленню редокс-індикатора Alamar Blue. При дослідженні розподілу речовин пептидної при- роди в ПКШП за молекулярними масами встановлено, що у виділених з нативних фрагментів шкіри поросят ре- єструються 4 піки, а з кріоконсервованих – 5, і вони міс- тять відносно більшу кількість низькомолекулярних пеп- тидів. При дослідженні дозозалежного впливу ПКШП, одер- жаного з кріоконсервованих фрагментів, на метаболічну активність фібробластів шкіри встановлено, що їх дода- вання в середовище культивування в концентраціях 0,1 та 1,0 мкг/мл збільшує цей показник на 23,2 та 20,5% від- повідно на 3-ю добу культивування. Через добу після витримки культури фібробластів при температурі 4°С інтенсивність флуоресценції відновле- ного Alamar Blue статистично достовірно (р < 0,05) мен- ша, ніж в контролі. При культивуванні фібробластів з додаванням пептидів у кінцевій концентрації 0,1 мкг/мл метаболічна активність фібробластів після впливу гіпо- термії статистично достовірно (р < 0,05) більша, ніж у культурі без додавання пептидів, і не відрізняється від значення цього показника в контролі та в культурі з додаванням пептидів без впливу гіпотермії. На 7-у добу культивування інтенсивність флуорес- ценції в культурі з додаванням пептидів була більшою, ніж в контролі та після гіпотермії в присутності пептидів. Відмінностей в метаболічній активності клітин, що куль- тивувалися в присутності пептидів, не спостерігалося. Peptide complex of cryopreserved piglet skin fragments (PCPS) is known to normalize the regeneration of wounds and cold traumas. The culture of fibroblasts may be the useful model for studying the tissue specific biological acti- vity of peptide complexes of this cell type. The research aim was to investigate the composition and effect of PCPS on metabolic activity of rat skin fibro- blasts in culture. The PCPS were obtained by their incubation in physiological solution during 60 min and removing of thermolabile proteins. To examine the molecular-mass distri- bution of the substances of peptide origin in the extracts we used high effective gel penetrating chromatography. The fibroblasts of newborn rat skin were cultured in nutritive media DMEM/F12 supplemented with fetal calf serum and antibiotics. Tested specimes were mixed with PCPS to get final peptide concentration of 0.1 or 1 µg/ml, the control ones were mixed with the equivalent volume of physiological solution. Separate cultures were maintained for 30 min at 5°C. Metabolic activity of cells was assessed on the reduc- tion of redox indicator Alamar Blue. Investigation of substances of peptide origin in PCPS by molecular mass distribution showed that extracts from native fragments of piglet skin had 4 peaks and the extracts of cryopreserved samples had 5 peaks and additionally they comprised higher content of low molecular peptides. Study of the dose-dependent effect of PCPS derived from cryopreserved fragments on metabolic activity of skin fibroblasts revealed that their introduction into culture me- dium in the concentration of 0.1 and 1 µg/ml increased this index by 23.2 and 20.5% to the 3rd culturing day. In 24 hrs after keeping the culture of fibroblasts at 4°C the fluorescence intensity of the reduced Alamar Blue was statistically and significantly less if compared to the control (p < 0.05). After culturing the fibroblasts with introduced peptides in a final concentration of 0.1 µg/ml the metabolic activity of fibroblasts after hypothermic exposure was statis- tically and significantly higher (p < 0.05) if compared with the culture without introduced peptides and did not differ from the index in the control and in culture enriched with peptides without hypothermic exposure. To the 7th culturing day the fluorescence intensity in culture with introduced peptides was higher than in the control and after hypothermic exposure in the presence of peptides. No differences were found in metabolic activity of cells cultured in the presence of peptides. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Исследование реакции делящихся клеток на оксидативный стресс методом хемилюминесценции И.П. ГОРЯЧАЯ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Study of Dividing Cells Response to Oxidative Stress by Chemiluminescence Method I.P. GORYACHAYA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 207 Данная работа представляет собой продолжение на- чатых исследований по использованию перекрестной адаптации живых систем к стрессу, для поиска путей ис- пользования этого свойства с целью повышения устой- чивости биологических объектов к факторам криокон- сервирования [Зинченко В.Д. и соавт., 2007]. Целью данной работы была разработка способа оп- ределения характера адаптивного ответа клеток на окси- дативный стресс в зависимости от дозы избыточного ок- сиданта в системе. Известно, что при разных дозах окси- данта характер ответа живых клеток может быть следую- щим: стимуляция деления и роста – при низких дозах, обратимая остановка деления и роста – при средних до- зах, апоптоз и некроз – при высоких дозах. Устойчивость к факторам криоконсервирования достигается только во втором из указанных диапазонов доз оксиданта [Зин- ченко В.Д. и соавт., 2005]. Для наблюдения адаптивного ответа клеток на стресс использовали метод хемилюминесценции. С помощью разработанного нами люминометра с фотоэлектрон- ным умножителем ФЭУ-106 хемилюминесценцию ре- гистри-ровали на компьютере электронным осциллог- рафом Hantek DSO 2150 USB. Исследование проводили на дрожжах S. сerevisia и S. boulardii, оксидативный стресс вызывали при помощи озона. В качестве усили- теля люминесценции использовали люминол в концент- рации 10–6 моль/л. Было обнаружено, что при введении в суспензию клеток озонированной дистиллированной воды с кон- центрацией озона 5 мг/л наблюдаются вспышки хемилю- минесценции на интактных клетках и отсутствуют после нагрева клеток до 100°С. Интенсивность вспышек хемилюминесценции сни- жается при последовательном введении порций озони- рованной воды вплоть до полного их исчезновения. Сни- жение интенсивности хемилюминесценции объясняется исчерпанием внутренних ресурсов клетки в состоянии адаптивного ответа на избыток оксиданта. Люминесцент- ный ответ клеток на озон восстанавливается после не- которой выдержки обработанных озоном клеток. Дозовая зависимость люминесцентного ответа кле- ток на оксидант, как индуктор оксидативного стресса, позволяет установить для каждого конкретного вида клеток диапазон доз оксиданта, при которых происходит временная остановка деления и роста клеток. В данном состоянии у клеток наблюдаются эффекты перекрестной адаптации, повышающие их устойчивость к последую- щим холодовым воздействиям. This work represents the continued investigations on the use of cross adaptation of living systems to stress, to find the ways of using this property to rise the resistance of biological objects to cryopreservation factors [Zinchen- ko V.D. et al., 