Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей
Мета роботи - порівняння імунної відповіді у мишей при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні фетальних нейральних клітин-прекурсорів (НКП) (Е13-15), а також визначення можливості пригнічення викликаної імунної відповіді....
Gespeichert in:
| Datum: | 2012 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68685 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей / Л.Д. Любич, М.І. Лісяний // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 4. — С. 468-483. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68685 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-686852014-10-05T14:10:03Z Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей Любич, Л.Д. Лісяний, М.І. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Мета роботи - порівняння імунної відповіді у мишей при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні фетальних нейральних клітин-прекурсорів (НКП) (Е13-15), а також визначення можливості пригнічення викликаної імунної відповіді. Целью данной работы было сравнение иммунного ответа у мышей при внутрибрюшинном и внутримозговом введении фетальных нейральных клеток-прекурсоров (НКП) (Е13-15), а также определение возможности угнетения вызванного иммунного ответа. The purpose of the study was to compare immune responces after intraperitoneal and intracerebral introduction of allogeneic fetal neural progenitor cells (NPCs) (Е13-15) and estimate the possibility of suppression of the arised immune response. 2012 Article Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей / Л.Д. Любич, М.І. Лісяний // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 4. — С. 468-483. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68685 612.017.1:591.481.1:591.3:591.881:616-092.9 uk Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| spellingShingle |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Любич, Л.Д. Лісяний, М.І. Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей Проблемы криобиологии |
| description |
Мета роботи - порівняння імунної відповіді у мишей при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні фетальних нейральних клітин-прекурсорів (НКП) (Е13-15), а також визначення можливості пригнічення викликаної імунної відповіді. |
| format |
Article |
| author |
Любич, Л.Д. Лісяний, М.І. |
| author_facet |
Любич, Л.Д. Лісяний, М.І. |
| author_sort |
Любич, Л.Д. |
| title |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| title_short |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| title_full |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| title_fullStr |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| title_full_unstemmed |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| title_sort |
вплив "сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68685 |
| citation_txt |
Вплив "Сандімуну" на розвиток імунної відповіді при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні алогенних фетальних нейроклітин у мишей / Л.Д. Любич, М.І. Лісяний // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 4. — С. 468-483. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT lûbičld vplivsandímununarozvitokímunnoívídpovídíprivnutríšnʹoočerevinnomutavnutríšnʹomozkovomuvvedenníalogennihfetalʹnihnejroklítinumišej AT lísânijmí vplivsandímununarozvitokímunnoívídpovídíprivnutríšnʹoočerevinnomutavnutríšnʹomozkovomuvvedenníalogennihfetalʹnihnejroklítinumišej |
| first_indexed |
2025-07-05T18:30:34Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:30:34Z |
| _version_ |
1836832768886046720 |
| fulltext |
468 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
УДК 612.017.1:591.481.1:591.3:591.881:616-092.9
Л.Д. ЛЮБИЧ*, М.І. ЛІСЯНИЙ
Вплив «Сандімуну» на розвиток імунної відповіді при
внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому введенні
алогенних фетальних нейроклітин у мишей
UDC 612.017.1:591.481.1:591.3:591.881:616-092.9
L.D. LYUBICH*, M.I. LISYANYY
Effect of Sandimmun on Immune Response Development
in Mice after Intraperitoneal and Intracerebral Introduction
of Allogeneic Fetal Neural Cells
Метою даної роботи було порівняння імунної відповіді у мишей при внутрішньоочеревинному та внутрішньомозковому
введенні фетальних нейральних клітин-прекурсорів (НКП) (Е13-15), а також визначення можливості пригнічення викликаної
імунної відповіді. Клітинні суспензії фетальних НКП від мишей-донорів СВА вводили внутрішньоочеревинно або внут-
рішньомозково мишам-реципієнтам С57BL/6 (1×106 клітин на тварину). Частині тварин проводили імуносупресію «Сандімуном»
(циклоспорин А для парентерального введення) у кількості 100 мкг на тварину на 0-, 3-, 6-у добу. Контролем слугували
інтактні тварини. Дослідження алоімунних та антигенспецифічних реакцій проводили через 6, 12, 18 та 37 діб після введення
клітин. Системне (внутрішньоочеревинне) введення фетальних НКП викликало більш виразну клітинну і гуморальну алоімунну
відповідь порівняно з локальним (внутрішньомозковим). Клітинні алоцитотоксичні імунні реакції досягали піку на 6–12-у
добу після імунізації з подальшим поступовим зниженням до 37-ї доби. Призначення «Сандімуну» зменшувало ці прояви при
внутрішньоочеревинному введенні клітин вже з 12-ї доби і суттєво не впливало на даний показник у тварин з внутрішньо-
мозковим введенням. Гуморальні алоцитотоксичні імунні реакції при внутрішньоочеревинному введенні фетальних НКП
досягали максимуму на 12–18-у добу і знижувались з 18-ї по 37-у добу дослідження. Рівень алоцитотоксичних антитіл
знижувався до норми під впливом «Сандімуну» до 37-ї доби. У тварин із внутрішньомозковим введенням клітин рівень
гуморальних алоцитотоксичних імунних реакцій зменшувався з 18-ї доби і суттєво не змінювався за умов впливу «Сандімуну».
Після системного введення фетальних НКП зафіксовано підвищений рівень антитіл до основного білка мієліну (ОБМ) (18-а
доба) та S-100 (37-а доба). У тварин із внутрішньомозковим введенням фетальних НКП розвивалась більш значна специфічна
імунна відповідь на маркерні антигени клітин нервової системи (ОБМ і NSE), яка нарощувалась до 37-ї доби. Корекція
«Сандімуном» дозволяє знизити на 37-у добу рівень нейроаутоантитіл до норми.
Ключові слова: алогенні фетальні нейральні прекурсори, внутрішньоочеревинне введення, внутрішньомозкове введення,
алоцитотоксичні реакції, антитіла до нейроспецифічних білків, «Сандімун».
Целью данной работы было сравнение иммунного ответа у мышей при внутрибрюшинном и внутримозговом введении
фетальных нейральных клеток-прекурсоров (НКП) (Е13-15), а также определение возможности угнетения вызванного
иммунного ответа. Клеточные суспензии фетальных НКП от мышей-доноров СВА вводили внутрибрюшинно или внутримозгово
мышам-реципиентам С57BL/6 (1×106 клеток на животное). Части животных проводили иммуносупрессию «Сандиммуном»
(циклоспорин А для парентерального введения) в количестве 100 мкг на животное на 0-, 3-, 6-е сутки. Контролем были
интактные животные. Исследование аллоиммунных и антигенспецифических реакций проводили на 6-, 12-, 18- и 37-е сутки
после введения клеток. Системное (внутрибрюшинное) введение фетальных НКП вызывало более выраженный клеточный и
гуморальный аллоиммунный ответ по сравнению с локальным (внутримозговым). Клеточные аллоцитотоксические иммунные
реакции достигали пика на 6–12-е сутки после иммунизации с дальнейшим постепенным снижением к 37-м суткам. Назначение
«Сандиммуна» снижало эти проявления при внутрибрюшинном введении клеток с 12-х суток, существенно не влияя на
данный показатель у животных с внутримозговым введением. Гуморальные аллоцитотоксические иммунные реакции при
внутрибрюшинном введении фетальных НКП достигали максимума на 12–18-е сутки и снижались с 18-х по 37-е сутки иссле-
дования. Уровень аллоцитотоксических антител снижался к норме под влиянием «Сандиммуна» к 37-м суткам. У животных с
внутримозговым введением клеток уровень гуморальных аллоцитотоксических иммунных реакций снижался с 18-х сут и
существенно не изменялся под влиянием «Сандиммуна». После системного введения фетальных НКП зафиксирован повышенный
уровень антител к основному белку миелина (ОБМ) (18-е сутки) и S-100 (37-е сутки). У животных с внутримозговым
введением фетальных НКП развивался более значимый специфический иммунный ответ на маркерные антигены клеток нервной
системы (ОБМ и NSE), возрастая к 37-м суткам. Коррекция «Сандиммуном» позволяет снизить на 37-е сутки уровень
нейроаутоантител к норме.
Ключевые слова: аллогенные фетальные нейральные прекурсоры, внутрибрюшинное введение, внутримозговое введение,
аллоцитотоксические реакции, антитела к нейроспецифическим белкам, «Сандиммун».
* Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію: вул.
Платона Майбороди, 32, Київ, Україна 04050; тел.: (+38 044)
483-36-84, електронна пошта: Liubichld@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 32, Platon
Mayboroda str., Kyiv, Ukraine 04050; tel.:+380 44 483 3684,
e-mail: Liubichld@mail.ru
A.P. Romodanov Institute of Neurosurgery of the National
Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
ДУ «Інститут нейрохірургії ім.акад.А.П.Ромоданова НАМН
України», м. Київ
469 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
Recent decades are characterized with a rapid de-
velopment of cell and tissue transplantation as well as
the therapy based on the application of tissues and
cells of embryo-feto-placental complex. Fetal cells and
tissues are more flexible and proliferate faster than
mature structures, and are able to differentiate de-
pending on microenvironment. Fetal cell metabolism
features provide their high resistance to adverse factors
that facilitates the possibility to apply either native or
cryopreserved fetal cells.
Clinical protocols of cell transplantation are present-
ly available for a wide range of diseases and usually
utilize the strategy of cell replacement, and supply of
growth factors [9]. Successful transplantation of neural
stem cells (NSCs) and neural precursor cells (NPCs)
for the replacement of lost or impaired functions of
CNS is possible due to long-term survival of transplanted
cells, their integration with the recipient organism, and
lack of immune complications. The fundamental experi-
mental studies have shown that cryopreserved fetal
nerve cells showed a significant therapeutic effect, as
well as more pronounced immunomodulatory proper-
ties comparing to a native fetal nerve cells, when using
them in the treatment of nervous system impairments
[1–3].
However, the question about the possible ability of
allogeneic NSCs and NPCs induce immune activation
in remote period after transplantation has remained to
be fully resolved. Data on the immunogenic properties
of NSCs in vivo are controversial, as well as the ques-
tion about expression of histocompatibility antigens on
NSCs and NPCs. There is an evidence that human
NSCs are recognized and provoke immune response
in allo- and xenogeneic systems ex vivo, i. e. the level
of their immunological capacity is sufficient to activate
recipient peripheral lymphocytes [22, 33, 34].
Various approaches are applied for suppression of
immune responses in transplantation. e. g. administra-
В останні десятиліття інтенсивно розвиваються
клітинна та тканинна трансплантація і терапія, які
грунтуються на застосуванні тканин і клітин емб-
ріофетоплацентарного комплексу. Фетальні клітини
і тканини мають більшу пластичність та швидкість
проліферації, ніж зрілі структури; здатні диферен-
ціюватись в залежності від мікрооточення. Особ-
ливості метаболізму фетальних клітин забезпе-
чують їх високу стійкість до несприятливих факто-
рів, що обумовлює можливість застосування як на-
тивних, так і кріоконсервованих фетальних клітин.
Клінічні протоколи клітинної трансплантації на
сьогодні створені при широкому спектрі захворю-
вань і звичайно відтворюють стратегію клітинного
заміщення, а також забезпечення ростовими факто-
рами [9]. Успішність трансплантації нейральних стов-
бурових клітин (НСК) та нейральних клітин-прекур-
сорів (НКП) для заміщення втрачених або поруше-
них функцій ЦНС визначається тривалим виживан-
ням пересаджених клітин, інтеграцією з системою
реципієнта, а також відсутністю імунообумовлених
ускладнень. Фундаментальними експерименталь-
ними дослідженнями показано, що кріоконсервовані
фетальні нервові клітини демонструють більш зна-
чущий терапевтичний ефект, а також більш вираже-
ні імуномодулюючі властивості, ніж нативні фе-
тальні нервові клітини, при застосуванні у лікуванні
захворювань нервової системи [1–3].
