Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека
Исследована криозащитная эффективность криоконсервантов на основе комбинации экстрацеллюлярного криопротектора оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 25 (ОЭГn = 25) с проникающими криопротекторами 1,2-пропандиолом (1,2-ПД), диметилсульфоксидом (ДМСО) и диметилацетамидом (ДМАц) пр...
Збережено в:
| Дата: | 2013 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68701 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека / Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 26-39. — Бібліогр.: 43 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68701 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-687012014-10-05T13:08:12Z Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека Пахомова, Ю.С. Чеканова, В.В. Компаниец, А.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследована криозащитная эффективность криоконсервантов на основе комбинации экстрацеллюлярного криопротектора оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 25 (ОЭГn = 25) с проникающими криопротекторами 1,2-пропандиолом (1,2-ПД), диметилсульфоксидом (ДМСО) и диметилацетамидом (ДМАц) при замораживании эритроцитов. Замораживание-отогрев в растворах на основе ОЭГn=25 и 1,2-ПД, ДМСО или ДМАц в соотношении 5:1, а также ДМАц в соотношении 2:1 и 1:1 приводило к уменьшению осмотической хрупкости размороженных эритроцитов. По показателям гемолиза и содержания свободного гемоглобина наиболее высокий уровень сохранности криоконсервированных эритроцитов установлен для 30%-го раствора ОЭГn = 25. Досліджена кріозахисна ефективність кріоконсервантів на основі комбінації екстрацелюлярного кріопротектора оксиетильованого гліцерину зі ступенем полімеризації n=25 (ОЕГn = 25) та проникаючих кріопротекторів 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), диметилсульфоксиду (ДМСО) і диметилацетаміду (ДМАц) при заморожуванні еритроцитів. Заморожування-відігрів в розчинах на основі ОЕГn=25 та 1,2-ПД, ДМСО або ДМАц у співвідношенні 5:1, а також ДМАц у співвідношенні 2:1 та 1:1 призводило до зменшення осмотичної крихкості розморожених еритроцитів. За показниками гемолізу та вільного гемоглобіну найбільш високий рівень збереженості кріоконсервованих еритроцитів встановлено для 30%-го розчину ОЕГn = 25. Cryoprotective efficiency of сryopreservatives, based on combination of extracelular cryoprotectant oxyethylated glycerol with polymerization degree n = 25 (OEGn = 25) with penetrating cryoprotectants 1,2-propanediol (1,2-PD), dimethyl sulphoxide (DMSO) and dimethyl acetamide (DMAc) during red blood cells freezing was studied. Freeze-thawing in solutions of OEGn=25 and 1,2-PD, DMSO and DMAc mixed in 5:1 ratio, as well as with DMAc in ratios of 2:1 and 1:1 resulted in the reduction of osmotic fragility of red blood cells comparing to non-treated cells. The highest level of post-thaw survival of red blood cells according to indices of hemolysis and content of free hemoglobin was found for 30% OEGn=25 solution. 2013 Article Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека / Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 26-39. — Бібліогр.: 43 назв. — рос., англ. 2307-6143 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68701 577.422:612.111:57.043 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Пахомова, Ю.С. Чеканова, В.В. Компаниец, А.М. Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследована криозащитная эффективность криоконсервантов на основе комбинации экстрацеллюлярного криопротектора оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 25 (ОЭГn = 25) с проникающими криопротекторами 1,2-пропандиолом (1,2-ПД), диметилсульфоксидом (ДМСО) и диметилацетамидом (ДМАц) при замораживании эритроцитов. Замораживание-отогрев в растворах на основе ОЭГn=25 и 1,2-ПД, ДМСО или ДМАц в соотношении 5:1, а также ДМАц в соотношении 2:1 и 1:1 приводило к уменьшению осмотической хрупкости размороженных эритроцитов. По показателям гемолиза и содержания свободного гемоглобина наиболее высокий уровень сохранности криоконсервированных эритроцитов установлен для 30%-го раствора ОЭГn = 25. |
| format |
Article |
| author |
Пахомова, Ю.С. Чеканова, В.В. Компаниец, А.М. |
| author_facet |
Пахомова, Ю.С. Чеканова, В.В. Компаниец, А.М. |
| author_sort |
Пахомова, Ю.С. |
| title |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| title_short |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| title_full |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| title_fullStr |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| title_full_unstemmed |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| title_sort |
криозащитные свойства растворов на основе непроникающего оэгn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68701 |
| citation_txt |
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при замораживании эритроцитов человека / Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 26-39. — Бібліогр.: 43 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT pahomovaûs kriozaŝitnyesvojstvarastvorovnaosnovenepronikaûŝegooégn25vkombinaciicpronikaûŝimikrioprotektoramiprizamoraživaniiéritrocitovčeloveka AT čekanovavv kriozaŝitnyesvojstvarastvorovnaosnovenepronikaûŝegooégn25vkombinaciicpronikaûŝimikrioprotektoramiprizamoraživaniiéritrocitovčeloveka AT kompaniecam kriozaŝitnyesvojstvarastvorovnaosnovenepronikaûŝegooégn25vkombinaciicpronikaûŝimikrioprotektoramiprizamoraživaniiéritrocitovčeloveka |
| first_indexed |
2025-07-05T18:31:05Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:31:05Z |
| _version_ |
1836832801541849088 |
| fulltext |
УДК 577.422:612.111:57.043
Ю.С. Пахомова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец*
Криозащитные свойства растворов на основе непроникающего
ОЭГn=25 в комбинации c проникающими криопротекторами при
замораживании эритроцитов человека
UDC 577.422:612.111:57.043
Yu.S. Pakhomova, V.V. Chekanova, A.M. Kompaniets*
Cryoprotective Properties of Solutions Based
on Non-Penetrative OEGn = 25 Combined with Penetrating
Cryoprotectants During Freezing of Human Erythrocytes
Реферат: Исследована криозащитная эффективность криоконсервантов на основе комбинации экстрацеллюлярного
криопротектора оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 25 (ОЭГn = 25) с проникающими крио-
протекторами 1,2-пропандиолом (1,2-ПД), диметилсульфоксидом (ДМСО) и диметилацетамидом (ДМАц) при замораживании
эритроцитов. Замораживание-отогрев в растворах на основе ОЭГn=25 и 1,2-ПД, ДМСО или ДМАц в соотношении 5:1, а также
ДМАц в соотношении 2:1 и 1:1 приводило к уменьшению осмотической хрупкости размороженных эритроцитов. По
показателям гемолиза и содержания свободного гемоглобина наиболее высокий уровень сохранности криоконсервированных
эритроцитов установлен для 30%-го раствора ОЭГn = 25.
Ключевые слова: эритроциты, криоконсервирование, комбинированные криозащитные среды, оксиэтилированный
глицерин.