2007]. The research aim was to develop the method for determi- nation of the character of cell adaptive response to oxidative stress depending on the dose of excessive oxidant in the system. It is known that depending on different doses of oxidant the character of living cells' response may be as follows: stimulation of division and growth occurred at low doses, reciprocal inhibition of division and growth were at average doses, apoptosis and necrosis were observed at high doses. Resistance to the cryopreservation factors is achieved only in the second one from the noted ranges of oxidant doses [Zinchenko V.D et al., 2005]. To monitor the cell adaptive response to the stress we used chemiluminescence method. Using developed by us luminometer equiped with the photomultiplier tube FEU- 106 the chemiluminescence data were recorded with Hantek DSO 2150 USB oscilloscope connected to computer. The investigation was performed in S. cerevisia and S. boulardii yeasts, oxidative stress was caused by ozone introduction. Luminol in the concentration of 10–6 mol/l was used as inten- sifier of luminescence. We have noted that introduction of ozonated distilled water with ozone concentration of 5 mg/l into cell suspension led to the chemiluminescence flash appearance in intact cells and no flashes after heating of cells up to 100°C. The intensity of chemiluminescence flash was reduced after step-by-step introduction of ozonated water till total disappearance. The reduction of chemiluminescence inten- sity could be explained by the depletion of internal cell re- courses in the state of adaptive response to the surplus oxidant presence. Luminescence response of cells to ozone is again recovered in ozone-treated cells after some period. The dose dependence of cell luminescence response to an oxidant introduction, as a inducer of oxidative stress, allows to establish for each type of cells the range of oxidant doses in which temporary inhibition of cell division and growth occurs. In this state the cells are observed to have the effects of cross adaptation increasing their resistance to the following cold exposures. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Исследование реакции гепатоцитов на оксидативный стресс с помощью метода хемилюминесценции И.В. ГОВОР НТК «Институт монокристаллов» НАН Украины, г. Харьков Study of Hepatocyte Response to Oxidative Stress by Chemiluminescence Method I.V. GOVOR Institute for Single Crystals of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 208 В работе представлены предварительные результаты по исследованию реакции гепатоцитов на избыточное введение оксиданта. Целью данной работы было определение характера адаптивного ответа клеток на введение озона на разных этапах гипотермического хранения с помощью метода хемилюминесценции. Нами обнаружено, что при порционном введении озонированной дистиллированной воды в изученные биологические объекты возникают короткие вспышки люминесценции. Результатом перехода молекул из воз- бужденного в основное состояние является свечение. Эффекты озона связаны, прежде всего, с воздействием на мембраны. Озон может соединяться с липидами мембран, вызывая перекисное окисление, что приводит к повышению активности антиоксидантной системы. Количество пиков люминесценции в ответ на введение озона прямо пропорционально активности антиокси- дантной системы биологического объекта. Исследование проводили на изолированных гепато- цитах крыс в процессе гипотермического хранения в сахарозосодержащей среде с 1% альбумина. Озон вво- дили порционно в концентрации 5 мг/л. В качестве уси- лителя люминесценции использовали люминол в кон- центрации 10–5 моль/л. Порционное введение озона вызывает люминесцен- цию суспензии изолированных гепатоцитов. С увеличе- нием времени гипотермического хранения уменьшается количество пиков люминесценции в ответ на введение озона. Это связано с тем, что в процессе хранения сни- жаются активность антиоксидантных систем клеток и, как следствие, ответ клеток на избыточное введение озо- на. Таким образом, с помощью данного подхода можно определять функциональную активность клеток. The presentation covers the preliminary results on studying the response of hepatocytes to excessive introduc- tion of an oxidant. The research aim was to examine the character of adap- tive response of cells to administration of ozone at different stages of hypothermic storage using chemiluminescence method. We have found that during stepwise addition of ozo- nated distilled water to the studied biological objects the short luminescence flashes appear. Transition of molecules from the excited state to a main one results in luminescence. Ozone effects are primarily related to its influence onto membranes. Ozone can be bound with membrane lipids, causing lipid peroxidation, leading to a rise in activity of antioxidant system. The number of luminescence acts in response to ozone introduction is directly associated with the activity of antioxidant system in biological object. The studies were performed in isolated rat hepatocytes during hypothermic storage in sucrose-containing medium with 1% albumin. Ozone was stepwise introduced in the concentration of 5 mg/l. As the luminescence enhancer there was used luminol in the concentration of 10–5 mol/l. The introduction of ozone by portions caused the luminescence in suspesion of isolated hepatocytes. The longer was the duration of hypothermic storage the less was the number of luminescence flashes in response to ozone addition. We associate this with the fact that during storage the activity of antioxidant systems in the cells are reduced and this results in lower cell response to excessive ozone introduction. Thus using this method it is possible to estimate the functional activity of cells. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Технология получения криоконсервированных препаратов пробиотиков, иммобилизованных на энтеросорбентах О.М. БАБИНЕЦ, И.П. ВЫСЕКАНЦЕВ, В.