Проте питання про можливу здатність алогенних
НСК та НКП викликати імунну активацію у відда-
леному періоді після трансплантації залишається
до кінця не вирішеним. Дані щодо імуногенних влас-
тивостей НСК in vivo є неоднозначними, дискусій-
ним залишається питання про експресію антигенів
гістосумісності НСК та НКП. Існують свідчення
того, що НСК людини розпізнаються і викликають
імунну відповідь в ало- і ксеногенних системах
ex vivo, тобто рівень їх імунологічного потенціалу
The purpose of the study was to compare immune responces after intraperitoneal and intracerebral introduction of allogeneic fetal
neural progenitor cells (NPCs) (Е13-15) and estimate the possibility of suppression of the arised immune response. Fetal NPC
suspensions from donor CBA mice were intraperitoneally or intracerebrally introduced to recipient С57Bl/6 mice (1×106 cells per
animal). The part of animals underwent immunosuppression by Sandimmune (cyclosporin A for parenteral administration) in dose of
100 µg per animal on the 0th, 3rd, and 6th days. Intact animals served as the control. Alloimmune and antigenspecific responses were
assessed on the 6th, 12th, 18th, and 37th day after cells introduction. Systemic (intraperitoneal) introduction of fetal NPCs caused more
expressed cellular and humoral immune responses if compared to local (intracerebral) one. The cellular allocytotoxic responses reached
their maximum on the 6–12th day after immunization and thereafter gradually decreased to the 37th day. Sandimmun decreased these
manifestations in mice with intraperitoneal introduction of the cells starting from the 12th day and did not affect significantly this index
in animals with intracerebral introduction. Humoral allocytotoxic responses in mice with intraperitoneal introduction of fetal NPCs
achieved their maximum on the 12–18th day and thereafter decreased starting from the 18th till the 37th day. The level of allocytotoxic
antibodies decreased down to the norm under the effect of Sandimmun to the 37th day. In mice with intracerebral introduction of the
cells the level of humoral allocytotoxic immune responses decreased starting from the 18th day, and was not significantly changed under
the effect of Sandimmun. Increased levels of antibodies against MBP (18th day) and S-100 (37th day) were found in mice with
intraperitoneal introduction of the fetal NPCs. The mice with intracerebral introduction of foetal NPCs were characterized with more
significant immune response to marker antigens of nervous system (MBP and NSE), increased to the 37th day. Sandimmun administration
reduced the neural antibodies level down to the norm to the 37th day.
Key words: allogeneic fetal neural progenitor cells, intraperitoneal introduction, intracerebral introduction, allocytotoxic responses,
antibodies to neurospecific antigens, Sandimmun.
470 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
є достатнім для активації периферичних лімфоцитів
реципієнта [22, 33, 34].
Для пригнічення імунних реакцій при трансплан-
тації застосовують різні підходи: призначення імуно-
супресивних препаратів, моделювання імунологіч-
ної толерантності у реципієнта, застосування для
трансплантації генетично модифікованих НСК. Зок-
рема, за допомогою імуногістохімічних досліджень
показано, що при введенні НСК лінії c17.2 у мозок
щурів з ознаками модельованого паркінсонізму роз-
вивалась клітинна та гуморальна імунна відповідь,
рівень якої значно зменшувався при трансплантації
НСК, трансфікованих геном імуносупресивного
цитокіна ІL-10 [34]. Krystkowiak P. та співавтори
[26] навели результати застосування трансплантації
фетальних нейротканин у пацієнтів з хворобою Хан-
тінгтона: у 4 з 13 хворих діагностовано ознаки ало-
імунізації без відторгнення трансплантата; у 5 з 13
були виявлені біологічні, радіологічні та клінічні оз-
наки процесу відторгнення. У той же час процес
відторгнення був зворотним при застосуванні іму-
носупресивної терапії: активність трансплантата
відновлювалась через 6 місяців. За даними M. Ide-
guchi та співавторів [22] через 2 та 8 тижнів після
нейротрансплантації НКП, отриманих з ембріональ-
них стовбурових клітин мишей, навколо цієї ділянки
спостерігалась акумуляція мікрогліальних/макро-
фагальних клітин і лімфоцитів, що відображує роз-
виток імунної відповіді в алографтах НКП. Але
таких ознак не спостерігали при призначенні цикло-
спорину А: кількість нейронів та астроцитів у ало-
графті була вища в імуносупресованих мишей.
Метою даної роботи було порівняння імунної від-
повіді у мишей при внутрішньоочеревинному та
внутрішньомозковому введенні фетальних НКП
(термін гестації 13–15 діб), а також визначення
можливості пригнічення викликаної імунної відпо-
віді. Для цього використали препарат «Сандімун»
(циклоспорин А для парентерального введення) –
циклічний поліпептид з вираженою імуносупресив-
ною дією, який пригнічує розвиток реакцій клітин-
ного типу і Т-залежне утворення антитіл.
Матеріали та методи
Матеріалом для дослідження були: 1) НКП ми-
шей СВА 13–15 доби гестації; 2) клітини лімфовузлів
дорослих мишей СВА; 3) клітини лімфовузлів
дорослих мишей-реципієнтів C57Вl/6; 4) сироватка
периферичної крові дорослих мишей-реципієнтів
C57Вl/6. Усі роботи з експериментальними твари-
нами проводилися з дотриманням Закону України
«Про захист тварин від жорстокого поводження»,
«Європейської конвенції про захист хребетних тва-
рин, які використовуються для експериментальних
та інших наукових цілей», а також принципів біо-
етики та норм біологічної безпеки.
tion of immunosuppressive agents, simulation of immu-
nological tolerance in the recipient, transplantation of
genetically modified NSCs. In particular, immunohisto-
chemical studies have shown that introduction of the
c17.2 line NSCs to the brain of rats with experimental
Parkinson’s disease led to the development of cellular
and humoral immune response, which degree decreased
significantly after the transplantation of NSCs transfec-
ted with immunosuppressive cytokine IL-10 gene [34].
Krystkowiak et al. [25] presented the results of trans-
plantation of fetal neural tissue in patients with Hunting-
ton’s disease: in 4 of 13 patients they observed the allo-
immunization without graft rejection, in 5 of 13 the bio-
logical, radiological and clinical features of rejection
were found. At the same time, the process of rejection
was reversible if immunosuppressive therapy was ap-
plied: the activity of the transplant recovered after
6 months. According to Ideguchi et al. [22], 2 and 8
weeks post neurotransplantation of NPCs derived from
embryonic stem cells of mice, they observed the accu-
mulation of microglial/macrophage cells and lymphocy-
tes around the transplantation area, which reflected
the development of an immune response in NPC allo-
grafts. However, such signs were not observed if cyc-
losporine A was administered: the number of neurons
and astrocytes in allografts was higher in immune-sup-
pressed mice.
The aim of this study was to compare the immune
responses in mice after intraperitoneal and intracereb-
ral administration of fetal NPCs (gestation term of 13–
15 days), as well as the possibility to suppress the
immune response induced. To do this we applied San-
dimmun (cyclosporin A for parenteral administration),
the cyclic polypeptide with a strong immuno-suppres-
sive effect, which inhibits the development of cell-type
reactions and T-dependent antibody formation.
Materials and methods
As a material for the study served: 1) NPCs of
CBA mice of 13–15 days of gestation; 2) lymph node
cells of adult CBA mice; 3) lymph node cells of adult
recipient C57Bl/6 mice; 4) blood serum of adult reci-
pient C57Bl/6 mice. All the manipulations with expe-
rimental animals were conducted in compliance with
the Law of Ukraine ‘On protection of animals from
cruelty’, and the European Convention for the Protec-
tion of Vertebrate Animals Used for Experimental and
Other Scientific Purposes as well as the principles of
bioethics and biosafety regulations.
NPC suspensions were isolated from the mice brain
of 13–15 days of gestation by the method described
previously [4]. Suspensions of lymphocytes were ob-
tained from lymph nodes (n = 6) mice by mechanical
homogenization of lymph node tissue in RPMI medium,
followed by washing and counting of cells with 3%
CH3COOH solution and 0.2% trypan blue solution.
471 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
Cell suspensions of fetal NPСs from donor CBA
mice were injected intraperitoneally or intracerebrally
(into the right brain hemisphere) in recipient C57Bl/6
mice in amount of 1×106 cells per animal. According to
the procedures performed the following groups of ani-
mals were formed: 1– intraperitoneal introduction of
fetal NCPs (n = 42), 2 – the intracranial introduction of
fetal NCPs (n = 42). Each group of animals comprised a
subgroup (n = 18), where the animals underwent the
immunosuppression with Sandimmun (cyclosporin A
for parenteral administration, Novartis Pharma AG, Swit-
zerland) administered in amount of 100 micrograms per
animal at the 0th, 3rd and 6th day. Intact animals (n = 12)
served as the control. Total number of animals was 96.
After 6, 12, 18 and 37 days after cell introduction
we performed the assessment of alloimmune and anti-
gen-specific reactions. For this purpose, we determined
the cytotoxic activities of recipient lymph node immune
cells and of alloantibodies againsts donor lymph node
cells as well as the level of autoantibodies against neu-
rospecific antigens in recipient sera.
Сytotoxic activity of immune cells was assessed by
MTT colorimetric method. As effector cells we used
lymph node lymphocytes of recipient C57Bl/6 mice
from experimental groups. As target cells we used
lymph node lymphocytes from donor CBA mice. The
effector-target ratio was 5:1. Cytotoxic test was per-
formed under the standard protocol [12]. Cytotoxicity
was expressed as cytotoxic index (CI) in percents:
Ae+t – AeCI = 100 – ( ×100)%,
At
where Ae+t was the value of absorbance in wells with
effectors + target cells; Aedenoted the value of absor-
bance in wells with effector cells; At was the value of
absorbance in wells with targets.
Investigation of cytotoxic activity of alloantibodies
was also carried out by MTT-colorimetric method. As
target cells we used lymph node cells from donor CBA
mice; the cells were incubated during 24 hrs at 37°C
in the presence of serum from recipient C57Bl/6 mice
from experimental groups supplemented with the gui-
nea pig complement (1:10). We used serum dilution of
1:10. Completion of the reaction and recording the re-
sults was performed by the standard protocol [12].
Cytotoxicity was expressed as cytotoxic index (CI) in
percents:
At – As+tCI = 100 – ( ×100)%,
At
where As+t was the value of absorbance in wells with
serum + target cells; At was the value of absorbance
in wells with targets.
Суспензії НКП отримували з мозку мишей 13–
15-ї доби гестації за методикою, описаною раніше
[4]. Суспензії лімфоцитів отримували з лімфовузлів
(n = 6) мишей шляхом механічної гомогенізації
тканини лімфовузлів у середовищі RPMI з подаль-
шим відмиванням та підрахунком клітин з 3%-м
розчином СН3СООН та 0,2%-м розчином трипано-
вого синього.