Реферат: Досліджена кріозахисна ефективність кріоконсервантів на основі комбінації екстрацелюлярного кріопротектора
оксиетильованого гліцерину зі ступенем полімеризації n=25 (ОЕГn = 25) та проникаючих кріопротекторів 1,2-пропандіолу (1,2-
ПД), диметилсульфоксиду (ДМСО) і диметилацетаміду (ДМАц) при заморожуванні еритроцитів. Заморожування-відігрів в
розчинах на основі ОЕГn=25 та 1,2-ПД, ДМСО або ДМАц у співвідношенні 5:1, а також ДМАц у співвідношенні 2:1 та 1:1
призводило до зменшення осмотичної крихкості розморожених еритроцитів. За показниками гемолізу та вільного гемоглобіну
найбільш високий рівень збереженості кріоконсервованих еритроцитів встановлено для 30%-го розчину ОЕГn = 25.
Ключові слова: еритроцити, кріоконсервування, комбіновані кріозахисні середовища, оксиетильований гліцерин.
Abstract: Cryoprotective efficiency of сryopreservatives, based on combination of extracelular cryoprotectant oxyethylated
glycerol with polymerization degree n = 25 (OEGn = 25) with penetrating cryoprotectants 1,2-propanediol (1,2-PD), dimethyl sulphoxide
(DMSO) and dimethyl acetamide (DMAc) during red blood cells freezing was studied. Freeze-thawing in solutions of OEGn=25 and 1,2-
PD, DMSO and DMAc mixed in 5:1 ratio, as well as with DMAc in ratios of 2:1 and 1:1 resulted in the reduction of osmotic fragility of
red blood cells comparing to non-treated cells. The highest level of post-thaw survival of red blood cells according to indices of
hemolysis and content of free hemoglobin was found for 30% OEGn=25 solution.
Key words: red blood cells, cryopreservation, combined cryoprotective solutions, oxyethylated glycerol.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: a.m.kompaniets@gmail.com
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: a.m.kompaniets@gmail.com
Department of Cryoprotectants, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криопротекторов, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 28.08.2012
Принята в печать 30.01.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №1. – С. 26–39.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received August, 28, 2012
Accepted January, 30, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 1. – P. 26–39.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Создание новых эффективных методов криокон-
сервирования и долгосрочного хранения компо-
нентов донорской крови, в том числе эритроцитов,
можно отнести к одному из актуальных направле-
ний развития трансфузионной медицины ХХ1 века
[37]. Ввиду беспрецедентного распространения
опасных инфекций и заболеваний, передающихся
с кровью (гепатиты В, С, СПИД и т.д.), постоянного
уменьшения численности доноров и старения
населения внимание специалистов все больше
Development of new effective methods for cryopre-
servation and long-term storage of blood components,
including red blood cells (RBCs), can be attributed to
one of the important directions of transfusion medicine
in 21st century. [37] Due to the unprecedented spread
of dangerous blood-borne infections (hepatitis B, C;
HIV, etc.), permanent reduction in the number of donors
and aging of human population the attention of autho-
rities is greatly attracted to the quality and safety of
cryopreserved blood components, as well as its enor-
оригинальное исследование research article
привлекают качество и безопасность криоконсер-
вированных компонентов крови, огромный потен-
циал их использования в практической медицине
[25, 36].
Возможность эффективного замораживания
эритроцитов донорской крови человека с сохране-
нием высокого уровня посттрансфузионной прижи-
ваемости in vivo (85–90%) впервые была проде-
монстрирована ещё в 1950 году [1, 6, 25]. Однако
на современном этапе криоконсервирование эрит-
роцитов применяется в основном для создания
стратегических запасов эритроцитсодержащих
компонентов донорской крови, хранения эритроци-
тов редких групп и аутологичной крови [4, 23, 25]
вследствие высокой стоимости криоконсервирован-
ных эритроцитов, непродолжительного срока
хранения размороженных клеток [1, 41].
Современные технологии криоконсервирования
эритроцитов преимущественно основаны на
использовании в качестве криопротектора глицери-
на, главной проблемой применения которого
являются трудоемкие и сложные процессы глице-
ринизации и деглицеринизации (отмывания) клеток
после размораживания [1, 7, 36, 38]. И хотя в
последние годы достигнут определенный прогресс
в автоматизации этих процессов за счет внедрения
специального аппарата ACPTM215 («Haemone-
tics», США) [43], вопросы экономической эффек-
тивности и доступности технологий криоконсер-
вирования эритроцитов с глицерином остаются
открытыми.
Главным преимуществом методов криоконсер-
вирования эритроцитов с такими непроникающими
(экстрацеллюлярными) криопротекторами, как
гидроксиэтилированный крахмал (ГЭК), поливи-
нилпирролидон (ПВП), полиэтиленоксид (ПЭО), яв-
ляется возможность исключения этапа их отмыва-
ния перед трансфузией [3, 35, 41]. Однако по пока-
зателям сохранности размороженных клеток эти
методы уступают криоконсервированию эритроци-
тов с глицерином и поэтому широкого признания
не получили. К недостаткам экстрацеллюлярных
соединений относят возможность значительной (до
50%) дегидратации клеток на этапах криоконсерви-
рования, необратимые изменения (повреждения)
мембран эритроцитов после замораживания-
отогрева, их низкую осмотическую устойчивость
[17, 18, 21, 34, 40], и как следствие – риск развития
внутрисосудистого гемолиза перелитых эритроци-
тов [42]. Имеются данные, что ГЭК и ПВП спо-
собны накапливаться в клетках ретикулоэндо-
телиальной системы реципиента после массивных
трансфузий, ПВП может повышать свертывае-
мость крови реципиента, вызывать гранулематоз-
ные поражения ткани в местах введения, но глав-
mous potential for application in practical medicine [25,
36].
The possibility for successful freeze-thawing of
human RBCs with preserved high post-transfusion
grafting in vivo (85–90%) was for the first time demon-
strated in 1950 [1, 6, 25]. However, nowadays the
cryopreservation of RBCs is applied primarily for the
creation of strategic stocks of RBC-containig donor
blood components, as well as for storage of RBCs of
rare blood groups or the autologous blood [4, 23, 25]
and this is due to the high cost of cryopreserved RBCs
and a short shelf life of thawed cells [1, 41].
Modern technologies for cryopreservation of RBCs
are mainly based on the use of glycerol as a cryopro-
tectant, but the main difficulties in its applications are
time-consuming and complex process and glyceroliza-
tion and deglycerolization (washing) of the cells after
thawing [1, 7, 36, 38]. Although recently a progress
has been achieved in the automation of these processes
through the introduction of a special device
ACPTM215 (Haemonetics, USA) [43], the issues of
cost-effectiveness and affordability of technologies for
cryopreservation of RBCs using glycerol remain open.
The main advantage offered by the methods of
RBCs cryopreservation using non-penetrating (extra-
cellular) cryoprotectants, such as hydroxyethyl starch
(HES), polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene oxide
(PEO), is the possible exclusion of the washing
procedure before transfusion [3, 35, 41]. However, in
terms of the survival of thawed cells, these methods
yield to cryopreservation of RBCs using glycerol, and
therefore have not found the wide acceptance. The
disadvantages of extracellular compounds include also
the possible significant (up to 50%) dehydration of cells
during cryopreservation, irreversible changes (dama-
ges) of RBC membranes after freeze-thawing, their
low osmotic resistance [17, 18, 21, 34, 40], and as a
result these elevate the risk of intravascular hemolysis
of transfused red blood cells [42]. There are the reports
about possible accumulation of HES and PVP in the
cells of the reticuloendothelial system of the recipient
after massive transfusions, PVP can increase clotting
of recipient’s blood, cause granulomatous damage of
tissues in the injection site, and, above all, it has a
remote carcinogenic effect [22, 41, 42].