Ф. МАРЦЕНЮК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Method of Obtaining Cryopreserved Preparations of Probiotics Immobilized on Enterosorbents O.M. BABINETS, I.P. VYSEKANTSEV, V.F. MARTSENYUK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 209 Для восстановления микробиоты при дисбиозах различного генеза все больше внимания уделяется разра- ботке синбиотиков – препаратов, содержащих микроор- ганизмы-пробиотики и пребиотики. В связи с этим при- обрела актуальность проблема создания препаратов пробиотиков, иммобилизованных на сорбентах, для их хранения применяют низкие температуры и лиофи- лизацию. Целью исследования являлась разработка препаратов пробиотиков, иммобилизованных на энтеросорбентах, и метода оценки сохранности компексов «носитель- клетки», а также изучение их сохранности после крио- консервирования. Объектом исследования являлись дрожжи Saccharomyces boulardii и бактерии Bifidobac- terium bifidum и Lactobacillus bulgaricus. Была изучена активность сорбции клеток микроорга- низмов на ряде энтеросорбентов с различными физико- химическими свойствами и с разной адсорбционной способностью. Наиболее высокие показатели сорбции микробных клеток были установлены для сорбентов «Сорбекс» и «СУМС-1» при температуре сорбции 0...2°C. За основу метода оценки сохранности комплексов «носитель-клетки» был взят метод серийных разведений Коха. Препараты иммобилизованных клеток, содержа- щих примесь свободных клеток, переносили в центри- фужные пробирки, оборудованные специальными ситами с размером ячеек меньше диаметра сорбентов. Свободные клетки осаждали центрифугированием. Ком- плексы «носитель-клетки» переносили из сит в 0,2%-й раствор агара. После серийных разведений в данном растворе образцы вносили в чашки Петри и заливали агаризированной средой. После культивирования под- считывали макроколонии. Каждая макроколония была образована комплексом «носитель-клетки». При сравнительном изучении влияния условий крио- консервирования на свободные и иммобилизованные клетки S. boulardii было установлено, что количество жизнеспособных свободных клеток во всех средах кон- сервирования (физиологический раствор, пивное сусло, 5 и 10%-е растворы сахарозы, 5%-й раствор ДМСО) после охлаждения со скоростью 1 град/мин и отогрева достоверно не отличалось от исходного. С повышением скорости охлаждения сохранность клеток снижалась, достигая минимума при погружении образцов в жидкий азот. Количество КОЕ комплексов «носитель-клетки» после замораживания-отогрева было значительно ниже. Максимальные значения сохранности комплексов также наблюдали после охлаждения со скоростью 1 град/мин и отогрева. To recover microbiota at dysbioses of different genesis the more and more attention is paid to the creation of synbiotics, the preparations containing microorganisms, probiotics and prebiotics. In this connection the task of developing the preparations of probiotics immobilized on sorbents gained an actuality, and its storage requires low temperatures or freeze-drying. The research aim was to develop the preparations of probiotics immobilized on enterosorbents and the method for assessing the integrity of the complexes carrier-cells as well as to investigate their post-thaw survival. Research objects were Saccharomyces boulardii yeasts and Bifido- bacterium bifidum and Lactobacillus bulgaricus bacteria. There has been studied the activity of microorganism cells sorption on some enterosorbents with different physi- cal and chemical properties as well as with different ad- sorption ability. The highest indices of sorption for microbial cells were found for the sorbents Sorbex and SUMS-1 under sorption temperature of 0…2°C. The Koch’s method of serial dilutions was assumed as the basis of assessment method. Preparations of immobi- lized cells containing several free cells were transferred into centrifuge tubes equipped with special sieves with the meshwork dimensions less than the diameter of sorbent particles. Free cells were sedimented by centrifugation. The carrier-cells complexes were transfered from the sieves into 0.2% agar solution. After serial dilutions in this solution the samples were introduced into Petri dishes and embed- ded into agarized medium. Counting of macrocolonies was performed after culturing. Each macrocolony was formed by the carrier-cells complex. During comparative study of the effect of cryopreser- vation conditions on free and immobilized S. boulardii cells we established that the number of viable free cells in all the cryopreservation media (physiological solution, beer wort, 5 and 10% sucrose solutions, 5% DMSO solution) after cooling with the rate of 1deg/min and thawing did not statistically and significantly differ from an initial one. With an increase in cooling rate the cell survival rate reduced and reached its minimum after freezing by plunging the samples into liquid nitrogen. The number of colony forming units of the carrier-cells complexes after freeze-thawing was significantly lower. The maximum values of complexes integrity were also observed after cooling with the rate of 1 deg/min and following thawing. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Склад екстрактів кріоконсервованих фрагментів серця свиней та поросят і їх вплив на організм щурів Л.А. РОГОЗА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Composition of Extracts of Cryopreserved Pig and Piglet Heart Fragments and Their Effect on Rats L.A. ROGOZA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 210 Відомо, що кардіоміоцити є продуцентами значної кількості біологічно активних пептидів. Високу біологіч- ну активність також проявляють пептиди, які входять до складу екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней та поросят. Показано, що вони нормалізують процеси репаративної регенерації і їх вплив є тканинно- специфічним. Мета дослідження – визначити особливості пептидно- го складу екстрактів серця новонароджених поросят (ЕСцП) і статевозрілих свиней (ЕСцС) та дослідити їх вплив на організм щурів різного віку. Екстракти серця одержували з кріоконсервованих (зі швидкістю охолодження 1 град/хв в присутності 10% ПЕО-1500) фрагментів сердець новонароджених поросят і статевозрілих свиней. Молекулярну масу пептидів визначали за методом матрично-активованої лазерної десорбції/іонізації за допомогою приладу «MALDI MS Autoflex II» («Bruker Daltoniks GmbH», Німеччина). Використовували матрицю на основі синапової кислоти (Sinapic Acid – SA, «Fluka», Німеччина). Експерименти були проведені на безпородних білих щурах. Екстракти вводили в черевну порожнину 1-мі- сячним та 4-місячним тваринам із розрахунку 50 мкг на 100 г маси протягом усього експерименту та порівню- вали з контролем на 14 та 28 день. Гістологічні досліджен- ня серцевого м’язу щурів проводили на зрізах завтовшки 6–8 мкм, забарвлених гематоксиліном і еозином за стан- дартною методикою. Для морфологічного аналізу шлу- ночків серця обирали однорідні ділянки і проводили по 9 підрахунків ядер серцевого м’язу для кожного препа- рату. Для обробки зображень використовували програ- му «AxioVision Rel.4.8» («Carl Zeiss», Німеччина). Кількіс- ні результати дослідження обробляли статистично за методом Фішера-Стьюдента. У результаті мас-спектрометричного дослідження виявлено ряд спільних для обох екстрактів пептидів з м.