Клітинні суспензії фетальних НКП від мишей-
донорів СВА вводили ін’єкційним способом внут-
рішньоочеревинно або внутрішньомозково (у праву
півкулю мозку) мишам-реципієнтам С57BL/6 у
кількості 1×106 клітин на тварину. Відповідно фор-
мували групи тварин: 1) внутрішньоочеревинне
введення фетальних НКП (n = 42); 2) внутрішньо-
мозкове введення фетальних НКП (n = 42). Кожна
група мала підгрупу (n = 18), тваринам якої прово-
дили імуносупресію «Сандімуном» (циклоспорин А
для парентерального введення, «Novartis Pharma
AG», Швейцарія) у кількості 100 мкг на тварину на
0-, 3- та 6-у добу. Контролем слугували інтактні тва-
рини (n = 12). Всього було досліджено 96 тварин.
Через 6, 12, 18 та 37 діб після введення клітин
проведено дослідження алоімунних та антигенспе-
цифічних реакцій. З цією метою визначали цито-
токсичну активність імунокомпетентних клітин лім-
фовузлів реципієнтів та цитотоксичну активність
алоантитіл стосовно клітин лімфовузлів донорів, а
також рівень аутоантитіл до нейроспецифічних ан-
тигенів в сироватках реципієнтів.
Дослідження цитотоксичної активності імуно-
компетентних клітин проводилось МТТ-колоримет-
ричним методом. В якості клітин-ефекторів вико-
ристовували лімфоцити лімфовузлів мишей-реци-
пієнтів С57BL/6 експериментальних груп, клітин-
мішеней – лімфоцити лімфовузлів мишей-донорів
СВА. Співвідношення ефектор-мішень складало
5:1. Цитотоксичний тест проводили за стандартним
протоколом [12]. Цитотоксичність виражали цито-
токсичним індексом (ЦІ) у відсотках:
ОГе+м – ОГеЦІ = 100 – ( ×100)%,
ОГм
де ОГе+м – значення оптичної густини в лунках
ефектори + мішені; ОГе – значення оптичної густини
в лунках з ефекторами; ОГм – значення оптичної
густини в лунках з мішенями.
Цитотоксичну активність алоантитіл також дос-
ліджували МТТ-колориметричним методом. В
якості клітин-мішеней використовували лімфоцити
лімфовузлів мишей-донорів СВА, які інкубували в
присутності сироваток мишей-реципієнтів С57BL/6
експериментальних груп з додаванням компле-
менту морської свинки (1:10) 24 год при 37°С. Ви-
користовували розведення сироваток 1:10. Завер-
472 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
The level of humoral autoimmune responses to neu-
rospecific proteins (NSPs) (myeline basic protein
(MBP), S-100, NSE) in serum of animals from experi-
mental groups were determined by solid phase enzymo-
immunoassay [6]. The principle of the method is that
the antibodies from tested sample interact with the
immobilized on a solid phase antigen (NSPs), then bind
the antibodies (secondary), conjugated with the enzy-
me. Amount of bound conjugate is detected by chromo-
genic substrate, and the intensity of appeared color is
proportional to the amount of antibodies in the sample.
We immobilized the antigen on a solid phase (plates of
Dynatech Microtiter, Denmark) at a concentration of
10 mg/ml; 100 ml of antigen was introduced into each
well of the plates. Sorption of antigen lasted 18–20
hours at 4°C and was performed: in 0.1 M citrate-
phosphate buffer, pH 6.0, for MBP; in 0.1 M carbo-
nate-bicarbonate buffer, pH 9.6, for S-100 and NSE.
Removing of non-bound antigen, as well as dilution of
reagents and subsequent removal of non-bound compo-
nents was performed thrice with 0.01 M phosphate
buffer, pH 7.4, supplemented with 0.05% Twin-20. To
block the non-bound sites for preventing the subsequent
non-specific binding, we put 1% bovine serum albumin
into the wells. Studied serum samples diluted 1:100
were introduced in amount of 100 ml, and incubation
lasted 24 hrs. Then we performed triple washing in
phosphate buffer and introduced 100 ml of anti-rabbit
IgG conjugates with horse-radish peroxidase (R&D
Institute for Epidemiology and Microbiology, Russia)
in the operating dilution, selected by titration. The con-
jugates were incubated for 1 h at 20°C, washed-out,
and then 100 ml of the enzyme substrate (0.08% solu-
tion of 5-aminosalicylic acid with 0.05% hydrogen
peroxide) was put into each well. Reaction was stop-
ped after 40 min by addition of 100 µl of NaOH. The
level of autoantibodies was spectrophotometrically
determined by immunoenzyme photoelectric analyzer
AIF-U-01S (Belarus) and expressed in arbitrary units
(a. u. = absorbance of the sample × degree of dilution
of the sample).
Statistical analysis of the results was carried out
using the Statistica 5,0 software package.
Results
It was found that on the sixth day after both intra-
peritoneal and intracerebral introduction of fetal NPCs
a cytotoxic activity of lymph node lymphocytes from
recipient C57Bl/6 mice significantly increased in the
MTT-test regarding lymph node lymphocytes from
donor CBA mice (p < 0.0007 compared with control)
(Fig. 1). Thereafter these indices gradually diminished
from 12th to 37th day (p <0.014–0.004 compared with
6th day), reaching at the end the values of physiological
norm. Moreover, in the group of animals with intra-
peritoneal introduction of fetal NPCs the cytotoxic acti-
шення реакції та реєстрацію результатів проводили
за протоколом [12]. Цитотоксичність виражали ци-
тотоксичним індексом (ЦІ) у відсотках:
ОГм – ОГс+мЦІ = 100 – ( ×100)%,
ОГм
де ОГс+м – значення оптичної густини в лунках си-
роватка + мішені; ОГм – значення оптичної густини
в лунках з мішенями.
Рівень гуморальних аутоімунних реакцій до
нейроспецифічних білків (НСБ) (основний білок
мієліну (ОБМ), S-100, NSE) в сироватках тварин
експериментальних груп визначали твердофазним
імуноферментним методом [6]. Принцип методу
полягає в тому, що антитіла тестованого зразка
взаємодіють з іммобілізованим на твердій фазі ан-
тигеном (НСБ), потім фіксують на собі антитіла
(вторинні), кон’юговані з ферментом. Кількість
зв’язаного кон’югата виявляється за допомогою
хромогенного субстрату, причому інтенсивність за-
барвлення, що розвивається, пропорційна кількості
антитіл у зразках. Антиген іммобілізували на твер-
дій фазі (планшетах фірми «Dynatech Microtiter»,
Данія) в концентрації 10 мкг/мл; в кожну лунку
планшета вносили по 100 мкл антигену. Сорбція
антигену тривала 18–20 год при 4°С і проводилась:
для ОБМ – у цитратно-фосфатному буфері 0,1 М,
рН 6,0; S-100 і NSE – у карбонатно-бікарбонатному
буфері 0,1 М з рН 9,6. Видалення антигену, що не
зв’язався, а також розведення всіх реагентів і на-
ступне видалення компонентів, які не зв’язалися,
проводили тричі з використанням фосфатного
буферу 0,01 М, рН 7,4 з додаванням 0,05%-го
розчину твіну-20. Для заповнення місць, які не
зв’язалися, з метою блокування подальшого неспе-
цифічного зв’язування сайтів в лунки вносили 1%
бичачого сироваткового альбуміну. Досліджувані
зразки сироватки вносили у розведенні 1:100 по 100
мкл, інкубація тривала 24 год. Далі тричі відмивали
фосфатним буфером і вносили по 100 мкл кон’юга-
та антивидових кролячих імуноглобулінів з перокси-
дазою хріну (НДІЕМ ім. акад. Н.Ф. Гамалеї, Росія)
в робочому розведенні, яке підбирали методом
титрування. Кон’югат інкубували протягом 1 год
при 20°С; після відмивання в кожну лунку планшета
вносили по 100 мкл ферментного субстрату (0,08%
розчин 5-аміносаліцилової кислоти з 0,05% перокси-
ду водню). Зупиняли реакцію через 40 хв додаван-
ням 100 мкл NaOH. Рівень аутоантитіл визначали
методом спектрофотометрії в аналізаторі імуно-
ферментному фотоелектричному АІФ-Ц-01С (Біло-
русь) і виражали в умовних одиницях (ум. од. =
оптична густина проби × ступінь розведення дослі-
джуваного зразка).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 6 12 18 37
1
2
3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 6 12 18 37
1a
2a
3
473 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
Статистична обробка отриманих результатів
проводилася з використанням пакета програм «Sta-
tistica 5,0».
Результати
Встановлено, що на 6-у добу як після внутріш-
ньоочеревинного, так і після внутрішньомозкового
введення фетальних НКП достовірно зростала ци-
тотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів
мишей-реципієнтів С57Bl/6 у МТТ-тесті стосовно
лімфоцитів лімфовузлів мишей-донорів СВА (р <
0,0007 у порівнянні з контролем) (рис. 1). В наступні
терміни ці показники поступово знижувались з 12-ї
по 37-у добу (р < 0,014–0,004 у порівнянні з 6-ю
добою), досягаючи в останній термін фізіологічної
норми. При цьому у групі тварин із внутрішньо-
очеревинним введенням фетальних НКП цитоток-
сична активність лімфоцитів лімфовузлів була
достовірно вищою за аналогічний показник тварин
з внутрішньомозковим введенням клітин на 6-у
(р < 0,012), 18-у (р < 0,00071) та 37-у добу (р <
0,049). Призначення «Сандімуну» дозволило знизи-
ти рівень алоцитотоксичної активності у тварин із
внутрішньоочеревинним введенням фетальних
НКП з 12-ї по 37-у добу (р < 0,03 та р < 0,034
відповідно) після імунізації. У тварин з внутрішньо-
мозковим введенням клітин цитотоксична актив-
ність лімфоцитів практично досягала контрольного
рівня вже на 18-у добу, достовірно не відрізняючись
від нього і в подальшому, на 37-у добу дослідження;
імуносупресія «Сандімуном» суттєво не впливала
на даний показник у цих тварин.
При дослідженні сироватки периферичної крові
мишей-реципієнтів С57Bl/6 у МТТ-тесті стосовно
лімфоцитів лімфовузлів мишей-донорів СВА в титрі
1:10 встановлено зростання цитотоксичного індек-
су алоантитіл з 6-ї по 12-у добу в обох групах (р <
0,019), який утримувався на високому рівні протя-
гом 12- 18-ї доби, і наступне його зменшення з 18-ї
по 37-у добу (р < 0,03) (рис. 2). У групі тварин з
внутрішньоочеревинним введенням фетальних
НКП досліджений показник був вищим, ніж у
тварин із внутрішньомозковим введенням, досто-
вірно відрізняючись на 12-у (р < 0,04) та 18-у добу
(р < 0,019). На 37-у добу cпостереження рівень ало-
антитіл у титрі 1:10 залишався підвищеним в обох
досліджених групах (р < 0,05). Корекція «Санд-
імуном» знизила вказаний показник до 37-ї доби
cпостереження у тварин із внутрішньоочере-
винним введенням фетальних НКП (р < 0,05),
суттєво не вплинувши на показник тварин із внут-
рішньомозковим введенням клітин.
При дослідженні рівня аутоантитіл до нейро-
специфічних антигенів встановлено, що рівень ауто-
антитіл до ОБМ (рис. 3, А) у групі тварин із внут-
рішньоочеревинним введенням фетальних НКП
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Ц
ит
от
ок
си
чн
ий
ін
де
кс
, %
C
yt
ot
ox
ic
ity
in
de
x,
%
Рис. 1. Цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів
мишей-реципієнтів C57Bl/6 стосовно лімфоцитів
лімфовузлів мишей-донорів CBA при внутрішньо-
очеревинному і внутрішньомозковому введенні клітин
(МТТ-тест,%): 1 – внутрішньоочеревинне введення
нейроклітин Е13-15 СВА донорів; 1а – внутрішньо-
очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів +
імуносупресія; 2 – внутрішньомозкове введення
нейроклітин Е13-15 СВА донорів; 2а – внутрішньомоз-
кове введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуно-
супресія; 3 – контроль С57BL/6 (інтактні).