It should be noted that recently the experimental
studies on the development of RBC cryoprotective solu-
tions based on non-penetratingh substances attracted
the interest of the researchers [21, 27, 29, 31, 33].
As a promising cryoprotectants with the extracel-
lular mechanism of action one could consider oxyethy-
lated derivatives of alcohols, in particular oxyethylated
glycerol oligomers (OEG), synthesized at the Depart-
ment of Cryoprotectants of the Institute for Problems
of Cryobiology and Cryomedicine [16, 24]. Assessment
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
27
ное – обладает отдаленным канцерогенным эф-
фектом [22, 41, 42].
Следует отметить, что в последние годы отме-
чен рост экспериментальных исследований по раз-
работке криоконсервантов для эритроцитов на
основе непроникающих соединений [21, 27, 29, 31,
33].
К перспективным криопротекторам с экстра-
целлюлярным механизмом действия следует от-
нести оксиэтильные производные спиртов, в част-
ности олигомеры оксиэтилированного глицерина
(ОЭГ), синтезированные в отделе криопротекторов
ИПКиК НАН Украины [16, 24]. Исследование фа-
зовых переходов и физических состояний растворов
олигомеров ОЭГ показало, что их молекулы харак-
теризуются выраженной способностью к формиро-
ванию водородных связей с молекулами воды; вод-
ные растворы этих соединений демонстрируют вы-
сокую склонность к стеклованию, при охлаждении
они представляют собой гетерогенные системы,
включающие аморфную и кристаллическую фазы,
или гомогенные аморфные [10, 11]. Установлена
способность ОЭГn=25 и ОЭГn=30 оказывать защит-
ный эффект в условиях развития гипертонического
стресса эритроцитов [9]. Показана перспектив-
ность использования ОЭГn=25 и ОЭГn=30 в качестве
непроникающих криопротекторов для криоконсер-
вирования эритроцитов человека, однако отмечен
высокий уровень их осмотической хрупкости после
замораживания-отогрева [13, 14, 16, 20].
В последние годы активно разрабатывается но-
вый подход к созданию эффективных криозащитных
сред для низкотемпературного консервирования
клеток и тканей, в том числе эритроцитов, заклю-
чающийся в комбинировании в растворах криопро-
текторов, отличающихся химической структурой
и физико-химическими свойствами, механизмом
криозащитного действия [21]. В этой связи целью
настоящей работы явилось исследование при за-
мораживании эритроцитов криозащитных свойств
растворов на основе непроникающего ОЭГn=25 в
комбинации с проникающими криопротекторами.
Материалы и методы
Объектом исследования был эритроконцентрат,
выделенный из донорской крови, заготовленной на
гемоконсерванте «Глюгицир» и хранившейся после
эксфузии не более 2-х суток при 4°С. Эритрокон-
центрат получали методом центрифугирования
цельной крови при 1250 g в течение 20 мин с
последующим удалением плазмы и лейкотромбо-
цитарного слоя.
В качестве криопротекторов использовали
ОЭГn = 25, 1,2-пропандиол (1,2-ПД), диметилсуль-
фоксид (ДМСО), диметилацетамид (ДМАц). Все
вещества марки «ч. д. а.» или «х. ч.» были допол-
of phase transitions and physical state of the solution
of OEG oligomers showed that these molecules were
characterized by a significant ability to formation of
hydrogen bonds with water molecules; aqueous solu-
tions of these substances exhibit a high tendency to
vitrification, during cooling they became heterogeneous
systems, with amorphous and crystalline phases, or
homogeneous amorphous systems [10, 11]. There was
found the ability of OEGn=25 and OEGn =30 to render a
protective effect under development of hypertonic
stress in RBCs [9]. The prospects of OEGn=25 and
OEGn =30 as non-penetrating cryoprotectants were
shown during cryopreservation of human RBCs,
however, a high level of osmotic fragility after freezing
and thawing was noted [13, 14, 16, 20].
Recently, a new approach to create effective cryo-
protective media for low-temperature preservation of
cells and tissues, including RBCs is developed, which
consists in combination of cryoprotectants with diffe-
rent chemical structure, physico-chemical properties,
and mechanism of protective action [21]. In this context,
the aim of this work was to investigate the cryopro-
tective properties of solutions based on non-penetrating
OEGn = 25 in combination with penetrating cryoprotec-
tants during freeze-thawing of RBCs
.
Materials and methods
The object under study was erythromass isolated
from blood procured in Glugicir solution and stored
after procurement not more than 2 days at 4°C.
Erythromass was derived by centrifugation of whole
blood at 1250g for 20 min, followed by removal of the
plasma and leuko-platelet layer.
As cryoprotectants we used OEGn=25, 1,2-propane
diol (1,2-PD), dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl
acetamide (DMAc). All the substances were of ‘ana-
lytical grade’ or ‘chemically pure’ and additionally puri-
fied and identified at the Department of Cryoprotec-
tants of the Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine. Cryoprotectant solutions were prepared
on the base of phosphate-buffered saline (51.7 mM
NaCl, 9 mM NaH2PO4, 0,46 mM Na2HPO4, pH 7.4).
Concentration of cryoprotectants is hereinafter expres-
sed in percents w/w.
The investigation was directed on assessment of
cryoprotective properties of solutions containing diffe-
rent combinations of OEGn = 25 with 1,2-PD, DMSO
and DMAc (in ratios 1:1, 2:1 and 5:1) in total
concentration of 30% comparing with 30% OEGn = 25
solution, which was chosen as the most effective to
achieve high post-thaw preservation of RBCs (baseline
control). As additional controls served the solutions
containing 25, 20 and 15% concentration of OEGn = 25
without penetrating cryoprotectants.
Samples of RBCs in the cryoprotective media were
frozen in 2 ml plastic vials by immersion in liquid nitro-
28 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
нительно очищены и идентифицированы в отделе
криопротекторов ИПКиК НАН Украины. Раство-
ры криопротекторов готовили на фосфатно-соле-
вом буфере (51,7 мM NaCl, 9 мM NaH2PO4,
0,46 мM Na2HPO4, рН 7,4). Концентрация криопро-
текторов далее приводится в массовых процентах.
Исследовали криозащитные свойства раство-
ров, содержащих различные комбинации ОЭГn = 25
с 1,2-ПД, ДМСО и ДМАц (соотношение 1:1, 2:1 и
5:1) в суммарной (общей) концентрации 30% по
сравнению с 30%-м раствором ОЭГn = 25, которая
была выбрана как наиболее эффективная и позво-
ляющая достичь высокого уровня сохранности
эритроцитов после замораживания-отогрева (базо-
вый контроль). Дополнительным контролем служи-
ли растворы, содержащие 25, 20 и 15%-е концент-
рации ОЭГn = 25 без добавления проникающих крио-
протекторов.