м. 3218 ± 5, 5734 ± 5, 8454 ± 5 і 8568 ± 5. Інші виявлені пептиди специфічні для кожного з екстрактів. Отже, пептидний склад досліджених екстрактів залежить від віку тварин і може бути пов’язаний із віковими особливостями роз- витку серцевого м’язу. Введення ЕСцС або ЕСцП моло- дим та статевозрілим щурам протягом 28 діб не впливало на масу тварин і масу їх сердець. При підрахунку кількості ядерних структур в міокарді щурів на 1 мм2 зрізу тканини серцевого м’яза статистично достовірні відмінності (р < 0,05) спостерігались на 28-у добу в групі молодих щурів, яким вводили ЕСцС або ЕСцП, у порівнянні з контролем. Пептидні комплекси ЕСцС і ЕСцП специфічні для кожного з екстрактів, але при цьому містять і однакові пептиди. Введення екстрактів молодим та статевозрілим щурам протягом 28 діб не впливало на масу тварин і масу їх сердець. При введенні молодим щурам ЕСцС або ЕСцП, на відміну від статевозрілих, спостерігається збільшення щільності ядер клітин в м’язі серця. It is known that cardiomyocytes are producers of a large number of biologically active peptides. Peptides contained in extracts of cryopreserved pig and piglet heart fragments also have a high biological activity. They normalize the pro- cesses of regeneration and their impact is tissue specific. The research aim was to identify the features of peptide composition of newborn piglet (PlHEs) and mature pig (PHEs) heart extracts and determine their effect on the rats of different age. Extracts were obtained from cryopreserved (with the cooling rate of 1 deg/min with 10% PEO-1500) heart fragments of newborn piglets and mature pigs. Molecular mass of peptides was determined by matrix-activated laser desorp- tion/ionization with MALDI MS Autoflex II (Bruker Dal- toniks GmbH, Germany). We used a matrix based on sinapic acid (SA, Fluka, Germany). Experiments were performed in breedless white rats. The extracts were introduced into the peritoneal cavity of 1-month and 4-month-old animals with the concentration of 50 µg per 100 g of weight during the experiment and they were compared with the control in the 14th and 28th days. Histological analysis of rat heart muscle was performed in 6–8 µm sections stained with hematoxylin and eosin by standard methods. For morphological analysis of heart vent- ricles we chose homogeneous areas and did up to 9 counts of cardiac muscle nuclei for each preparation. To process the images we used software AxioVision Rel.4.8 (Carl Zeiss, Germany). Quantitative results of the study were statistically processed by Student-Fischer method. After mass spectrometric study we have established the range of common for both extracts peptides with mole- cular mass of 3218 ± 5; 5734 ± 5; 8454 ± 5 and 8568 ± 5. Other noted peptides were specific for each of the extracts. Thus, the peptide composition of the studied extracts depends on the age of animals and it may be associated with age- related peculiarities of heart muscle. Introduction of PHEs and PlHEs into young and mature rats during 28 days did not affect the weight of animals and weight of their hearts. Calculating the number of nuclear structures in myocardium of rats per 1 mm2 of heart muscle tissue section the statis- tically significant differences (p < 0.05) were observed to the 28th day in the group of young rats introduced with PHEs or PlHEs if compared to the control. Peptide complexes of PHEs and PlHEs are specific for each extract, but they contain the same peptides as well. Introduction of extracts into young and mature rats during 28 days did not influence the weight of animals and weight of their hearts. After the introduction of PHEs and PlHEs into young rats, unlike mature ones, we observed an increase of cell nuclei density in the heart muscle. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Применение альгинатных гидрогелей для замедленной эжекции пептидов сердца поросят в жидкую фазу Т.В. ШКАНД, Н.А. ЧИЖ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Use of Alginate Hydrogels for Slow Ejection of Pig Heart Peptides into Liquid T.V. SHKAND, N.A. CHIZH Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 211 В настоящее время большое внимание уделяется поиску факторов, которые активизируют процессы репа- ративной регенерации миокарда, уменьшают зону нек- роза и восстанавливают паранекротическую область, что предотвращает развитие сердечной недостаточности. В качестве основы для подведения действующего вещества в зону локального повреждения сердца используют кол- лаген, фибрин, а также соли альгиновой кислоты, полу- чаемые из морских водорослей. Цель работы заключалась в изучении динамики эжек- ции пептидов экстрактов сердца новорожденных поросят из гелей альгинатов в жидкую фазу. Для исследования готовили плотные и жидкие формы альгината натрия на основе экстрактов сердца новорожденных поросят (100 мкг пептидов/1 мл). Образцы стерилизовали мето- дом автоклавирования с помощью парового стерилиза- тора при температуре 112°С в течение 20 мин. Скорость эжекции определяли с помощью спектрофотометрии на длинах волн 220–450 нм. Жидкий гидрогель, который может играть роль «за- платы» при инъекционном использовании, форми- руется при 2%-й концентрации альгината. Плотный гидрогель для аппликации на поврежденную поверх- ность сердца образуется при 10%-й концентрации аль- гината натрия. Он может иметь также форму таблеток при помещении в блистер. На 1-е, 3-и и 7-е сутки после посева на питательные среды роста бактерий и грибов не выявлено. При сравнении оптических плотностей вод- ных экстрактов после стерилизации в исследуемых растворах продуктов карамелизации гидрогеля не выяв- лено. На начальном этапе (от 3 до 6 мин) скорость выхода пептидов одинакова из плотного и жидкого гидрогеля. Это свидетельствует о равнозначной динамике процес- сов регистрируемой диффузии пептидов экстракта в геле. При таблетировочной форме плотного геля пептид- ные компоненты экстракта полностью эжектируются за 4–5 мин. Вариация концентрации альгината натрия дает воз- можность получать как жидкую, так и плотную фазы гидрогеля в зависимости от поставленной задачи. Гидро- гели поддаются стерилизации методом автоклави- рования, при этом не разрушаются полимерные цепи альгинатов. Эжекция компонентов экстракта сердца по- росят происходит одинаково эффективно как из жидкого, так и плотного геля. Наибольшую эффективность эжек- ции наблюдали в первые 3–6 мин контакта геля с жидкой фазой. Nowadays much attention is devoted to find the factors that activate reparative regeneration of myocardium, reduce the area of necrosis and reactivate the paranecrotic zone, which prevents the progression of heart failure. As a basis for delivery of active substance to local zone of heart damage collagen, fibrin, and also salts of alginic acid, which were obtained from seaweeds, were used. The aim of this work is the investigation of the dynamics of cardiac ejection of peptide extracts of newborn piglet hearts from alginate gels to liquid phase. Dense and liquid forms of sodium alginate based on the extracts of newborn piglet heart (100 µg peptides per 1 ml) were investigated. The samples were sterilized by autoclaving in the steam sterilizer at 112 °C during 20 min. The ejection rate was determined spectrophotometrically at 220–450 nm. Liquid hydrogel which can serve as a ‘patch’ if injected, is formed under 2% concentration of alginate. Dense hydro- gel suitable for application to the damaged area of heart is formed under 10% concentration of sodium alginate. It