Fig. 1. Cytotoxic activity of lymph node lymphocytes of
recipient С57Bl/6 mice regarding lymph node lymphocytes
of donor CBA mice after intraperitoneal and intracranial in-
troduction of the cells (MTT test, %): 1 – intraperitoneal
introduction of E13-15 neural cells of CBA donors; 1a –
intraperitoneal introduction of E13-15 neural cells of CBA
donors + immune suppression; 2 – intracranial introduction
of E13-15 neural cells of CBA donors; 2a – intracranial intro-
duction of E13-15 neural cells of CBA donors + immune
suppression; 3 – control С57BL/6 mice (intact).
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Ц
ит
от
ок
си
чн
ий
ін
де
кс
, %
C
yt
ot
ox
ic
ity
in
de
x,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
0 6 12 18 37
1
2
3
474 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
vity of lymph node lymphocytes was significantly higher
than that of animals with intracerebral administration
of cells on the 6th (p < 0.012), 18th (p < 0.00071) and
37th day (p < 0.049). Administration of Sandimmun
allowed to reduce the allocytotoxic activity in the ani-
mals with intraperitoneal introduction of fetal NPCs
from 12th to the 37th day (p <0.03 and p <0.034, res-
pectively) after immunization. In the animals with intra-
cerebral introduction of cells the cytotoxic activity of
lymphocytes almost reached the control level even to
the 18th day, and there was no significant differences
with the control thereafter, at the 37th day of study, the
immunosuppression with Sandimmun had no significant
influence on the index in these animals.
The assessment of the blood serum of recipient
С57Bl/6 mice by the MTT-test regarding lymph node
lymphocytes from donor CBA mice in the titer of 1:10
revealed the rise in cytotoxic index of alloantibodies
from 6th to 12th day in both groups (p < 0.019), which
was kept at a high level during the 12th to 18th day, and
reduced thereafter from 18 th to 37th day (p < 0.03)
(Fig. 2). In the group of animals with intraperitoneal
introduction of fetal NPCs the studied index was higher
than in the animals with intracerebral administration
of the cells, with significant differences on the 12th
(p < 0.04) and 18th day (p < 0.019). On the 37th obser-
зростав на 18-у добу (р < 0,05), в подальшому не-
значно знижуючись до 37-ї доби спостереження.
В той же час у тварин з внутрішньомозковим вве-
денням фетальних НКП рівень аутоантитіл до
ОБМ зростав з 6-ї по 12-у добу, достовірно пере-
вищуючи контрольні показники (р < 0,00028 і р <
0,032); у подальшому після зниження на 18-у добу
після трансплантації рівень антитіл до ОБМ знову
зростав на 37-у добу, достовірно перевищуючи
контроль (р < 0,05). При цьому даний показник до-
стовірно відрізнявся у групах тварин при різних спо-
собах введення клітин на 6-у (р < 0,017) та 12-у
(р < 0,0092) добу. Застосування імуносупресії «Сан-
дімуном» дозволило знизити досліджуваний по-
казник на 18–37-у добу в обох вказаних групах
тварин.
У групі тварин із внутрішньоочеревинним вве-
денням фетальних НКП рівень аутоантитіл до
S-100 на 6-у добу дослідження достовірно знижував-
ся відносно контролю (р < 0,015), а в подальші тер-
міни підвищувався, зростаючи вище норми на 37-у
добу (р < 0,05) (рис.3, B). Подібну динаміку цей
показник мав у тварин з внутрішньомозковим вве-
денням фетальних НКП: рівень аутоантитіл до
S-100 зростав з 6-ї по 37-у добу, перевищуючи в
останній термін контрольні показники. Призначення
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Ц
ит
от
ок
си
чн
ий
ін
де
кс
, %
C
yt
ot
ox
ic
ity
in
de
x,
%
Рис. 2. Цитотоксичний індекс сироватки периферичної крові (титр 1:10) мишей-реципієнтів C57Bl/6 стосовно
лімфоцитів лімфовузлів мишей-донорів CBA при внутрішньоочеревинному і внутрішньомозковому введенні клітин
(МТТ-тест,%): 1 – внутрішньоочеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів; 1а – внутрішньоочеревинне
введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуносупресія; 2 – внутрішньомозкове введення нейроклітин Е13-15
СВА донорів; 2а – внутрішньомозкове введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуносупресія; 3 – контроль
С57BL/6 (інтактні).
Fig. 2. Cytotoxic index of peripheric blood serum (titer 1:10) of recipient С57Bl/6 mice regarding lymph node lymphocytes of
donor CBA mice after intraperitoneal and intracranial introduction of the cells (MTT test, %): 1 – intraperitoneal introduc-
tion of E13-15 neural cells of CBA donors; 1a – intraperitoneal introduction of E13-15 neural cells of CBA donors + immune
suppression; 2 – intracranial introduction of E13-15 neural cells of CBA donors; 2a – intracranial introduction of E13-15
neural cells of CBA donors + immune suppression; 3 – control С57BL/6 mice (intact).
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Ц
ит
от
ок
си
чн
ий
ін
де
кс
, %
C
yt
ot
ox
ic
ity
in
de
x,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
0 6 12 18 37
1a
2a
3
475 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
vation day the alloantibody level at 1:10 titer remained
elevated in both studied groups (p < 0.05). Correction
by Sandimmun reduced this index to the 37th obser-
vation day in animals with intraperitoneal administration
of fetal NPCs (p < 0.05), and had no significant effect
on the index in animals with intracerebral administration
of cells.
Investigation of the level of autoantibodies against
neurospecific antigens revealed that levels of autoanti-
bodies against MBP (Fig. 3A) in the group of animals
with intraperitoneal introduction of fetal NPCs in-
creased on the 18th day (p < 0.05), and slightly decrea-
sed to 37th day of observation. At the same time in the
animals with intracranial introduction of fetal NPCs
the level of autoantibodies to MBP rised from the 6th
to the 12th day, significantly exceeding the control values
(p <0.00028 and p <0.032), declined thereafter to the
18th day post transplantation, and again increased on
імуносупресії «Сандімуном» дозволило знизити
рівень аутоантитіл до S-100 до 37-ї доби в обох
групах.
Аналіз динаміки рівня аутоантитіл до NSE по-
казав, що у групі тварин із внутрішньоочеревинним
введенням фетальних НКП рівень аутоантитіл до
NSE достовірно знижувався на 12–18-у добу (р <
0,0095), в подальшому підвищуючись до контроль-
них значень до 37-ї доби спостереження (рис. 3, C).
У тварин з внутрішньомозковим введенням фе-
тальних НКП даний показник зростав на 12-у добу
(р < 0,031); у подальшому після зниження на 18-у
добу після трансплантації рівень антитіл до NSE
знову зростав на 37-у добу, достовірно перевищую-
чи контроль (р < 0,05). При цьому даний показник
достовірно відрізнявся у групах тварин при різних
способах введення клітин на 6-у (р < 0,035), 12-у
(р < 0,0014) та 18-у (р < 0,0077) добу. Імуносупресія
Рис. 3. Рівень аутоантитіл до нейроспецифічних білків в
сироватках периферичної крові мишей-реципієнтів
C57Bl/6 при внутрішньоочеревинному і внутрішньомоз-
ковому введенні клітин мишей-донорів CBA (ум. од.):
А – до ОБМ; B – до S-100; C – до NSE; 1 – внутрішньооче-
ревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів; 1а –
внутрішньоочеревинне введення нейроклітин Е13-15
СВА донорів + імуносупресія; 2 – внутрішньомозкове
введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів; 2а – внутріш-
ньомозкове введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів +
імуносупресія; K – контроль С57BL/6 (інтактні).
Fig. 3. Level of autoantibodies against neurospecific pro-
teins in sera of peripheric blood of recipient C57Bl/6 mice
after intraperitoneal and intracranial introduction of the cells
from donor CBA mice (arb. units): A – against MBP; B –
against S-100; C – against NSE; 1 – intraperitoneal introduc-
tion of E13-15 neural cells of CBA donors; 1a – intraperito-
neal introduction of E13-15 neural cells of CBA donors +
immune suppression; 2 – intracranial introduction of E13-15
neural cells of CBA donors; 2a – intracranial introduction of
E13-15 neural cells of CBA donors + immune suppression;
K – control С57BL/6 mice (intact).
Рі
ве
нь
а
ут
оа
нт
ит
іл
, у
м
. о
д.
Au
to
an
tib
od
y
le
ve
l,
ar
b.
u
ni
ts
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Рі
ве
нь
а
ут
оа
нт
ит
іл
, у
м
. о
д.
Au
to
an
tib
od
y
le
ve
l,
ar
b.
u
ni
ts
Термін спостереження, доба
Observation term, days
Рі
ве
нь
а
ут
оа
нт
ит
іл
, у
м
. о
д.
Au
to
an
tib
od
y
le
ve
l,
ar
b.
u
ni
ts
Термін спостереження, доба
Observation term, days
0 6 12 18 37
A B
0 6 12 18 37
0 6 12 18 37
C
476 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
the 37th day, significantly exceeding the control (p <
0.05). Moreover, this index was significantly different
in the groups of animals with different ways of
introduction of the cells on the 6th (p <0,017) and 12th
(p < 0.0092) day. Application of immunosuppression
with Sandimmun allowed to reduce the index on 18–
37th day in both groups of animals.
In the group of animals with intraperitoneal introduc-
tion of fetal NPCs the level of autoantibodies against
S-100 was significantly reduced if compared with the
control (p < 0.015) on the 6th observation day, and in-
creased in next terms, exceeding the norm on the 37th
day (p < 0.05 ) (Fig. 3B). A similar pattern was obser-
ved in the animals with intracranial introduction of fetal
NPCs: the level of antibodies against S-100 grew from
the 6th to the 37th day, exceeding the control values in
the last term. Administration of immunosuppression
with Sandimmun allowed to reduce the level of auto-
antibodies against S-100 to the 37th day in both groups.
The analysis of the level of antibodies against NSE
showed that in the group of animals with intraperitoneal
introduction of fetal NPCs the level of autoantibodies
against NSE was significantly decreased in the 12–
18th day (p < 0.0095), with following rise up to the
control values to 37th day of observation (Fig. 3C). In
animals with intracranial introduction of fetal NPCs
the index increased to the 12th day (p < 0.031); and
after further reduction on the 18th day post transplan-
tation the level of antibodies against NSE rose again
on the 37th day, significantly exceeding the control (p <
0.05). Moreover, this index was significantly different
in the groups of animals with different ways of intro-
ducing the cells on the 6th (p < 0.035), 12th (p < 0.0014)
and 18th (p < 0.0077) day. Immunosuppression with
Sandimmun significantly reduced the level of antibodies
against NSE in groups of animals with the introduction
of fetal NPCs on the 37th day of observation.
Discussion
The conducted research showed that cellular allo-
cytotoxic immune responses were generated in respon-
se to both intraperitoneal and intracerebral introduction
of fetal NPCs with the maximum expression at the 6–
12th day after immunization and subsequent gradual de-
crease to the 37th day. Systemic (intraperitoneal)
introduction of cells caused more expressed cell allo-
immune response if compared to the local (intracereb-
ral) entering cells.