Образцы эритроцитов в криозащитных средах
замораживали в полиэтиленовых ампулах вмести-
мостью 2 мл погружением в жидкий азот , хранили
при –196°С от 1 до 3 недель. Образцы отогревали
на водяной бане при температуре 40...42°С при
постоянном покачивании контейнера.
Сохранность эритроцитов оценивали по следую-
щим показателям: уровень гемолиза, количество
свободного гемоглобина в клеточной взвеси, об-
щий гемоглобин клеточной взвеси, величина гема-
токрита, осмотическая хрупкость эритроцитов в
изотоническом и гипотоническом растворах NaCl.
Содержание общего гемоглобина в образце и
уровень свободного гемоглобина в клеточной
взвеси определяли на фотоколориметре КФК-3-01,
используя набор реактивов для диагностики («Fe-
licit», Украина); показатель гематокрита эритроци-
тов – унифицированным микрометодом [12]; ос-
мотическую хрупкость эритроцитов – стандартным
методом [19]. Процент гемолизированных клеток
во взвеси рассчитывали по формуле Huggins [30]:
HbсвH% = ×(1 – Ht)×100%,
Hbобщ
где Hbсв – содержание свободного гемоглобина в
надосадке, г/л; Hbобщ – содержание общего гемо-
глобина в суспензии эритроцитов; Ht – величина
гематокрита, %.
Сохранность эритроцитов, замороженных-ото-
гретых в 30%-м растворе ОЭГn = 25 и комбинирован-
ном растворе 15% ОЭГn = 25 с 15% ДМАц в дина-
мике 48-часового гипотермического хранения, ис-
следовали следующим образом. Размороженную
суспензию эритроцитов помещали во взвешиваю-
щий плазмозамещающий раствор ЦОЛИПК-8в в
соотношении 1:1 (по объему) и хранили при темпе-
gen and stored at –196°C for 1 to 3 weeks. The samp-
les were warmed in a water bath at a temperature of
40...42°C with constant shaking of the container.
Survival of RBCs was evaluated by the following
parameters: the level of hemolysis, content of free
hemoglobin in the cell suspension, the total hemoglobin
content in cell suspension, the value of hematocrit,
erythrocyte osmotic fragility in isotonic and hypotonic
solutions of NaCl.
The content of total hemoglobin in the sample and
of free hemoglobin in cell suspension was determined
using photocolorimeter KFK-3-01 (Ukraine) and a kit
of diagnostic reagents (Felicit, Ukraine); RBC hema-
tocrit was assessed by the unified micromethod [12],
RBC osmotic fragility was found by standard approach
[19]. Percentage of hemolyzed cells in suspension was
calculated according Huggins formula [30]:
HbfreeH% = ×(1 – Ht)×100%,
Hbtotal
where Hbfree was the content of free hemoglobin in
the supernatant, g/l; Hbtotal was the content of total
hemoglobin in the RBC suspension, g/l; Ht was the
hematocrit value, %.
Survival of RBCs, frozen-thawed in 30% solution
of OEGn =25 and the combined solution of 15% OEGn=25
and 15% DMAc during 48 hrs hypothermic storage
was examined as follows. The thawed RBC suspension
was placed in the plasma substitute solution TsOLIPK-
8v in 1:1 ratio (v/v) and stored at 4 ± 2°C for 48 hrs,
the RBCs were assessed in 1, 24 and 48 hrs of storage.
Statistical analysis of the results was performed
using the Statistica 6.0 software, statistical significance
of the differences between groups was estimated by
nonparametric Wilcoxon U-test, considering the
differences as significant if significance level was p <
0.05 (n = 6).
Results and discussion
To modify the cryoprotective solutions based on
non-penetrating OEGn = 25 these were supplemented
with penetrating cryoprotectants of diols (1,2-PD),
amides (DMAc) or sulfoxides (DMSO) series. Con-
sidering the differences in the structure, physical and
chemical properties, rate and mechanisms of pene-
tration of these small molecules through the cell
membrane, one can assume that the combined cryo-
protective medium would have a different impact on
the thermodynamic processes occurring in the cell-
cryoprotectant system on stages of exposure, freeze-
thawing, and further transfer of thawed RBCs in iso-
osmotic medium.
Level of hemolysis of the RBCs, frozen-thawed in
30 and 25% solutions of OEGn = 25, was 1.3 ± 0.32 and
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
29
0 5 10 15 20
ратуре (4 ± 2)°С в течение 48 ч; эритроциты ис-
следовали через 1, 24 и 48 ч хранения.
Для статистического анализа результатов ис-
пользовали программу «Statistica 6.0», для оценки
статистической значимости различий между груп-
пами применяли непараметрический U-критерий
Уилкоксона, считая достоверными различия с
уровнем значимости р < 0,05 (n = 6).
Результаты и обсуждение
Для модификации криозащитных растворов на
основе непроникающего ОЭГn = 25 в их состав вво-
дили проникающие криопротекторы, относящиеся
к ряду диолов (1,2-ПД), амидов (ДМАЦ) и сульфок-
сидов (ДМСО). Учитывая различия в структуре,
физико-химических свойствах, скорости и механиз-
мах проникновения этих низкомолекулярных
соединений через клеточную мембрану, можно
предположить, что комбинированные криозащит-
ные среды будут по-разному влиять на термодина-
мические процессы, протекающие в системе
«клетка-криопротектор» на этапах экспозиции,
замораживания-отогрева, перенесения деконсерви-
рованных эритроцитов в изоосмотическую среду.
Уровень гемолиза эритроцитов, замороженных-
отогретых в 30 и 25%-х растворах ОЭГn = 25, соста-
вил 1,3 ± 0,32 и 1,4 ± 0,13% соответственно. Сниже-
ние концентрации ОЭГn = 25, в криозащитном раст-
воре с 30 до 20 и 15% приводило к существенному
увеличению этого показателя. Так, гемолиз эритро-
1.4 ± 0.13% respectively. Reducing the OEGn = 25 con-
centration in cryoprotective solution from 30 to 20 and
15% resulted in a significant increase of this index.
Hemolysis of frozen-thawed in 20% OEGn = 25 solution
was 2.5 times higher than the index in the cell sus-
pension, frozen-thawed in 30 and 25% solutions of
OEGn = 25, and in the case of 15% OEGn = 25 solution it
was even more than 10 times higher (Fig. 1).
After freeze-thawing of RBCs in the cryoprotective
solution containing 25% OEGn = 25 and 5% of 1,2-PD,
DMSO or DMAc (in 5:1 ratio), no significant differen-
ces in their survival in terms of hemolysis index
compared to 30 and 25% OEGn=25 solutions have been
found, although there was a tendency to its slight
decrease after the supplementing the solution with 5%
1,2-PD and 5% DMAc – down to 0.9 ± 0.11 and 1.1 ±
0.29%, respectively (Fig. 1).
Using the combined solution containing 20% of
OEGn = 25 and 10% of 1,2-PD, DMSO or DMAc (in
2:1 ratio) resulted in a significant reduction of the he-
molysis level comparing to a solution containing solely
20% of OEGn = 25 (Fig. 1). In this case, there was a si-
milar tendency like after supplementing the cryopre-
servative solution with penetrating cryoprotectants in
5% concentration: the presence in cryopreservative
solution of 10% 1,2-PD and DMAc reduced the hemo-
lysis rate from 3.6 ± 0.86 down to 1.2 ± 0.22 and 1.08 ±
0.12%, respectively.