could have also the tablet shape if placed into blister. To the 1st, 3rd and 7th day after seeding in nutrient medium no growth of bacteria and fungi was found. When comparing the optical density of aqueous extracts after sterilization in the solutions of hydrogel no caramelization products were found. In the initial phase (from 3 to 6 min) the speed of peptides’ release from dense and liquid hydrogel was equal. This testified to the similar dynamics in the processes of extract peptides’ diffusion inside the gel. In the case of tableted dense gel the peptide components of the extract are completely ejected after 4–5 min. The variation in concentration of sodium alginate allows to receive both liquid and dense phase of hydrogel depen- ding on the task. Hydrogels could be sterilized by the auto- claving with no destruction of alginate polymer chains. Ejection of pig heart extract components occured effectively either from liquid or from a dense gel. The most effective ejection was observed during the first 3–6 minutes of the contact of gel with liquid phase. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Механизмы влияния криоконсервированных препаратов плаценты на репродуктивную функцию в периоде позднего онтогенеза В.Ю. ПРОКОПЮК, О.С. ПРОКОПЮК Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Mechanisms of Cryopreserved Placental Preparation Effect on Reproductive Function in Late Ontogenesis V.YU. PROKOPYUK, O.S. PROKOPYUK Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 212 Увеличение количества поздних браков в Украине, связанных с необходимостью самореализации в общест- ве, порождает проблему продления репродуктивного возраста. Поздний возраст супругов, является причиной бесплодия, генетических нарушений, патологии бере- менности. Эти проблемы чаще возникают у мужчин, которые вступают в брак позже, чем женщины. Ак- туальным остаётся поиск препаратов, которые одновре- менно имели бы свойства геропротекторов и восстанав- ливали репродуктивную функцию, что являлось бы пато- генетически обоснованным для данной группы пациен- тов. Для препаратов плаценты описаны как геропротек- тивные свойства (В.Н. Анисимов, 2003), так и способ- ность влиять на репродуктивную функцию (В.И. Грищен- ко и соавт, 2004). Цель работы – определение механизмов влияния крио- консервированных препаратов плаценты на репродук- тивную функцию в позднем репродуктивном возрасте. В работе использованы 20 самцов крыс линии Wistar в возрасте 18 месяцев, 10 из них произведена подкожная имплантация криоконсервированной ткани плаценты. Контролем были 5-месячные самцы (10). Животные спа- ривались с самками в возрасте 5 месяцев в соотношении 1:2. Проводили гистологическое исследование миокарда, печени, семенников с иммуногистохимическим окраши- ванием на CD95, эндотелин 1, коллаген IV типа, ДНП, РНП. Исследовали репродуктивные показатели, уровень тесто- стерона в динамике, показатели перекисного окисления в сыворотке крови, тканях печени, сердца и семенников. Показано, что использование препаратов плаценты у самца повышает вероятность беременности самки на 40%, при этом количество плодов несколько больше, однако резорбции плодов изредка сохраняются. При морфоло- гическом исследовании семенников отмечались гипер- плазия семенных канальцев с восстановлением полно- ценного клона различных стадий развития сперматоген- ного эпителия, сперматогенез, наличие большого коли- чества сперматозоидов. Гистохимические реакции на ДНП, РНП и ШИК приближались к показателям молодых животных. Иммуногистохимически определяли сниже- ние экспрессии CD 95, коллагена IV в семенниках, повы- шение экспрессии к эндотелину-1. Уровень тестостерона после имплантации плаценты возрастал более чем в 2 раза на срок более 2 месяцев, однако не достигал уровня молодых самцов. В семенниках наблюдались снижение содержания шиффовых оснований, повышение глута- тион-S-трансферазы, подобные изменения отмечены в печени и сыворотке крови. Восстановление репродуктивной функции в герон- тологии при использовании препаратов плаценты объяс- няется ингибированием апоптоза, активацией белоксин- тезирующей функции, антиоксидантных систем. Increased number of late marriages in Ukraine, due to necessity for personal fullfillment in society, creates a problem of reproductive age extension. Late age of spouses is the cause of infertility, genetic disorders, pregnancy pa- thologies. These problems are more common in men who marry later than women. Search for preparations that would simultaneously had geroprotective properties and recover reproductive function, which was pathogenetically proved for this group of patients has remained actual. For placental preparations there were described as geroprotective pro- perties (V.N. Anisimov, 2003), and the ability to affect the reproductive function (V.I. Grischenko et al., 2004). The research aim was to establish the mechanisms of cryopreserved placental preparation effect on reproductive function in late reproductive age. In the research there were used 20 Wistar male rats of 18 months, 10 of them were subcutaneously implanted with cryopreserved placental tissue. Male 5-month-old rats served as the control (10). The animals paired with females of 5 months in the 1:2 ratio. There were histologically exami- ned myocardium, liver, testes using immunohistochemical staining for CD95, endothelin 1, collagen of type IV, DNP, RNP. Reproductive indices, testosterone level in dynamics, peroxidation indices in blood serum, tissues of liver, heart and testes were investigated. It was shown that the application of placental prepa- rations in male increases the chance of female pregnancy by 40%, herewith the number of fetuses was insignificantly higher, but resorption of fetuses was observed in some cases. Morphological analysis of testes revealed hyperpla- sia of seminiferous tubules with restoration of a full value clone of spermatogenic epithelium at various stages of develop-ment, spermatogenesis, a large number of sperma- tozoa. Histochemical DNP, RNP and PAS reactions appro- ximated to the indices of young animals. Immunohisto- chemical analysis found the reduced expression of CD95, collagen IV in testes, increased endothelin-1 expression. Testoste-rone level after implantation of placenta increased more than twice during a period of two months and more, but did not reach the level of young males. There were observed in testes the reduced content of Schiff bases, in- crease of glutathione-S-transferase activity, similar changes were observed in liver and blood serum. Recovery of reproductive function in gerontology using placental preparations could be explained by apoptosis in- hibition, activation of protein-synthesizing function and antioxidant systems. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Влияние экстрактов селезенки и сердца на миокард А.Г. БАБАЕВА, Н.