These results, in our opinion, confirm the reported
data that allografts can activate natural and adaptive
immune response [17] and if major histocompatibility
complex (MHC) antigens expression on NSCs is eleva-
ted and co-stimulatory molecules are present they can
induce the effector phase of the immune response invol-
ving T cells and cytotoxic response of natural killers
[30]. Development of cell allocytotoxic reactions after
«Сандімуном» достовірно знижувала рівень ауто-
антитіл до NSE у групах тварин із введенням фе-
тальних НКП на 37-у добу спостереження.
Обговорення
В результаті проведених досліджень показано,
що клітинні алоцитотоксичні імунні реакції ге-
неруються у відповідь як на внутрішньоочеревинне,
так і внутрішньомозкове введення фетальних НКП
з максимальним проявом на 6–12-у добу після
імунізації і подальшим поступовим зниженням до
37-ї доби. Системне (внутрішньоочеревинне) вве-
дення клітин викликало більш виразну клітинну
алоімунну відповідь, порівняно із локальним (внут-
рішньомозковим) введенням клітин.
Ці результати, на наш погляд, підтверджують
літературні дані про те, що алотрансплантати мо-
жуть активувати природну та адаптивну імунну від-
повідь [17] та за умови підвищення на НСК
експресії антигенів головного комплексу гістосу-
місності (ГКГ) і наявності костимуляторних моле-
кул можуть індукувати ефекторну фазу імунної
відповіді із залученням Т-клітин та цитотоксичну
відповідь натуральних кілерних клітин [30]. Роз-
виток клітинних алоцитотоксичних реакцій після
введення алогенних фетальних НКП свідчить про
наявність антигенів ГКГ на клітинах фетального
мозку [5, 7, 11, 13, 27–29], рівень експресії яких є,
вочевидь, достатнім для генерації алоцитоток-
сичної клітинної відповіді і забезпечує розпізнавання
алогенних детермінант як природними кілерами та
цитотоксичними лімфоцитами, так і Т-лімфоцита-
ми-хелперами. При цьому, крім представлення
антигену за допомогою антигенпрезентуючих клі-
тин лімфатичних вузлів реципієнта, не можна ви-
ключати прямого представлення антигену введе-
ними реціпієнту НКП фетального мозку, що експре-
сують молекули ГКГ ІІ класу.
З 12-ї доби реєструвалось зниження алоцито-
токсичної клітинної відповіді реципієнтів на алоанти-
гени мишей-донорів. Можна припустити, що на цю
ланку імунної відповіді введені НКП чинили імуно-
супресивний вплив, що фіксувався вже на 12-у добу
після введення клітин, можливість якого підтвер-
джена даними інших дослідників [13, 15, 20]. Так,
N. Fainstein та співавтори [20] встановили, що НПК
пригнічували in vitro індукцію маркерів активації
Т-клітин (IL-2R-α , PD-1, CTLA) та проліферацію
Т-клітин у відповідь на стимули, опосередковані Т-
клітинним рецептором, а також пригнічували про-
ведення сигналу прозапальних цитокінів в імуно-
цитах. Akesson E. та співавтори [13] при порівнянні
алогенної імунної відповіді на НСК, астроцити та
нейрони встановили, що астроцити експресували
молекули як ГКГ І класу, так і ГКГ ІІ класу, на
тому ж рівні, що і НСК, тоді як нейрони – тільки
477 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
introduction of allogeneic fetal NPCs indicates the
presence of MHC antigens on fetal brain cells [5, 7,
11, 13, 27–29], which expression is apparently suf-
ficient to generate cell allocytotoxic response and
provides recognition of allogeneic determinants by both
natural killers and cytotoxic lymphocytes as well as by
helper T cells. Moreover, along with the presentation
of antigen by lymph node antigen presenting cells of
recipient, one can not exclude the direct presentation
of antigen by MHC II antigen expressing NPCs of
fetal brain introduced to recipient.
From 12th day we observed the decline in cell allo-
cytotoxic response of recipient to alloantigens of donor
mice. We can assume that this component of the immu-
ne response was immunosuppressed by introduced
NPCs that was revealed on the 12th day after intro-
duction of the cells, and this possibility was confirmed
by other researchers [13, 15, 20]. For example, Fain-
stein et al. [20] found that the NPCs suppressed in
vitro the induction of T cell activation markers (IL-
2R-α, PD-1, CTLA) as well as T cell proliferation in
response to stimuli mediated by T cell receptor and
inhibited the signaling of proinflammatory cytokines in
immunocytes. Akesson et al. [13] had compared allo-
genic immune response to NSCs, astrocytes and neu-
rons and had found that astrocytes expressed both
MHC I and MHC II molecules at the same level like
the NSCs, while the neurons did only MHC I mole-
cules. NSCs and astrocytes, unlike neurons, showed
suppressive effect on allogeneic immune response.
Ben-Hur [15] showed that intravenously injected
NPCs did not appeared in CNS, but were transiently
found in lymph nodes and spleen, where they inhibited
the activation and proliferation of T cells. We believe
that a similar mechanism may be implemented by intra-
peritoneal administration of fetal NPCs.
Features of the dynamics of cellular alloimmune
reactions after administration of fetal neural cells (NCs)
can be explained by several mechanisms: direct inter-
action of NSCs or NPCs with T lymphocytes, which
leads to apoptosis or clonal anergy of the latter due to
the lack of co-stimulating signal from co-stimulating
molecules; secretion by NSCs of biologically active
substances with immunosuppressive action; suppres-
sive effect of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lympho-
cytes, being able to inhibit allospecific T cells, conside-
red as a means of inducing immunological tolerance to
allografts for preventing acute and chronic transplant
rejection [10].
Manifestations of cell allocytotoxic reactions were
decreased to the 37th day post transplantation of fetal
NPCs, while the administration of Sandimmun allowed
to reduce these manifestations at the intraperitoneal
introduction of cells, starting from the 12th day. At the
same time, the immunosuppression with Sandimmun
had no significant influence on this index in animals
молекули ГКГ І. Астроцити та НСК, але не нейро-
ни, виявляли супресивний ефект на алогенну імунну
відповідь. Ben-Hur T. показав [15], що при внутріш-
ньовенному введенні НПК останні не потрапляли
в ЦНС, а транзиторно виявлялись у лімфовузлах
та селезінці, де вони пригнічували активацію та про-
ліферацію Т-клітин. На нашу думку, схожий меха-
нізм може реалізуватись при внутрішньоочеревин-
ному введенні фетальних НКП.
Особливості динаміки клітинних алоімунних
реакцій після введення фетальних нейральних клі-
тин (НК) можуть пояснюватись кількома механіз-
мами: безпосередньою взаємодією НСК чи НКП
з Т-лімфоцитами, яка призводить до клональної
анергії чи апоптозу останніх через відсутність ко-
стимулюючого сигналу від костимуляторних моле-
кул; секрецією НСК біологічно активних сполук із
імуносупресивною дією; супресивною дією регуля-
торних Т-лімфоцитів CD4+CD25+Foxp3+, здатних
пригнічувати алоспецифічні Т-лімфоцити, що роз-
глядаються як засіб індукції імунологічної толе-
рантності до алотрансплантатів для попередження
гострого та хронічного відторгнення транспланта-
тів [10].
Прояви алоцитотоксичних клітинних реакцій
зменшувались до 37-ї доби після трансплантації
фетальних НКП, тоді як призначення «Сандімуну»
дозволило зменшити ці прояви при внутрішньооче-
ревинному введенні клітин, починаючи вже з 12-ї
доби. В той же час імуносупресія «Сандімуном»
суттєво не вплинула на даний показник у тварин з
внутрішньомозковим введенням клітин, що можна
пояснити тим, що цитотоксична активність лімфо-
цитів тварин даної групи практично досягала конт-
рольного рівня вже на 18-у добу, утримуючись на
ньому до 37-ї доби дослідження.
При внутрішньоочеревинному введенні клітин
гуморальні алоцитотоксичні імунні реакції досягали
максимуму на 12–18-у добу і знижувались з 18-ї
по 37-у добу дослідження, що узгоджується з дани-
ми X.J. Wang та співавторів [34]. Через місяць піс-
ля внутрішньоочеревинного введення різних типів
клітин реєструвався залишковий рівень алоцитоток-
сичних антитіл, який вдалося знизити призначенням
«Сандімуну». Системне (внутрішньоочеревинне)
введення клітин викликало більш виразну гумораль-
ну алоімунну відповідь, порівняно із локальним
(внутрішньомозковим). У тварин із внутрішньомоз-
ковим введенням клітин рівень гуморальних алоци-
тотоксичних імунних реакцій зменшувався, почи-
наючи з 18-ї доби, і суттєво не змінювався за умов
впливу «Сандімуну».
Зафіксований нами розвиток алоцитотоксичних
реакцій після внутрішньомозкового введення
фетальних НКП мишей СВА імунокомпетентним
мишам С57Bl/6 узгоджується з даними інших
478 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
with intracerebral introduction of cells that can be ex-
plained by the fact that the cytotoxic activity of lym-
phocytes of animals from this group almost reached
the control level already on the 18th day, and kept it to
the 37th day of observation.
After intraperitoneal introduction of cells the humo-
ral allocytotoxic immune responses reached the maxi-
mum at the12–18th day and decreased from the 18th to
the 37th day of the study, which is consistent with the
data of Wang et al. [34]. A month after the intrape-
ritoneal introduction of cells of different types we re-
corded a residual level of allocytotoxic antibodies,
which was successfully reduced by the Sandimmun
administration. Systemic (intraperitoneal) injection of
cells caused a more expressed humoral alloimmune
response compared to the local (intracerebral) one. In
animals with intracerebral introduction of cells the level
of humoral allocytotoxic immune responses decreased
from the 18th day, and has not significantly changed
under the influence of Sandimmun.
Revealed by us development of allocytotoxic reac-
tions after intracerebral introduction of fetal NPCs
from CBA mice to immunocompetent С57Bl/6 mice
is consistent with the data of other authors [16, 22,
23], which showed that the NSCs and NPCs induce
the effector phase of the immune response after the
transplantation to brain. Development of the immune
response to NPC allografts is accompanied by immu-
nodependent loss of transplanted cells [24], accumu-
lation of microglial/macrophage cells and lymphocytes
in allografts, however, the level of immune response is
insufficient for transplant rejection [31].
The dynamics of alloimmune reactions development
obtained in our study is consistent with results of other
authors. In particular, the allotransplantation of cells
from peripheral nervous tissue of С57Bl/6 mice to the
brain of ВАLВ/с mice resulted in significant cell infiltra-
tion in allografts on the 10th day revealed histologically
[31]. Comparing the immune responses in mice of these
lines to grafts of nerves and skin (skin grafts are the
‘gold standard’, their rejection directly correlates with
cellular and humoral response in recipients) established
[32] that in both cases of transplantation there was a
significant cellular immune response with the maximum
on the 14th day. Moreover, the humoral immune res-
ponse reached its peak in the 14th and 21st day with
the increase in antibody titer.
The possibility of cellular and humoral allocytotoxic
reactions when intracerebrally introducing fetal NPCs,
shown in our study, confirms the conditionality of the
concept of ‘immune privileges’ of brain [18, 19, 26,
34]. The opinion, prevailing until recently, considered
the brain as absolutely immune privileged zone that
allowed cell transplants to survive without rejection, is
currently doubt [14, 25]. Brain can be recognized as a
place where the development of the immune response
авторів [16, 22, 23], які показали, що НСК та НПК
індукують ефекторну фазу імунної відповіді при
трансплантації у мозок. При розвитку імунної від-
повіді на алографти НПК виявляється імунозалеж-
на втрата пересаджених клітин [24], акумуляція
мікрогліальних/макрофагальних клітин та лімфо-
цитів у алографтах, проте рівень імунної відповіді
недостатній для відторгнення трансплантата [31].