The rate of hemolysis in RBC suspension, frozen-
thawed in 15% OEGn = 25 solution was the highest
30% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% 1,2-ПД/1,2-PD
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% ДМСО/DMSO
25% ОЭГn=25+5% ДМАц/DMAc
20% ОЭГn=25/OEGn=25
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% 1,2-ПД/1,2-PD
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМСО/DMSO
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМАц/DMAc
15% ОЭГn=25/OEGn=25
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% 1,2-ПД/1,2-PD
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМСО/DMSO
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМАц/DMAc
Рис. 1. Гемолиз эритроцитов после замораживания-отогрева в
растворах, содержащих комбинации криопротекторов.
Fig. 1. RBCs hemolysis after freeze-thawing in solutions with cryo-
protectants.
цитов, замороженных-отогретых в
20%-м растворе ОЭГn = 25, в 2,5 раза
превышал гемолиз клеток, заморо-
женных-отогретых с 30 и 25%-ми раст-
ворами ОЭГn = 25, а при использовании
15%-го раствора ОЭГn = 25 – более чем
в 10 раз (рис. 1).
После замораживания-отогрева
эритроцитов в криозащитных раство-
рах, содержащих 25% ОЭГn = 25 и 5%
1,2-ПД, ДМСО или ДМАц (соотно-
шение 5:1), достоверных отличий в их
сохранности по показателю гемолиза
по сравнению с 30 и 25%-ми раство-
рами ОЭГn = 25 не выявлено, хотя от-
мечена тенденция к незначительному
его снижению при введении в консер-
вант 5% 1,2-ПД и 5% ДМАц – до 0,9 ±
0,11 и 1,1 ± 0,29% соответственно
(рис. 1).
При использовании комбинирован-
ных растворов, содержащих 20%-й
раствор ОЭГn = 25 и 10% 1,2-ПД, ДМСО
или ДМАц (соотношение 2:1), досто-
верно снижался уровень гемолиза по
сравнению с раствором, содержащим
Гемолиз, %
Hemolysis, %
30 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
0 5 10 15 20
только 20%-й ОЭГn = 25 (рис. 1). При этом наблю-
далась такая же тенденция, как и при введении в
криоконсервант проникающих криопротекторов в
концентрации 5%: наличие в криозащитном
растворе 10% 1,2-ПД и ДМАц снижало величину
гемолиза с 3,6 ± 0,86 до 1,2 ± 0,22 и 1,08 ± 0,12%
соответственно.
Уровень гемолиза эритроцитов, замороженных-
отогретых с 15% ОЭГn = 25, в данной серии экспе-
риментов был наиболее высоким (18,2 ± 0,94%).
Введение в состав криозащитных сред 15% 1,2-
ПД, ДМСО или ДМАц позволило снизить этот
показатель более чем в 9 раз (рис.1), а наиболее
значительно (до 1,3 ± 0,45%) – при использовании
комбинации 15% ОЭГn = 25 с 15% ДМАц.
Важным показателем структурной целостности
криоконсервированных эритроцитов, а также их
пригодности для клинического использования яв-
ляется количество свободного гемоглобина в кле-
точной взвеси. В соответствии с существующими
стандартами качества гемотрансфузионных сред
количество свободного гемоглобина во взвеси не
должно превышать 0,2 г на дозу эритроцитов или
1,2 г/л [1, 26].
Количество свободного гемоглобина во взвеси
эритроцитов, криоконсервированных в базовом
30%-м растворе ОЭГn = 25, составило 0,96 ± 0,52 г/л
(М ± S). Снижение концентрации ОЭГn = 25 в
криозащитных растворах до 25, 20 и 15% приво-
(18.2 ± 0,94%) in this series of experiments. Supple-
mentation of cryopreservative with 15% of 1,2-PD,
DMSO or DMAc has reduced the index more than 9
times (Fig. 1), and most significantly (down to 1.3 ±
0.45%) in the case of combination of 15% OEGn = 25
and 15% DMAc.
An important indicator of the structural integrity of
cryopreserved RBCs, as well as their fittness for cli-
nical purposes is the amount of free hemoglobin in the
cell suspension. In accordance with the existing quality
standards for blood transfusion media the amount of
free hemoglobin in the suspension shall not exceed 0.2
g per dose of RBCs, or 1.2 g per liter [1, 26].
The amount of free hemoglobin in the RBC
suspension, cryopreserved in a basic 30% OEGn = 25
solution, was 0.96 ± 0.52 g/l (M ± S). Reducing the
concentration of OEGn = 25 in cryoprotective solutions
down to 25, 20 and 15% resulted in increased content
of free hemoglobin in the suspension of thawed cells
up to 1.4 ± 0.28; 5.0 ± 0.91 and 17.8 ± 0.9 g/l,
respectively. After freeze-thawing of RBCs in combi-
ned cryoprotective media containing OEGn = 25 and 1,2-
PD, DMSO or DMAc in 5:1 ratio, a slight increase in
the level of free hemoglobin in the suspension was
noted comparing to both 25% and 30% OEGn = 25
solutions (Fig. 2). The combination of cryoprotectants
in the solution in 2:1 and 1:1 ratios has reduced the
level of free hemoglobin in the cell suspension, compa-
red to 20 and 15% OEGn = 25 solution, and the most
30% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% 1,2-ПД/1,2-PD
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% ДМСО/DMSO
25% ОЭГn=25+5% ДМАц/DMAc
20% ОЭГn=25/OEGn=25
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% 1,2-ПД/1,2-PD
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМСО/DMSO
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМАц/DMAc
15% ОЭГn=25/OEGn=25
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% 1,2-ПД/1,2-PD
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМСО/DMSO
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМАц/DMAc
Рис. 2. Свободный гемоглобин в надосадке после замораживания-
отогрева эритроцитов в растворах, содержащих комбинации крио-
протекторов.
Fig. 2. Free hemoglobin content in supernatant after freeze-thawing of
RBCs in solutions with cryoprotectants.
дило к повышению уровня свободного
гемоглобина во взвеси разморожен-
ных клеток до 1,4 ± 0,28; 5,0 ± 0,91 и
17,8 ± 0,9 г/л соответственно. После
замораживания-отогрева эритроцитов
в комбинированных криозащитных
средах, содержащих ОЭГn = 25 и 1,2-
ПД, ДМСО или ДМАц в соотношении
5:1, отмечено незначительное увели-
чение уровня свободного гемоглобина
во взвеси по сравнению как с 25%-м,
так и с 30%-м ОЭГn = 25, (рис. 2). Ком-
бинация криопротекторов в растворе
в соотношении 2:1 и 1:1 способство-
вала снижению уровня свободного
гемоглобина в клеточной взвеси по
сравнению с 20 и 15%-ми растворами
ОЭГn = 25, а наиболее значительно (до
1,25 ± 0,82 г/л) – при замораживании
эритроцитов в растворе, содержащем
20% ОЭГn = 25 и 10% ДМАц. Однако
достичь уровня контроля (30%-й раст-
вор ОЭГn = 25) по данному показателю
не удалось: содержание свободного
гемоглобина во взвеси эритроцитов
после замораживания в комбиниро-
ванных криозащитных средах было
Уровень свободного гемоглобина, г/л
Content of free hemoglobin, g/l
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
31
осмотической хрупкости размороженных эритро-
цитов возрастала, превысив показатели для базо-
вого контроля более чем в 2,5–5 раз (рис. 4).