А. ЧИЖ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Spleen and Heart Extracts on Myocardium A.G. BABAYEVA, N.A. CHIZH Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 213 Исследование биологического действия препаратов пептидной природы является одним из перспективных направлений в биологии и регенеративной медицине. Цель работы – изучить влияние экстрактов криокон- сервированных фрагментов селезенки свиней и сердца новорожденных поросят (ЭСцП) на течение некроза миокарда (НМ) после локальной криодеструкции сердца. Крионекроз миокарда моделировали воздействием на стенку левого желудочка крыс инструментом с диа- метром аппликатора 3 мм при температуре рабочей поверхности –196°С в течение 15 с. Электрокардиограм- мы (ЭКГ) регистрировали и анализировали на аппарат- но-программном комплексе «Полиспектр-8/В». Для оценки выраженности воспалительного и резорбционно- некротического синдрома при НМ использовали данные клинических и биохимических анализов. Животных I группы (контроль) подвергали только криовоздействию. Во II группе на фоне эксперимен- тального НМ крысам вводили кардиопротекторный препарат сравнения «Неотон» в дозе 20 мг/100 г живот- ного. В III и IV группы вошли животные после крионек- роза миокарда с введением в брюшную полость экс- тракта селезенки свиней или ЭСцП. Доза пептидов со- ставляла 50 мкг/100 г массы животного. По данным ЭКГ выявлено развитие у всех животных субэпикардиального НМ. Электрокардиографические изменения в контрольной группе, отмеченные через сут- ки после операций, сохранялись во все сроки наблюде- ния. На 14-е сутки на ЭКГ в экспериментальных группах снижалась амплитуда зубца q. У животных I и II групп наблюдался глубокий отрицательный зубец Т. Увеличение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови было незначительным. Повышенная активность аспартатаминотрансферазы у животных экспериментальных групп к 7-м суткам эксперимента возвращалась к уровню нормы в отличие от контрольных крыс. После формирования крионекроза миокарда у жи- вотных всех групп отмечали увеличение индекса де Ри- тиса до 3 (норма 1,8). К 7-м суткам он наиболее снижался во II и IV группах. В контрольной группе на протяжении всего экспери- мента наблюдался сдвиг лейкоцитарной формулы влево. К 30-м суткам в группе с введением экстракта селезенки свиней индекс сдвига лейкоцитов возвращался к уровню нормы. Аналогичная динамика отмечалась и при исследовании индекса интоксикации: к 30-м суткам этот показатель в контрольной группе и у животных, которым вводили «Неотон», оставался на высоком уровне. Study of biological effect of peptide preparations is one of the promising fields in biology and regenerative medicine. The research aim was to study the effect of extracts of cryopreserved fragments of porcine spleen and heart of newborn piglets (EPH) on course of myocardial necrosis (NM) after local cryodestruction of heart. Myocardium cryonecrosis was simulated by treatment of left ventricle myocardial wall of rats with 3 mm applicator cooled down to –196°C during 15 s. Electrocardiograms (ECG) were recorded and analyzed with hardware-software complex Polispektr-8/B. Data of clinical and biochemical analyses were used to estimate inflammatory and resorption- necrotic syndrome intensity under NM. The animals of group I (control) were only cryotreated. Group II rats with experimental NM were treated with reference drug with cardioprotective action Neoton in a do- se of 20 mg per 100g of animal. Group III and IV were the animals with myocardium cryonecrosis and treated by injection of porcine spleen extract or EPH into abdominal cavity. Peptide dose was 50 µg per 100 g of animal weight. According to ECG values we revealed the development of subepicardial NM in all the animals. Electrocardiographic changes in the control group, revealed in a day after the cryotreatment, were observed through all the periods of observation. To the 14th day amplitude of q wave in ECG in the experimental groups decreased. In the animals of groups I and II the deep negative T wave was observed. The increase in alanine aminotransferase activity in blood serum was insignificant. Increased activity of aspar- tate aminotransferase in animals of experimental groups to the 7th day of the experiment turned to the norm if compared with the control rats. After formation of myocardium cryo- necrosis in animals of all groups we revealed an increase of de Ritis index up to 3 (1.8 is a norm). By the 7th day it was decreased maximally in the groups II and IV. In the control group during the whole observation period we observed a shift of leukogram leftward. By the 30th day in the group with injection of pig spleen extract the leukogram turned to the norm. Similar dynamics was obser- ved in the study of intoxication index: to the 30th day this index in the control group and the animals treated with Neoton remained high. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Иммунокорригирующая активность криоэкстракта липидов плаценты в отношении пула CD4+CD25+ Т-клеток крыс при адъювантном артрите М.А. КРАВЧЕНКО, О.В. САФРАНЧУК, О.В. ЧЕЛОМБИТЬКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Immunocorrecting Activity of Placental Lipids Cryoextract in Relation to Pool of CD4+CD25+ T-Cells in Rats with Adjuvant Arthritis M.A. KRAVCHENKO, O.V. SAFRANCHUK, O.V. CHELOMBITKO Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 214 Известный факт иммуномодулирующей активности субстанций липидной природы делает актуальным разработку технологий их получения и применения как лечебных препаратов. В последнее время обращается внимание на возможность их получения из биологи- чески активного тканевого сырья, в частности тканей плаценты, чей липидный состав обусловливает один из механизмов ее иммуносупрессивной активности [Ya- qoob,2004]. Использование для этих целей метода крио- экстракции позволяет минимизировать влияние ряда повреждающих факторов на биологический материал, а также позволяет дифференцированно выделять липид- ную фракцию плаценты (ЛФП) [Осецкий, 2009]. Извест- но, что липидные биомолекулы являются эндогенными лигандами ядерных рецепторов Т-клеток и, таким обра- зом, могут влиять на процессы их периферической диф- ференцировки с образованием индуцированных регуля- торных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ [Wohlfert, 2007]. Целью данной работы было изучить пул CD4+CD25+ Т- клеток в региональных лимфоузлах (л/у) крыс с адъю- вантным артритом (АА) до и после введения ЛФП. Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar. АА индуцировали субплантарным введением полного адъюванта Фрейнда по методу Pearson (1963). ЛФП получали методом криоэкстракции [Осецкий, 2009] из тканей плаценты свиньи, вводили ее с 14-х по 28-е сутки развития АА через день в/м в дозе 100 мг/кг. Содер- жание в л/у CD4+CD25+-клеток определяли методом пря- мой иммунофлуоресценции на проточном цитофлуо- риметре FACSCalibur® с использованием моноклональ- ных антител к мембранным структурам CD4 (РЕ) и CD25 (FITC). Регистрировали процент CD4+CD25+, CD4+CD25high- клеток, а также среднюю интенсивность их флуоресцен- ции. Показано волнообразное изменение изученных по- казателей в динамике развития АА, при этом введение ЛФП животным с патологией максимально приближало значения данных показателей к показателям интактных животных, что клинически сопровождалось снижением выраженности отека лап. Липидная фракция плаценты, полученная методом криоэкстракции, обладает иммунокоррегирующей ак- тивностью в отношении как содержания, так и функцио- нальной активности регуляторных Т-клеток CD4+CD25+, что приводит к снижению выраженности клинических признаков заболевания. Полученные результаты указы- вают на перспективности дальнейшего изучения имму- номодулирующих свойств ЛФП, получаемой методом криоэкстракции, с целью оценки возможности ее клини- ческого применения для лечения заболеваний аутоим- мунного генеза. The known fact of immunomodulating activity of lipid substances makes it topical to develop the technologies for their obtaining and using as medicines. Recently a great attention has been paid to the possibility of their obtaining from biologically active tissue raw materials, particularly from placental tissues, which lipid composition determines one of the mechanisms of its immunosuppressive activity [Yaqoob, 2004]. Cryoextraction method allows to minimize the influence of some damaging factors on biological material during processing as well as to specifically extract the placental lipid fraction (PLF) [Osetsky, 2009]. It is known that lipid biomolecules are endogenous ligands of T-cell nuclear receptors and thereby they can affect the processes of their peripheral differentiation with formation of induced regulatory T-cells with CD4+CD25+ phenotype [Wohlfert, 2007]. The research aim was to study the pool of CD4+CD25+ Т-cells in regional lymph nodes (LN) of the rats with adjuvant arthritis (AA) prior to and after injection of PLF. The experiments were performed in male Wistar rats. Adjuvant arthritis was induced by subplantar injection of complete Freund’s adjuvant according to the method by Pearson, (1963). PLF was obtained by cryoextraction method [Osetsky, 2009] from pig placental tissues. PLF was injected from 14th till 28th days of AA development, every day intra- muscularly in the dose of 100 mg/kg. Content of CD4+CD25+ cells in LN was determined by direct immunofluorescence with flow cytometer FACSCalibur® using monoclonal anti- bodies to CD4 (РЕ) and CD25 (FITC) membrane structures. Percentages of CD4+CD25+, CD4+CD25high cells as well as mean intensity of their fluorescence were recorded. A wave like change of the studied parameters during AA development was demonstrated, and the injection of PLF into the animals with the pathology maximally approxi- mated the values of these parameters to those of intact animals. This was clinically accompanied by a decrease in paw edema intensity. Placental lipid fraction obtained by cryoextraction me- thod possessed an immunocorrecting activity as to both the content and functional activity of regulatory CD4+CD25+ Т-cells thet led to a decrease in intensity of clinical signs of the disease. The results indicated the prospects of further studies of immunomodulating properties of PLF obtained by cryoextraction to estimate the possibility for its clinical application in treating the autoimmune diseases. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Роль моноцитарно-фагоцитарной системы в формировании противовирусной резистентности после введения компонентов криоконсервированного лейкоконцентрата кордовой крови О.Ю. КОЖИНА, Е.А. ПОРОЖАН Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Role of Monocyte-Phagocytic System in Formation of Antiviral Resistance after Introduction of Cryopreserved Cord Blood Leukoconcentrate Components O.YU. KOZHYNA, E.A. POROZHAN Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 215 В первой фазе иммунного ответа на внедрение ви- русного агента происходит активация клеток моноци- тарно-фагоцитарной системы (МФС). В эксперименте на мышах было отмечено формирование резистент- ности к вирусу гриппа после предварительного введения криоконсервированного лейкоконцентрата кордовой крови человека (кЛККЧ), что явилось основанием для дальнейшего изучения механизмов формирования подобного рода невосприимчивости. Цель данной работы: изучение функциональной активности клеток МФС на экспериментальной модели вирусной (грип- позной) инфекции у мышей после превентивного введе- ния цельного кЛККЧ и его компонентов (ядросодер- жащие клетки (ЯСК), плазма). В эксперименте были использованы мыши линии Balb/C массой 18–20 г. Животным (20 в каждой группе) за 6 месяцев до заражения вирусом гриппа вводили: груп- пам 1, 2 и 3 – кЛККЧ, плазму и ЯСК соответственно; 4 – физиологический раствор; 5 – вирус гриппа интраназаль- но (иммунизированные мыши). Контролем служили ин- тактные мыши и незаражённые животные опытных групп. Штамм вируса гриппа А/Виктория имел гемагглю- тинирующий титр 1:256. Интраназально по 0,05 мл/мышь вводили кЛККЧ и его компоненты. У мышей всех групп оценивали состояние клеток МФС перитонеальной по- лости (ПП) на 7 и 14-е сутки. Уровень экспрессии моле- кулы адгезии CD11b (Мас-1) на клетках ПП определяли с помощью моноклональных антител (FITC) anti-mouse CD11b с изотипом Rat IgG2b (BD, США) на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BD, США). Все показатели активности МФС достоверно умень- шались при развитии вирусной инфекции в организме мышей после предварительного введения физиологичес- кого раствора. К 10-м суткам была установлена 100%-я гибель животных. Превентивное введение кЛККЧ и его компонентов оказывало стимулирующее действие на клетки МФС. Однако наиболее сбалансированный эф- фект вызывало введение цельного кЛККЧ, в большей сте- пени за счёт регуляции функциональной активности мак- рофагов и повышения экспрессии CD11b на клетках ПП. Таким образом, стимуляция неспецифического звена иммунного ответа, возможно, и приводила к 85%-й вы- живаемости мышей после заражения летальной дозой вируса гриппа через 6 месяцев от введения кЛККЧ. The cells of monocyte phagocytic system (MPS) are activated in the first phase of immune response to the penetration of viral agent. The experiment in mice allowed observing the formation of resistance to influenza virus after preliminary introduction of cryopreserved human cord blood leukoconcentrate (cHCBL), that served as the basis for further investigating the mechanisms of formation of such a kind of immunity. The research aim was to study the functional activity of MPS cells in experimental model of viral (influenza) infection in mice after preventive intro- duction of the whole cHCBL and its components (nucleated cells (NCs), plasma). In the experiment we used Balb/C mice of 18–20 g weight. The animals (20 in each group) 6 months prior to infection with influenza virus were