Динаміка розвитку алоімунних реакцій, отрима-
на в наших дослідженнях, узгоджується з результа-
тами інших авторів. Зокрема, при алотрансплантації
клітин з периферичної нервової тканини мишей
С57ВL/6 у мозок мишей ВАLВ/с на 10-у добу
гістологічно виявлялась значна клітинна інфільт-
рація в алографтах [31]. При порівнянні імунної від-
повіді мишей цих ліній на трансплантати нервів і
шкіри (трансплантати шкіри являють собою «золо-
тий стандарт» – їх відторгнення прямо корелює з
клітинною та гуморальною відповіддю реципієнтів)
встановлено [32], що при обох варіантах трансплан-
тації реєструвалася значна клітинна імунна від-
повідь з максимальним розвитком на 14-у добу. При
цьому гуморальна імунна відповідь з наростанням
титру антитіл досягала піку на 14-у та 21-у добу.
Показана в нашому дослідженні можливість
розвитку клітинних і гуморальних алоцитотоксич-
них реакцій при внутрішньомозковому введенні
фетальних НКП підтверджує умовність концепції
«імунопривілейованості» головного мозку [18, 19,
26, 34]. Донедавна панівна точка зору, згідно з якою
мозок – «абсолютно імунопривілейована зона», що
дозволяє виживати клітинним трансплантатам без
відторгнення, на даний час підлягає сумніву [14, 25].
Мозок може бути визнаний місцем, в якому розви-
ток імунної відповіді є можливим [26], і при схожих
обставинах досягає такої ж сили, як і у периферич-
них зонах. Локальна прозапальна та імунна відпо-
відь у ЦНС при трансплантації є ключовим еле-
ментом, який запускає трофічну відповідь паренхі-
ми ЦНС і стимулює пластичні зміни у нейральних
зв’язках реципієнта [14]. Відомо, що дендритні клі-
тини знаходяться у прямому контакті з спинномоз-
ковою рідиною, і у відповідь на антигенний стимул
мігрують назовні ЦНС у глибокі потилично-шийні
лімфовузли; крім того, у спинномозковій рідині, а
також в уражених ділянках паренхіми ЦНС знахо-
дять Т-, В-клітини та антитіло-продукуючі клітини
[29]. В той же час відомо, що НСК можуть модифі-
кувати імунну відповідь у центральній та перифе-
ричній нервовій системі, посилюючи нейропротек-
торний ефект [21].
Поряд з алоцитотоксичною гуморальною відпо-
віддю, нами досліджено також нейроаутоімунні
гуморальні реакції. Після внутрішньоочеревинного
введення клітин зафіксовано підвищений рівень
антитіл до ОБМ (18-а доба) та S-100 (37-а доба) у
479 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
тварин з введенням фетальних НКП, що свідчить
про потенційну можливість розвитку нейроспе-
цифічних аутоімунних реакцій після внутрішньоо-
черевинного введення попередників НК. Очевидно,
контакт фетальних НКП з антигенпрезентуючими
клітинами реципієнта веде до індукції специфічних
антитілопродукуючих клітин.
У тварин із внутрішньомозковим введенням фе-
тальних НКП розвивалась більш значуща специ-
фічна імунна відповідь на маркерні антигени клітин
нервової системи (ОБМ і NSE), що пов’язано, на
нашу думку, з додатковою антигенною стимуляцією
в результаті порушення гематоенцефалічного
бар’єра в процесі трансплантації клітин. На 37-у
добу рівні аутоантитіл до всіх досліджених нейро-
білків достовірно перевищували нормальний рівень,
знижуючись до контрольних значень лише у групі
з корекцією «Сандімуном», що свідчить про три-
валу аутоімунну відповідь до нейроспецифічних
антигенів, які експресуються клітинами фетального
мозку.
За даними літератури, вміст НСБ збільшується
в процесі дозрівання структур мозку у ссавців і
корелює з функціональним розвитком нервової тка-
нини [8]. Наприклад, S-100 в мозку ембріонів люди-
ни з’являється у спинному, довгастому, середньому
мозку, мості та мозочку у віці 10–15 тижнів прена-
тального онтогенезу. Вважають, що період експо-
ненціального зростання НСБ в онтогенезі співпадає
із закінченням проліферації, диференціювання та
початком функціонування клітин [8]. Виходячи з
вищевикладеного, НКП з фетального мозку миші
13–15-ї доби гестації експресують досліджувані
НСБ на рівні, достатньому для індукції гуморальної
аутоімунної відповіді.
Як відомо, в нормальних умовах у інтактних ор-
ганізмів НСБ присутні у сироватці крові у низьких
концентраціях внаслідок природної загибелі нейро-
клітин [11], а також існує базовий низький рівень
природних аутоантитіл до власних НСБ; в нормі
підтримується динамічна рівновага між рівнями
НСБ та відповідними специфічними аутоанти-
тілами. Можна припустити, що при внутрішньо-
очеревинному введенні фетальних НКП частина
клітин потрапляє у лімфовузли та селезінку, де вони
контактують з антигенпрезентуючими клітинами
та індукують специфічні антитілопродукуючі клі-
тини. У результаті здійснення ефекторної функції
алоцитотоксичних лімфоцитів та антитіл інша час-
тина фетальних клітин гине, вивільняючи НСБ, які
зв’язуються циркулюючими природними аутоанти-
тілами і таким чином відтерміновують наростання
титрів нейроаутоантитіл, чим пояснюється розвиток
нейроаутоімунної гуморальної відповіді у більш
пізній термін (18–37-а доба), ніж алоцитотоксичної
(6–18-а доба), а також зменшення нижче контролю
is possible [26], which in similar circumstances achie-
ves the same power as in the peripheral areas. Local
proinflammatory and immune response in the CNS at
transplantation is a key element that triggers trophic
response in CNS parenchyma and promotes plastic
changes in recipient’s neural network [14]. It is known
that dendritic cells are in direct contact with the cereb-
rospinal fluid, and in response to antigenic stimulus mig-
rate outside the CNS into deep occipital-cervical lymph
nodes; moreover, T, B cells and antibody-producing
cells were found in the cerebro-spinal fluid and in the
affected areas of the CNS parenchyma [29]. At the
same time, it is known that the NSCs can modify the
immune response in the central and peripheral ner-
vous system, increasing the neuroprotective effect [21].
Along with humoral allocytotoxic response, we also
investigated humoral neuroautoimmune responses. Af-
ter intraperitoneal introduction of the cells we revealed
an elevation in levels of antibodies against MBP (18th
day) and S-100 (37th day) in animals with the intro-
duction of fetal NPCs, that indicated the probable de-
velopment of neurospecific autoimmune reactions after
intraperitoneal introduction of NC progenitors. Ob-
viously, the contact of fetal NPCs with recipient’s anti-
gen presenting cells leads to the induction of specific
antibody producing cells.
In animals with intracranial introduction of fetal
NPCs we observed a significant specific immune res-
ponse to marker antigens of cells of the nervous system
(MBP and NSE), caused, in our opinion, by additional
antigenic stimulation due to impairments in the blood-
brain barrier after transplantation of the cells. On the
37th day the levels of autoantibodies against all inves-
tigated neural proteins significantly exceeded the nor-
mal levels, decreasing to the control values only in the
group with Sandimmun correction, indicating a long-
term autoimmune response to neurospecific antigens
being expressed by fetal brain cells .
According to the reported data, the amount of NSPs
increases during maturation of brain structures in mam-
mals and correlates with the functional development
of the nervous tissue [8]. For example, S-100 in human
fetal brain appears in spinal cord, macromyelon, mid-
brain, pons cerebelli and cerebellum at the age of
10–15 weeks of prenatal ontogenesis. It is believed
that the period of exponential rise in NSP content during
ontogenesis coincides with the termination of proli-
feration, differentiation and following start of cells’
functioning [8]. In terms of above stated, the NPCs of
fetal mice brain of 13–15 days of gestation express
the studied NSPs at a level being sufficient to induce
humoral autoimmune response.
The NSPs are known to be present in serum at
low concentrations even under normal conditions in
intact organisms due to natural death of neural cells
[11] as well there is a basic low level of natural autoanti-
480 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
рівнів аутоантитіл до S-100 (6-а доба) та NSE (12–
18-а доба).
При внутрішньомозковому введенні фетальних
НКП індукція аутоімунних реакцій до НСБ може
відбуватись за наступними механізмами: а) захват
НСБ у тканині мозку дендритними клітинами (із
міжклітинної та спинномозкової рідини), їх актива-
ція та розвиток класичної імунної відповіді з генера-
цією антитіл; б) поглинання тканинними макрофа-
гами та макрофагами периферичної крові НСБ, що
вийшли за межі мозку; в) деградація НСБ тканин-
ними протеазами [11]. В той же час відмінність у
динаміці алоцитотоксичної та нейроаутоімунної гу-
моральної відповіді при внутрішньомозковому
введенні фетальних НКП, очевидно, свідчить про
процеси деструкції загиблих імплантованих клітин
внаслідок розвитку реакції відторгнення, а також
процеси активізації функції та проліферації різних
популяцій клітин в зоні вогнища імплантації та на
віддаленні від неї, які супроводжуються, вочевидь,
зростанням виходу НСБ через лікворні простори у
кров, контактом з антигенпрезентуючими клітина-
ми та індукцією специфічних антитілопродукуючих
клітин. Крім того, циркулюючі природні аутоанти-
тіла до НСБ у ранні терміни можуть зв’язувати
НСБ, що вивільняються, і таким чином дещо від-
терміновувати наростання титрів нейроаутоантитіл,
чим пояснюється розвиток нейроаутоімунної гумо-
ральної відповіді у більш пізній термін, ніж алоцито-
токсичної.
Таким чином, поряд з імунною відповіддю на
алоантигени системи ГКГ, експресовані на фе-
тальних НКП, розвивається довготривала ауто-
імунна відповідь на нейроантигени. Корекція «Сан-
дімуном» в дозі 100 мкг на 0-, 3- та 6-у добу доз-
воляє знизити рівень нейроаутоантитіл на 37-у добу
до норми.
В наших дослідженнях застосування циклоспо-
рину А в дозі 100 мкг на тварину трикратно сприяло
зменшенню проявів імунних реакцій алогенного та
нейроаутоімунного спрямування, що узгоджується
з опублікованими даними [31]. Однак не у всіх ви-
падках нами досягнуто значного імуносупресив-
ного ефекту при використаних дозах та трикратно-
му режимі введення «Сандімуну».
Таким чином, необхідно враховувати, що як при
внутрішньомозкому, так і внутрішньоочеревинному
введенні фетальних НКП гуморальна відповідь
може розвиватись не тільки до алоантигенів, але й
до специфічних нейроантигенів. Використання іму-
носупресорного препарату «Сандімун» дозволяє
значно знизити прояви реакцій трансплантаційного
імунітету та рівень гуморальної нейросенсибілізації,
що обґрунтовує показання до обов’язкового засто-
сування імуносупресії при клінічній нейротранс-
плантації клітин фетального мозку.
bodies against own NSPs; and there is normally a dyna-
mic equilibrium between the levels of NSPs and related
specific autoantibodies. One can assume that the intra-
peritoneal introduction of fetal NCPs is followed by
appearing of the part of the cells in the lymph nodes
and spleen, where they come in contact with antigen
presenting cells and induce specific antibody producing
cells. As a result of effector function of allocytotoxic
lymphocytes and antibodies the rest of fetal cells die,
releasing NSPs that are bound by circulating natural
antibodies, and thereby postpone the increase in titers
of neural autoantibodies. This explains the development
of humoral neuroautoimmune responses in more later
period (18th–37th day) comparing to allocytotoxic one
(6th–18th day), and the decrease below the control levels
of antibodies against S-100 (6th day) and NSE (12th–
18th day) as well.