При использовании комбинированных криоза-
щитных сред получены неоднозначные результаты.
Так, сочетание 25%-го ОЭГn = 25 с 5%-м 1,2-ПД,
ДМСО или ДМАц (соотношение 5:1) способство-
вало достоверному снижению осмотической хруп-
кости размороженных эритроцитов по сравнению
с 25%-м ОЭГn = 25 (рис. 4). После замораживания-
отогрева эритроцитов в средах, содержащих ком-
бинацию ОЭГn = 25 с 1,2-ПД или ДМСО в соотноше-
нии 2:1 или 1:1, отмечено резкое увеличение их
осмотической хрупкости в 0,6 и 0,9%-х растворах
NaCl по сравнению как с соответствующими конт-
ролями, так и с 30% ОЭГn = 25 (рис. 5). И лишь ис-
пользование в составе криозащитных растворов
комбинации ОЭГn = 25 и ДМАц (соотношение 2:1 и
1:1) позволило значительно увеличить сохранность
эритроцитов: показатели осмотической хрупкости
эритроцитов, криоконсервированных в среде с 20%
ОЭГn = 25 и 10% ДМАц, составили 10,2 ± 0,98 и 8,9 ±
0,83% для 0,6 и 0,9%-х растворов NaCl соответст-
венно. Однако наиболее устойчивыми к осмоти-
ческим воздействиям оказались эритроциты, крио-
консервированные в растворе, содержащем 15%
ОЭГn = 25 и 15% ДМАц. Осмотическая хрупкость
этих эритроцитов в 0,9 и 0,6%-х растворах NaCl
significantly (down to 1.25 ± 0.82 g/l ) after freeze-
thawing of RBCs in a solution contained 20% OEGn = 25
and 10% DMAc. However, the control level (30%
OEGn = 25 solution ) in terms of this index was not
achieved: the content of free hemoglobin in RBC
suspension after freeze-thawing in combined cryo-
protective media was higher, especially in the case of
1:1 cryoprotectant mixtures (Fig. 2).
Cryopreservation of RBCs in combined cryoprotec-
tive solution resulted in an increase in hematocrit after
freeze-thawing, compared with solutions containing 30,
25, 20 and 15% concentration of OEGn = 25, which
indirectly indicated a decrease in the degree of cell
dehydration (Fig. 3). No strong relationship of this
parameter and the composition of cryoprotective me-
dia, as well as no correlation between its level and
survival of frozen-thawed RBCs has been established.
An informative measure of RBC membrane integ-
rity is an osmotic fragility index. After freeze-thawing
of RBCs in 30% solution OEGn = 25 their osmotic
fragility in 0.6 and 0.9% NaCl solution was 11,7 ± 2,57
and 10,5 ± 1,9%, respectively. However, with the
reduction of OEGn = 25concentration down to 25, 20
and 15% the the osmotic fragility of frozen-thawed
RBCs increased, exceeding the basic control more than
2.5–5 times (Fig. 4).
Some ambiguos results were obtained during inves-
tigation of combined cryoprotective media. For examp-
0 5 10 15 20 25 30 35
30% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% 1,2-ПД/1,2-PD
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% ДМСО/DMSO
25% ОЭГn=25+5% ДМАц/DMAc
20% ОЭГn=25/OEGn=25
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% 1,2-ПД/1,2-PD
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМСО/DMSO
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМАц/DMAc
15% ОЭГn=25/OEGn=25
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% 1,2-ПД/1,2-PD
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМСО/DMSO
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМАц/DMAc
Гемолиз, %
Hemolysis, %
Рис. 3. Показатель гематокрита эритроцитов после замораживания-
отогрева в растворах, содержащих комбинации криопротекторов
(данные представлены до удаления криопротекторов).
Fig. 3. RBCs hematocrit after freeze-thawing in solutions with cryo-
protectants (data were obtained before cryoprotectant removal).
более высоким, особенно при соотно-
шении криопротекторов 1:1 (рис. 2).
Криоконсервирование эритроцитов
в комбинированных криозащитных
растворах приводило к увеличению
показателя гематокрита после замо-
раживания-отогрева по сравнению с
растворами, содержащими 30, 25, 20
и 15%-е концентрации ОЭГn = 25, что
косвенно свидетельствует об умень-
шении степени дегидратации (обезво-
живания) клеток (рис. 3). Существен-
ной зависимости величины этого пока-
зателя от состава криозащитных сред,
а также корреляции между его величи-
ной и показателями сохранности крио-
консервированных эритроцитов уста-
новлено не было.
Информативным критерием це-
лостности мембраны эритроцитов яв-
ляется показатель осмотической хруп-
кости. После замораживания-отогрева
эритроцитов в 30%-м растворе ОЭГn = 25
их осмотическая хрупкость в 0,6 и
0,9%-х растворах NaCl составила 11,7
± 2,57 и 10,5± 1,9% соответственно.
Однако по мере снижения концентра-
ции ОЭГn = 25 до 25; 20 и 15% величина
32 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
связано с его способностью взаимодействовать с
липидными компонентами мембран, в результате
чего площадь поверхности плазматической мем-
браны может увеличиваться, а соотношение объем
клетки/площадь поверхности мембраны умень-
шаться, что снижает опасность развития коллоид-
но-осмотического лизиса.
Введение в криозащитные среды на основе
ОЭГn = 25 низкомолекулярных 1,2-ПД или ДМСО в
10 или 15%-й концентрации вызывало резкое
увеличение осмотической хрупкости разморожен-
ных эритроцитов. Вероятно, данный эффект может
быть следствием как прямого воздействия хими-
ческих веществ, в частности ДМСО, на клеточ-
ную мембрану (токсичность), так и результатом
осмотических эффектов комбинированных раство-
ров. Ранее было показано [28, 39], что повреждаю-
щее действие ДМСО в процессе замораживания-
отогрева может быть обусловлено деструктури-
зацией липидного бислоя за счет гидрофобных
взаимодействий метильной группы ДМСО с угле-
водными компонентами фосфолипидов. Так,
ДМСО в концентрациях от 2,5 до 7,5 моль% вызы-
вает истончение мембраны и увеличивает теку-
честь её гидрофобных компонентов [28]; повыше-
le, the combination of 25% OEGn = 25 with a 5% 1,2-PD,
DMSO or DMAc (in 5:1 ratio) contributed to a signifi-
cant reduction of osmotic fragility of frozen-thawed
erythrocytes if compared with 25% OEGn = 25 (Fig. 4).