introduced with cHCBL, plasma and NCs (groups 1, 2 and 3, respectively), physiological solution (group 4), influenza virus intranasally into immu- nized mice (group 5). Intact mice and non-infected animals of the experimental groups served as the control. Strain of A/Victoria influenza virus had hemagglutinating titer 1:256. Cells of cHCBL were introduced intranasally by 0.05 ml per mouse. To the 7th and 14th day we assessed the state of peri- toneal cavity (PC) MPS cells in mice of all the groups. The expression level of adhesion molecule CD11b (Mac-1) in the PC cells was determined with monoclonal antibodies (FITC) anti-mouse CD11b with isotype Rat IgG2b (BD, USA) using flow cytometer FACS Calibur (BD, USA). All the indices of MPS activity were significantly re- duced during viral infection development in mice after pre- liminary introduction of physiological solution. To the 10th day we have observed 100% death of animals. Preventive introduction of cHCBL and its components had a stimulating effect on MPS cells. However the most balanced effect was caused by the introduction of the whole cHCBL, mainly due to the regulation of macrophages functional activity and increased expression of CD11b in PC cells. It could be concluded that probably the stimulation of non-specific link of immune response resulted in 85% survival of mice after infection with a lethal dose of influenza virus after 6 months post introduction of cHCBL. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 Исследование молекулярных механизмов апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после после применения криоконсервированных клеток фетальной печени Е.Е. ЯМПОЛЬСКАЯ, О.М. ШАТНЕВА, Н.А. БОНДАРОВИЧ Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Investigation of Molecular Mechanisms of Apoptotic Processes in Cells of Monocyte-Phagocyte System during Development of Adjuvant Arthritis before and after Application of Cryopreserved Fetal Liver Cells E.YE. YAMPOLSKAYA, O.M. SHATNEVA, N.A. BONDAROVICH Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine 216 Сегодня окончательно сформировалось представ- ление о том, что неспособность иммунокомпетентных клеток к апоптозу может приводить к развитию аутоим- мунных процессов, в том числе и ревматоидному арт- риту (РА). В патогенезе РА значительная роль отводится клеткам моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС), которые проявляют резистентность к различным триггер- ным стимулам апоптоза. Поскольку индукцию апоптоза в иммунокомпетентных клетках рассматривают как один из механизмов, успешно применяемых для купирования нарушений в иммунной системе, одной из новых стра- тегий при лечении РА может быть коррекция апопто- тических процессов в клетках МФС с помощью клеток фетальной печени (КФП). Целью работы было проведение сравнительного ана- лиза влияния криоконсервированных КФП (кКФП) и нативных (нКФП) на клетки МФС, в частности возмож- ность потенциальной регуляции в этих клетках апоптоти- ческих процессов. Исследования проводили на экспери- ментальной модели ревматоидного артрита (РА) челове- ка – адъювантном артрите (АА). На 7-е или 14-е сутки развития АА внутривенно вводили КФП в дозе 5×106 клеток на мышь. В качестве позитивного контроля ис- пользовали лечение дексаметозоном, который является основным препаратом базисной терапии РА. Криокон- сервирование КФП осуществляли под защитой 5% ДМСО по следующей программе: охлаждение со скорос- тью 1 град/мин до –40°С, 10-минутная остановка, охлаж- дение со скоростью 10 град/мин до –80°С и затем погру- жение в жидкий азот. Анализ экспрессии белков каскада CD95 в лизатах клеток МФС проводили с помощью Вес- терн-блоттингa. Каталитическую активность каспаз 3 и 8 в клетках МФС определяли по результатам измерения протеолитического расщепления флуорогенных суб- стратов ZIETD-AFC или AC-DEVD-AMC. Полученные результаты свидетельствуют о способ- ности как нКФП, так и кКФП проявлять апоптозинду- цибельную активность в отношении клеток МФС. Более выраженный проапоптотический эффект зафиксирован после воздействия кКФП на клетки МФС, что может быть объяснено влиянием факторов криоконсервирования на активацию экспрессии различных лигандов для рецепто- ров смерти. Установлено, что положительный эффект вводимых кКФП на 7-е сутки АА сохранялся на протя- жении двух недель после лечения. Различная степень модификации исследуемых показателей ориентирует на необходимость применения КФП в определенные сроки развития патологии. Presently there is an idea about the incapability of immune competent cells to undergo apoptosis could lead to the development of autoimmune processes, including rheumatoid arthritis (RA). In pathogenesis of RA a signi- ficant role is played by the cells of monocyte-phagocyte system (MPS) manifesting the resistance to different trigger stimuli of apoptosis. Since the induction of apoptosis in immune competent cells is considered as one of the mecha- nisms successfully applied for arresting the disorders in immune system, one of novel strategies in treating RA could be the correction of apoptotic processes in the cells of MPS using the introduction of fetal liver cells (FLCs). The research aim was to comparatively analyze the effect of cryopreserved FLCs (cFLCs) and native FLC (nFLCs) on cells of MPS and in particular the possibility of potential regulation of apoptotic processes in these cells. The studies have been carried-out in experimental model of human rheumatoid arthritis, adjuvant arthritis (AA). To the 7th or 14th days of AA development the FLCs were intrave- nously injected in the dose of 5×106 cells/mouse. As positive control we used the treatment with dexamethasone, the main drug in basic therapy of RA. FLCs were cryopreserved under 5% DMSO protection according to the following program: cooling with the rate of 1 deg/min down to –40°C, 10 min stop, cooling with the rate of 10 deg/min down to –80°C and then plunging into liquid nitrogen. The expression of CD95 cascade proteins in lysates of MPS cells was analyzed by means of Western blotting. Catalytic activity of caspases 3 and 8 in MPS cells was examined by the results of mea- suring the proteolytic cleavage of fluorogenic substrates ZIETD-AFC or AC-DEVD-AMC. The findings testify to the ability of both nFLC and cFLCs to manifest apoptosis induction activity in respect of MPS cells. More manifested pro-apoptotic effect was found after the effect of cFLCs on MPS cells that may be explained by the effect of cryopreservation factors on activation of the expression of different ligands for death receptors. It has been established that positive effect of the introduced cFLCs to the 7th day of AA was kept during 2 weeks after treatment. Different extent of modification of the studied indices orientates to the need of applying FLCs in the certain terms of pathology development. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2

Репозитарії

Схожі ресурси