Induction of autoimmune reactions to the NSPs
after the intracranial introduction of fetal NPCs may
occur by the following mechanisms: a) capturing NSPs
in brain tissue by dendritic cells (from interstitial and
cerebrospinal fluid), their activation and development
of classical immune response with antibodies formation;
b) absorption of NSPs outside the brain by tissue mac-
rophages and peripheral blood macrophages; c) NSPs
degradation by tissue proteases [11]. At the same time,
the difference in the dynamics of allocytotoxic and neu-
roautoimmune humoral responses after intracerebral
introduction of fetal NPCs clearly indicates the proces-
ses of degradation of implanted cells died due to rejec-
tion reactions as well as denotes the activation of the
function and proliferation of different cell populations
in the implantation locus and around it, that are appa-
rently accompanied by an increased NSP peripherali-
zation through liquor, its contact with antigen presenting
cells and induction of specific antigen producing cells.
Moreover, the circulating natural antibodies against
NSPs can bind released NSPs in the early stages, and
thereby fairly postpone the increase of neural alloanti-
body titers, which explains the development of neuro-
autoimmune humoral responses in more later period
than allocytotoxic one.
Thus, along with the immune response to MHC anti-
gens, expressed on fetal NPCs, the long-term auto-
immune response to neuroantigens develops. Correc-
tion with Sandimmun in amount of 100 micrograms on
the 0th, 3rd and 6th day reduces the level of neural auto-
antibodies on the 37th day down to the norm.
In our studies, the application of cyclosporine A in
amount of 100 µg per animal, thrice, contributed to
reduction of symptoms of immune reactions of alloge-
neic and neuroautoimmune character, which is con-
sistent with the reported data [31]. However, we have
not succeded in all cases to achieve a significant immu-
nosuppressive effect in the case of utilized dosage and
triple injection of Sandimmun.
481 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
Висновки
1. Системне (внутрішньоочеревинне) введення
фетальних НКП викликало більш виразну клітинну
і гуморальну алоімунну відповідь, порівняно із
локальним (внутрішньомозковим).
2. Клітинні алоцитотоксичні імунні реакції ге-
неруються у відповідь як на внутрішньоочеревинне,
так і внутрішньомозкове введення фетальних НКП
з максимальним проявом на 6–12-у добу після
імунізації і подальшим поступовим зниженням до
37-ї доби. Призначення «Сандімуну» зменшувало
ці прояви при внутрішньоочеревинному введенні
клітин, починаючи вже з 12-ї доби, суттєво не впли-
ваючи на даний показник у тварин з внутрішньо-
мозковим введенням.
3. Гуморальні алоцитотоксичні імунні реакції
при внутрішньоочеревинному введенні фетальних
НКП досягали максимуму на 12–18-у добу і зни-
жувались з 18-ї по 37-у добу дослідження. Рівень
алоцитотоксичних антитіл знижувався до норми під
впливом «Сандімуну» до 37-ї доби. У тварин із
внутрішньомозковим введенням клітин рівень гу-
моральних алоцитотоксичних імунних реакцій
зменшувався, починаючи з 18-ї доби, і суттєво не
змінювався за умов впливу «Сандімуну».
4. Після системного введення фетальних НКП
зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ
(18-а доба) та S-100 (37-а доба). У тварин із внут-
рішньомозковим введенням фетальних НКП розви-
валась більш значуща специфічна імунна відповідь
на маркерні антигени клітин нервової системи
(ОБМ і NSE), яка нарощувалась до 37-ї доби.
Корекція «Сандімуном» в дозі 100 мкг на 0-, 3- та
6-у добу дозволяє знизити рівень нейроаутоантитіл
на 37-у добу до норми.
Thus, it should be considered, that after both intra-
cerebral and intraperitoneal introduction of fetal NPC
the humoral response may develop not only to alloanti-
gens, but also to specific neural antigenes. Administ-
ration of immune suppressing medication Sandimmun
can significantly reduce the manifestations of transplan-
tation immunity reactions as well as the humoral neuro-
sensibilization level, that validates the indications for
mandatory application of immunosuppression during
clinical neurotransplantation of fetal brain cells.
Conclusions
1. Systemic (intraperitoneal) injection of fetal NPCs
caused more expressed cellular and humoral alloimmu-
ne response if compared to the local (intracerebral) one.
2. Cellular allocytotoxic immune responses are
generated in response to both intraperitoneal and intra-
cerebral introduction of fetal NPCs with maximum ex-
pression at the 6–12th day after immunization and
following gradual decrease to the 37th day. Administra-
tion of Sandimmun reduced these manifestations after
intraperitoneal introduction of the cells, starting already
from the 12th day, and without significant effect on the
index in animals with intracerebral introduction.
3. Humoral allocytotoxic immune responses after
intraperitoneal introduction of fetal NPCs reached their
maximum at the 12–18th day and decreased from the
18th to the 37th day of the study. Level of allocytotoxic
antibodies decreased to the norm to the 37th day under
the influence of Sandimmun. In animals with intrace-
rebral introduction of cells the level of humoral
allocytotoxic immune responses decreased from the
18th day, and has not changed significantly under the
influence of Sandimmun.
4. After systemic administration of fetal NPСs the
elevated levels of antibodies against MBP (18th day)
and S-100 (37th day) was revealed. In animals with
intracranial introduction of fetal NPCs there was a
significant specific immune response to marker anti-
gens of cells of the nervous system (MBP and NSE),
increasing to the 37th day. Correction by Sandimmun
in dose of 100 micrograms at the 0th, 3rd and 6th day
reduces the level of neural antibodies on the 37th day
down to the norm.
Література
1.Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гаевская Ю.А. и др. Криобио–
логические технологии как компонент оптимизированных
методов лечения аутоиммунных заболеваний // Клінічна
імунологія. Алергологія. Інфектологія. – 2009. – №1–2 (20–
21). – С.46–51.
2.Гольцев А.Н., Порожан Е.А., Бабенко Н.Н., Останков М.В.
Апоптотические процессы в тимусе и головном мозге при
развитии экспериментального аллергического энцефа-
ломиелита до и после лечения фетальными нервными
клетками // Патология. – 2011. – Т. 8, №2. – С. 69–71.
3.Гольцев А.Н., Порожан Е.А., Останков М.В. и др. Роль нату-
ральних Т-регуляторных клеток в патогенезе эксперимен-
тального аллергического энцефаломиелита и возможные
пути коррекции данной патологии криоконсервированными
фетальными нервными клетками // Імунологія та
алергологія: наука і практика. – 2012. – №1.– С. 57–66.
4.Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д. и др. Длительное
культивирование in vitro криоконсервированных и натив-
ных нейроклеток эмбрионов человека //Укр. нейрохірургіч-
ний журнал. – 2003. – №2. – С. 11–14.
References
1.Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gayevskaya Yu.A. et al. Cryo-
biological technologies as a component of optimized methods
of treating autoimmune diseases // Klinichna Imunologiya. Alergo-
logiya. Infektologiya. – 2009. – N1–2 (20–21). – P. 46–51.
2.Goltsev A.N., Porozhan Ye.A., Babenko N.N., Ostankov M.V.
Apoptotic processes in thymus and brain at experimental
allergic encephalomyelitis prior to and after treating with fetal
neural cells // Patologiya. – 2011. – Vol. 8, N2. – P. 69–71.
482 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
5.Лісяний М.І., Любич Л.Д., Семенова В.М. та інш. Дослі-
дження експресії антигенів HLA нейроклітинами людини
різного терміну гестації in vitro // Імунологія та алергологія. –
2008. – №1. – С. 14–19.
6.Лісяний М.І., Любич Л.Д., Черченко А.П., Верхоглядов Ю.П.
Дослідження рівня аутоантитіл до нейроспецифічних білків
у кролів після алогенної внутрішньомозкової трансплантації
ембріональних клітин-попередників нервової системи //
Фізіологічний журнал. – 2006. – Т. 52, №3. – С. 64–69.
7.Любич Л.Д., Лисяный Н.И., Семенова В.М., Стайно Л.П.
HLA-антигенная характеристика нативных и культиви-
руемых нейроклеток фетального и постнатального голов-
ного мозга человека // Клеточные культуры. Информацион-
ный бюллетень. Выпуск 25. – СПб.: Изд-во Политех. ун-та,
2010.– С. 47–59.
8.Никандров В.Н., Чаплинская Е.В. Протеин S–100: структур-
но-функциональные свойства и роль в нервной ткани //
Біополімери і клітина. – 2005. – Т. 21, №1. – С. 12–27.
9.Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Рабинович С.С. и др. Транс-
плантация фетальных клеток в лечении неврологических
расстройств // Клеточная трансплантация и тканевая ин-
женерия. – 2008. – Т. 3, №1. – С. 49–56.
10.Сергеев В.С. Предотвращение острого и хронического
отторжения трансплантатов у мышей адоптивным введе-
нием CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-лимфоцитов // Кле-
точная трансплантация и тканевая инженерия. – 2008. –
Т. 3, №4. – С.10–12.
11.Чехонин В.П., Лебедев С.В., Гурина О.И. и др. Элиминация
нейроспецифических белков из ЦНС (патогенетические и
методические аспекты) // Вестник Российской АМН. –
2006. – №6. – С. 3–12.
12.Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И. МТТ-колори-
метрический метод определения цитотоксической актив-
ности естественных киллерных клеток // Клин. лаб.
диагностика. – 2000.– №2. – С. 20–23.
13.Akesson E., Wolmer–Solberg N., Cederarv M. et al. Human
neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress
an allogeneic lymphocyte response // Stem Cell Res.– 2009.–
Vol. 2, №1. – P. 56–67.
14.Barker R.A, Widner H. Immune problems in central nervous
system cell therapy // NeuroRx.– 2004.– Vol.1, №4.– P. 472–
481.
15.Ben-Hur T. Immunomodulation by neural stem cells // J. Neurol.
Sci. – 2008. – Vol. 265, №1–2. – P. 102–104.
16.Chen Z., Palmer T.D. Cellular repair of CNS disorders: an im-
munological perspective // Hum. Mol. Genet. – 2008. – Vol. 17,
№1. – P. 84–92.
17.Czeonkowska A., Kurkowska-Jastrzebska I., Czeonkowski A.
et al. Immune processes in the pathogenesis of Parkinson's di-
sease – a potential role for microglia and nitric oxide // Med.
Sci. Monit. – 2002. – Vol. 8, №8. – P. 165–177.
18.D'Mello C., Le T., Swain M.G. Cerebral microglia recruit mono-
cytes into the brain in response to tumor necrosis factoralpha
signaling during peripheral organ inflammation // J. Neurosci. –
2009. – Vol. 29, №7. – P. 2089–2102.
19.Engelhardt B. The blood-central nervous system barriers acti-
vely control immune cell entry into the central nervous system //
Curr. Pharm. Des. – 2008. – Vol.14, №16. – P. 1555–1565.
20.Fainstein N., Vaknin I., Einstein O. et al. Neural precursor
cells inhibit multiple inflammatory signals // Mol. Cell Neurosci. –
2008.– Vol. 39, №3. – P.335–341.