After freeze-thawing of RBCs in the media containing
a combination of OEGn = 25 with 1,2-PD or DMSO in a
ratio of 2:1 or 1:1, there was a sharp increase in their
osmotic fragility in 0.6 and 0.9% NaCl solutions if com-
pared with appropriate controls, as well as with 30%
OEGn = 25 (Fig. 5). Only in the case of cryoprotective
solution with combination of OEGn = 25 and DMAc (2:1
and 1:1 ratios) the RBC survival increased significantly:
osmotic fragility of RBCs frozen-thawed in the medium
with 20% OEGn = 25 and 10% DMAc was 10.2 ± 0.98
and 8.9 ± 0.83% in 0.6 and 0.9% NaCl solutions,
respectively. However, the most resistant to osmotic
effects were the RBCs frozen-thawed in the solution
contained 15% OEGn = 25 and 15% DMAc. The osmotic
fragility of these cells in 0.9 and 0.6% NaCl solutions
was the lowest and made 3.6 ± 0.23 and 4.1 ± 0.18%
respectively, i. e. using a combination of OEGn = 25 and
DMAc (in 1:1 ratio) has reduced the osmotic fragility
of frozen-thawed RBCs more than 10 times if com-
pared with 15% OEGn = 25 solution and more than 3
times if compared with OEGn = 25 30% solution.
**
**
*
*
##
0 20 40 60 80 100
30% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% 1,2-ПД/1,2-PD
25% ОЭГn=25/OEGn=25+5% ДМСО/DMSO
25% ОЭГn=25+5% ДМАц/DMAc
20% ОЭГn=25/OEGn=25
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% 1,2-ПД/1,2-PD
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМСО/DMSO
20% ОЭГn=25/OEGn=25+10% ДМАц/DMAc
15% ОЭГn=25/OEGn=25
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% 1,2-ПД/1,2-PD
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМСО/DMSO
15% ОЭГn=25/OEGn=25+15% ДМАц/DMAc
Гемолиз, %
Hemolysis, %
Рис. 4. Осмотическая хрупкость эритроцитов после замораживания-
отогрева в растворах, содержащих комбинации криопротекторов ( –
0,6% раствор NaCl, –- 0,9% NаCl; * # – отличия статистически
достоверны по сравнению с 25 и 30% ОЭГn=25 соответственно, р ≤
0,05).
Fig. 4. RBCs osmotic fragility after freeze-thawing in solutions with cryo-
protectants ( – 0.6% NaCl solution; – 0.9% NaCl solution; * # – the
differences are statistically significant comparing to 25 and 30% OEGn=25
solutions, respectively, р ≤ 0.05)
была самой низкой и составила 3,6 ±
0,23 и 4,1 ± 0,18% соответственно, т. е.
использование комбинации ОЭГn = 25 и
ДМАц (соотношение 1:1) способство-
вало снижению осмотической хрупкос-
ти размороженных эритроцитов более
чем в 10 раз по сравнению с 15%-м
раствором ОЭГn = 25 и более чем в 3
раза – по сравнению с 30%-м раство-
ром ОЭГn = 25.
При сравнительном изучении осмо-
тической хрупкости криоконсервиро-
ванных эритроцитов в гипотонических
растворах NaCl (рис. 5) установлено,
что в 0,5–0,1%-х растворах NaCl ве-
личины этого показателя были нес-
колько выше у эритроцитов, заморо-
женных в 30%-м растворе ОЭГn = 25,
тогда как в 0,7 и 0,9%-х растворах
NaCl более устойчивыми оказались
эритроциты, замороженные с комби-
нированным раствором, содержащим
15% ОЭГn = 25 и 15% ДМАц.
Известно, что ДМАц характери-
зуется наиболее высокой способнос-
тью к гидрофобным взаимодейст-
виям по сравнению с 1,2-ПД и ДМСО
[8]. По-видимому, положительное
влияние ДМАц в составе комбиниро-
ванных криозащитных сред на осмо-
тическую устойчивость эритроцитов
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
33
**
0
20
40
60
80
100
120
0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
* *
ние концентрации ДМСО до 10–20 моль% способно
инициировать образование транзиторных водных
пор в мембранах; дальнейшее повышение концент-
рации (30 моль% и более) приводит к структурной
дезинтеграции бислоя [28, 39].
Отсутствие эффекта от использования в ком-
бинированных растворах 10 и 15%-х концентраций
1,2-ПД может объясняться тем, что этот криопро-
тектор снижает вязкость фосфолипидного бислоя
мембран эритроцитов и индуцирует дезагрегацию
их белковых комплексов, что также может приво-
дить к нарушению структуры эритроцитарных
мембран [15].
Если оценивать эффективность использования
ДМСО, 1,2-ПД или ДМАц в комбинации с ОЭГn = 25
с точки зрения их положительного влияния на со-
хранность замороженных-отогретых эритроцитов
по показателям осмотической хрупкости, то наибо-
лее эффективным криопротектором в составе ком-
бинированного криоконсерванта является ДМАц
в концентрации 10 или 15%. Эти данные представ-
ляют особый интерес, так как впервые удалось
значительно снизить осмотическую хрупкость эри-
троцитов, замороженных в криозащитной среде с
непроникающим полимерным криопротектором
ОЭГn = 25. Можно предположить, что отсутствие
значимых отличий в сохранности замороженных
эритроцитов по показателям гемолиза и свобод-
ного гемоглобина между комбинированными
средами и 30%-м ОЭГn = 25 обусловлено высокой
криозащитной активностью базового раствора не-
проникающего криопротектора.
Известно, что эритроциты, криоконсервирован-
ные под защитой непроникающих криопротекторов,
характеризуются достаточно высоким уровнем
Comparison of osmotic fragility of RBCs frozen-
thawed in hypotonic solutions NaCl (Fig. 5) revealed
that in the 0.5–0.1% NaCl solutions the values of this
index were slightly higher in RBCs, frozen-thawed in
30% OEGn = 25 solution, whereas in 0.7 and 0.9% NaCl
solutions more resistant were the RBCs, frozen-thawed
in a combined solution contained 15% OEGn = 25 and
15% DMAc.
It is known that DMAc has the highest potential
for hydrophobic interactions, if compared with 1,2-PD
and DMSO [8]. Positive effect of DMAc as a compo-
nent of combined cryoprotective media on RBC
osmotic stability is apparently associated with its ability
to interact with lipid components of membranes,
resulting in the increased plasma membrane surface
and the decreased cell volume-to-surface ratio, which
reduces the risk of colloid osmotic lysis.
Introduction to the cryoprotective medium based
on OEGn = 25 of low molecular weight 1,2-PD or DMSO
at 10 or 15% concentration caused a sharp increase in
osmotic fragility of thawed RBCs. Probably, this effect
may be due to both direct effects of the substances,
DMSO in particular, on the cell membrane (toxicity),
and the result of the osmotic effects caused by
combined solutions. It was previously shown [28, 39],
that the damaging effect of DMSO during freeze-
thawing could be caused by affecting the lipid bilayer
structure due to hydrophobic interactions of the methyl
group of DMSO with carbohydrate components of
phospholipids. For example, DMSO at a concentration
of 2.5 to 7.5 mol% caused a thinning of membrane
and increased the fluidity of its hydrophobic components
[28], increasing the concentration of DMSO up to 10–
20 mol% could initiate the formation of transient water
pores in membranes, further increasing the concentra-
tion (30 mol% or higher) caused the structural disinteg-
ration of the bilayer [28, 39].