21.Graber J.J., Dhib-Jalbut S. Protective autoimmunity in the
nervous system // Pharmacol. Ther. – 2009.– Vol. 121, №2.–
P. 147–159.
22.Ideguchi M., Shinoyama M., Gomi M. et al. Immune or inflamma-
tory response by the host brain suppresses neuronal differen-
tiation of transplanted ES cell-derived neural precursor cells //
J. Neurosci. Res. – 2008. – Vol. 86, №9. – P. 1936–1943.
23.Imitola J., Comabella M., Chandraker A.K. et al. Neural stem/
progenitor cells express costimulatory molecules that are diffe-
rentially regulated by inflammatory and apoptotic stimuli // Am.
J. Pathol. – 2004. – Vol. 164, №5. – P. 1615–1622.
3.Goltsev A.N., Porozhan Ye.A., Ostankov M.V. et al. Role of
natural regulatory T cells in pathogenesis of experimental
allergic encephalomyelitis and possible ways of correction of
this pathology by cryopreserved fetal neural cells // Imunologiya
ta Alergologiya: Nauka i Praktika. – 2012. – N1.– P. 57–66.
4.Zozulya Yu.A., Lisyanyy N.I., Lyubich L.D. et al. Long-term
culture in vitro of cryopreserved and native neural cells of
human embryos // Ukr. Neurokhirurgichnyy Zhurnal. – 2003. –
N2. – P. 11–14.
5.Lisyanyy M.I., Lyubich L.D., Semenova V.M. et al. Investigating
the in vitro expression of HLA antigens by human neural cells
of different gestation terms // Imunologiya ta Alergologiya. –
2008. – N1. – P. 14–19.
6.Lisyanyy M.I., Lyubich L.D., Cherchenko A.P., Verkhoglya-
dov Yu.P. Investigation of the level of autoantibodies against
neurospecific proteins in rabbits after allogeneic intracranial
transplantation of embryonic progenitor cells of nervous system
// Fiziol. Zhurnal. – 2006. – Vol. 52, N3. – P. 64–69.
7.Lyubich L.D., Lisyanyy N.I., Semenova V.M., Stayno L.P. HLA-
antigene characteristics of native and cultured neural cells of
fetal and post-natal human brain // Kletochnye Kultury.
Informatsionnyy Byulleten. Issue 25. – St.-Peterburg:
Polytechnic University, 2010.– P. 47–59.
8.Nikandrov V.N., Chaplinskaya Ye.V. S-100 protein: structure
and function properties and the role in neural tissue //
Biopolymers and Cell. – 2005. – Vol. 21, N1. – P. 12–27.
9.Seledtsova G.V., Seledtsov V.I., Rabinovich S.S. et al.
Transplantation of fetal cells in treatment of neurologic im-
pairments // Kletochnaya Transplantatsiya i Tkanevaya
Inzheneriya. – 2008. – Vol. 3, N1. – P. 49–56.
10.Sergeyev V.S. Prevention of acute and chronic rejection of
transplants in mice by adoptive introduction of CD4+CD25+
Foxp3+ regulatory T lymphocytes // Kletochnaya Transplanta-
tsiya i Tkanevaya Inzheneriya. – 2008. – Vol. 3, N4. – P. 10–12.
11.Chekhonin V.P., Lebedev S.V., Gurina O.I. et al. Elimination
of neurospecific proteins from CNS (pathogenetics and me-
thods) // Vestnik Rossiyskoy AMN. – 2006. – N6. – P. 3–12.
12.Shpakova A.P., Pavlova K.S., Bulycheva T.I. MTT-colorimetric
assay for determining the cytotoxic activity of natural killer
cells // Klin. Lab. Diagnostika. – 2000.– N2. – P. 20–23.
13.Akesson E., Wolmer-Solberg N., Cederarv M. et al. Human
neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress
an allogeneic lymphocyte response // Stem Cell Res.– 2009.–
Vol. 2, N1. – P. 56–67.
14.Barker R.A, Widner H. Immune problems in central nervous
system cell therapy // NeuroRx.– 2004.– Vol.1, N4.– P. 472–481.
15.Ben-Hur T. Immunomodulation by neural stem cells // J. Neurol.
Sci. – 2008. – Vol. 265, N1–2. – P. 102–104.
16.Chen Z., Palmer T.D. Cellular repair of CNS disorders: an im-
munological perspective // Hum. Mol. Genet. – 2008. – Vol. 17,
N1. – P. 84–92.
17.Czeonkowska A., Kurkowska-Jastrzebska I., Czeonkowski A.
et al. Immune processes in the pathogenesis of Parkinson's di-
sease – a potential role for microglia and nitric oxide // Med.
Sci. Monit. – 2002. – Vol. 8, N8. – P. 165–177.
18.D'Mello C., Le T., Swain M.G. Cerebral microglia recruit mono-
cytes into the brain in response to tumor necrosis factoralpha
signaling during peripheral organ inflammation // J. Neurosci. –
2009. – Vol. 29, N7. – P. 2089–2102.
19.Engelhardt B. The blood-central nervous system barriers acti-
vely control immune cell entry into the central nervous system //
Curr. Pharm. Des. – 2008. – Vol.14, N16. – P. 1555–1565.
20.Fainstein N., Vaknin I., Einstein O. et al. Neural precursor
cells inhibit multiple inflammatory signals // Mol. Cell Neurosci. –
2008.– Vol. 39, N3. – P.335–341.
21.Graber J.J., Dhib-Jalbut S. Protective autoimmunity in the
nervous system // Pharmacol. Ther. – 2009.– Vol. 121, N2.–
P. 147–159.
22.Ideguchi M., Shinoyama M., Gomi M. et al. Immune or inflamma-
tory response by the host brain suppresses neuronal differen-
tiation of transplanted ES cell-derived neural precursor cells //
J. Neurosci. Res. – 2008. – Vol. 86, N9. – P. 1936–1943.
483 problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №4
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №4
24.Kim D.E., Tsuji K., Kim Y.R. et al. Neural stem cell transplant
survival in brains of mice: assessing the effect of immunity
and ischemia by using real–time bioluminescent imaging //
Radiology.– 2006.– Vol.241, №3.– P.822–830.
25.Krystkowiak P., Gaura V., Labalette M. et al. Alloimmunisation
to donor antigens and immune rejection following foetal neural
grafts to the brain in patients with Huntington's disease // PLoS
ONE.– 2007.– Vol.2, №1.– P.166–168.
26.Liblau R, Cassan C. Tolérance immunitaire vis-à-vis d’auto-
antigènes du système nerveux : implications thérapeutiques //
Rev. Neurol. (Paris). – 2007. – Vol. 163, №1. – Р. 12–22.
27.Modo M., Mellodew K., Rezaie P. In vitro expression of major
histocompatibility class I and class II antigens by conditionally
immortalized murine neural stem cells // Neurosci. Lett. – 2003. –
Vol. 337, №2. – P.85–88.
28.Odeberg J., Piao J.H., Samuelsson E.B. et al. Low immuno-
genicity of in vitro-expanded human neural cells despite high
MHC expression // J. Neuroimmunol. – 2005. – Vol.161, №1–
2. – P. 1–11.
29.Pedemonte E., Mancardi G., Giunti D. et al. Mechanisms of
the adaptive immune response inside the central nervous sys-
tem during inflammatory and autoimmune diseases // Pharmacol.
Ther. – 2006. – Vol. 111, №3. – P.555–566.
30.Preynat-Seauve O., de Rham C., Tirefort D. et al. Neural
progenitors derived from human embryonic stem cells are tar-
geted by allogeneic T and natural killer cells // J. Cell Mol. Med. –
2009. – Vol. 13, №9. – P. 3556–3569.
31.Sen S.K, Lowe J.B.3rd, Brenner M.J. et al. Assessment of the
immune response to dose of nerve allografts // Plast. Reconstr.
Surg. – 2005. – Vol. 115, №3. – P.823–830.
32.Trumble T., Gunlikson R., Parvin D. A comparison of immune
response to nerve and skin allografts // J. Reconstr. Microsurg. –
1993. – Vol. 9, №5. – P. 367–372.
33.Ubiali F., Nava S., Nessi V. et al. Allorecognition of human
neural stem cells by peripheral blood lymphocytes despite low
expression of MHC molecules: role of TGF-beta in modulating
proliferation // Int. Immunol. – 2007. – Vol. 19, №9. – P. 1063–
1074.
34.Wang X.J., Liu W.G., Zhang Y.H. et al. Effect of transplantation
of c17.2 cells transfected with interleukin-10 gene on intra-
cerebral immune response in rat model of Parkinson's disease //
Neurosci. Lett. – 2007. – Vol. 423, №2. – P. 95–99.
Поступила 20.06.12
23.Imitola J., Comabella M., Chandraker A.K. et al. Neural stem/
progenitor cells express costimulatory molecules that are diffe-
rentially regulated by inflammatory and apoptotic stimuli // Am.
J. Pathol. – 2004. – Vol. 164, N5. – P. 1615–1622.
24.Kim D.E., Tsuji K., Kim Y.R. et al. Neural stem cell transplant
survival in brains of mice: assessing the effect of immunity
and ischemia by using real–time bioluminescent imaging //
Radiology.– 2006.– Vol.241, N3.–P.822–830.
25.Krystkowiak P., Gaura V., Labalette M. et al. Alloimmunisation
to donor antigens and immune rejection following foetal neural
grafts to the brain in patients with Huntington's disease // PLoS
ONE.– 2007.– Vol.2, N1.–P.166–168.
26.Liblau R, Cassan C. Tolérance immunitaire vis-à-vis d’auto-
antigènes du système nerveux : implications thérapeutiques //
Rev. Neurol. (Paris). – 2007. – Vol. 163, N1. – Р. 12–22.
27.Modo M., Mellodew K., Rezaie P. In vitro expression of major
histocompatibility class I and class II antigens by conditionally
immortalized murine neural stem cells // Neurosci. Lett. – 2003. –
Vol. 337, N2. – P.85–88.
28.Odeberg J., Piao J.H., Samuelsson E.B. et al. Low immuno-
genicity of in vitro-expanded human neural cells despite high
MHC expression // J. Neuroimmunol. – 2005. – Vol.161, N1–2. –
P. 1–11.
29.Pedemonte E., Mancardi G., Giunti D. et al. Mechanisms of
the adaptive immune response inside the central nervous sys-
tem during inflammatory and autoimmune diseases // Pharmacol.
Ther. – 2006. – Vol. 111, N3. – P.555–566.
30.Preynat-Seauve O., de Rham C., Tirefort D. et al. Neural
progenitors derived from human embryonic stem cells are tar-
geted by allogeneic T and natural killer cells // J. Cell Mol. Med. –
2009. – Vol. 13, N9. – P. 3556–3569.
31.Sen S.K, Lowe J.B.3rd, Brenner M.J. et al. Assessment of the
immune response to dose of nerve allografts // Plast. Reconstr.
Surg. – 2005. – Vol. 115, N3. – P.823–830.
32.Trumble T., Gunlikson R., Parvin D. A comparison of immune
response to nerve and skin allografts // J. Reconstr. Microsurg. –
1993. – Vol. 9, N5. – P. 367–372.
33.Ubiali F., Nava S., Nessi V. et al. Allorecognition of human
neural stem cells by peripheral blood lymphocytes despite low
expression of MHC molecules: role of TGF-beta in modulating
proliferation // Int. Immunol. – 2007. – Vol. 19, N9. – P. 1063–
1074.
34.Wang X.J., Liu W.G., Zhang Y.H. et al. Effect of transplantation
of c17.2 cells transfected with interleukin-10 gene on intra-
cerebral immune response in rat model of Parkinson's disease //
Neurosci. Lett. – 2007. – Vol. 423, N2. – P. 95–99.
Accepted 20.06.12
|