Lack of positive effect after supplemetation of the
combined solution with 10 or 15% 1,2-PD may be due
to the fact that this cryoprotectant reduces the viscosity
of the phospholipid bilayer of RBC membranes and
induces disaggregation of protein complexes, which
can also lead to impairment of the RBC membrane
structure [15] .
Evaluation of the efficiency of utilization of DMSO,
1,2-PD or DMAc combined with OEGn = 25 in terms of
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Рис. 5. Осмотическая хрупкость эритроцитов в гипото-
нических растворах NaCl: – 30% ОЭГn=25; – 15%
ОЭГn=25 + 15% ДМАц (* – отличия статистически
достоверны по сравнению с 30% ОЭГn=25, р ≤ 0,05).
Fig. 5. RBCs osmotic fragility in hypotonic NaCl solutions:
– 30% OEGn=25; – 15% OEGn=25 + 15% DMAc ; * # – the
differences are statistically significant comparing to 30%
OEGn=25 solution, р ≤ 0.05)
34 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
показателей сохранности сразу после отогрева [2,
17, 35]. Вместе с тем криоконсервирование эрит-
роцитов в растворах непроникающих криопротек-
торов может приводить к развитию латентных по-
вреждений их мембран, которые проявляются,
прежде всего, в нарушении липидной асимметрии
и модификации цитоскелет-мембранного комплек-
са клеток [5, 34]. До настоящего времени возмож-
ные пути предотвращения латентных повреждений
исследованы недостаточно. По мнению D.V. Pribor
[32] латентные повреждения эритроцитов после
отогрева обнаруживаются не сразу, а проявляются
лишь в снижении их осмотической устойчивости и
нарастании гемолиза в процессе последующего
гипотермического хранения.
Принимая во внимание этот факт, мы исследо-
вали сохранность эритроцитов, криоконсервиро-
ванных в 30%-м растворе ОЭГn = 25 и комбинирован-
ном растворе 15% ОЭГn = 25 с 15% ДМАц и взве-
шенных после отогрева в плазмозамещающем
растворе ЦОЛИПК-8в, в процессе их гипотерми-
ческого хранения при (4 ± 2)°С в течение 1, 24 и 48 ч.
Более высокий уровень сохранности криоконсер-
вированных эритроцитов по показателю их осмоти-
ческой хрупкости в 0,6 и 0,9%-х растворах NaCl в
течение 48-часового гипотермического хранения
установлен для криозащитной среды, содержащей
комбинацию 15% ОЭГn=25 и 15% ДМАц, однако по-
казатели гемолиза и содержание свободного гемо-
глобина были значительно ниже в образцах, крио-
консервированных в 30%-м растворе ОЭГn = 25 (таб-
лица).
Следует особо подчеркнуть, что после 24 ч ги-
потермического хранения в растворе ЦОЛИПК-8в
содержание свободного гемоглобина во взвеси кле-
ток, замороженных-отогретых в 30%-м ОЭГn=25,
соответствовало стандартам, установленным для
криоконсервированных эритроцитов, предназначен-
ных для трансфузий [1, 26]. После 48 ч гипотерми-
ческого хранения эритроцитов, криоконсервирован-
ных как в 30%-м ОЭГn = 25, так и 15%-м ОЭГn = 25 с
15% ДМАц, содержание свободного гемоглобина
во взвеси увеличивалось, а показатели гемолиза, ос-
мотической хрупкости и гематокрита снижались.
Приведенные данные отчасти подтверждают
гипотезу Ф.Р. Виноград-Финкель [6] о наличии
скрытых повреждений мембраны лишь в неболь-
шой фракции эритроцитов из общей их популяции.
Увеличение уровня свободного гемоглобина во
взвеси на фоне снижения показателя гематокрита,
а также снижение показателей гемолиза и осмоти-
ческой хрупкости эритроцитов после 48 ч гипотер-
мического хранения могут свидетельствовать о
том, что часть фракции поврежденных эритроцитов
лизировала, а оставшиеся клетки имели большую
осмотическую устойчивость.
their positive impact on the survival of frozen-thawed
erythrocyte by osmotic fragility indices, indicated
DMAc in 10 or 15% concentration to be the most
effective cryoprotectant in the combined cryoprotec-
tant medium. These data are of particular interest be-
cause it was the first succesfull attempt to significantly
reduce the osmotic fragility of RBCs, frozen-thawed
in cryoprotective medium with non-penetrative poly-
meric cryoprotectant OEGn = 25. One could assume that
the absence of significant differences in the survival
of frozen-thawed RBCs in terms of hemolysis and free
hemoglobin indices between the combined media and
30% OEGn = 25 solution was due to high cryoprotective
activity of basic solution of non-penetrating cryopro-
tectant.
It is known that RBCs frozen-thawed under the
protection of non-penetrating cryoprotectants, are
characterized by rather high survival immediately after
thawing [2, 17, 35]. However, freeze-thawing of RBCs
in non-penetrating cryoprotectants solutions could lead
to the development of latent damages in the membranes,
primarily, in the lipid asymmetry derangements and
modified cytoskeleton-membrane complex of the cells
[5, 34]. To date, the possible ways to prevent latent
damages have been poorly investigated. According to
Pribor [32], latent post-thaw damages in RBCs could
not be detected immediately, but appear only as reduced
osmotic stability and increasing hemolysis during
subsequent hypothermic storage.
Taking this into account, we investigated the survival
of RBCs, frozen-thawed in 30% OEGn = 25 solution and
combined solution of 15% OEGn = 25 and 15% DMAc,
suspended after thawing in plasma-substitute
TsOLIPK-8v, and stored at (4 ± 2)°C for 1, 24 and
48 hrs.
Higher level of frozen-thawed RBCs survival in
terms their osmotic fragility in 0.6 and 0.9% NaCl
solutions during 48-hour hypothermic storage was found
for the case of cryoprotective medium contained a
combination of 15% OEGn = 25 and 15% DMAc,
however, the indices of hemolysis and free hemoglobin
content were significantly lower in the samples frozen-
thawed in 30% OEGn = 25 solution (Table).
It should be emphasized that after 24 hours of
hypothermic storage in TsOLIPK-8c solution the
content of free hemoglobin in the suspension of cells,
frozen-thawed in 30% OEGn = 25 solution conformed to
the standards set for cryopreserved RBCs intended
for transfusion [1, 26]. After 48 hrs of hypothermic
storage of RBCs, frozen-thawed in both 30% OEGn = 25
and 15% OEGn = 25 with 15% DMAc solutions the
content of free hemoglobin in the suspension increased,
and rates of hemolysis, osmotic fragility and hematocrit
decreased.
The above data partly support the hypothesis of
Vinograd-Finkel [6] about occurence of latent damages
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
35
üòñîíüëåòèëÄ
÷,ÿèíåíàðõ
,noitarudegarotS
srh
ðîâòñàðéûìåóäåëññÈ
noitulosdeidutS
%,üòñîêïóðõÿàêñå÷èòîìñÎ
%,ytiligarfcitomsO %,çèëîìåÃ
%,sisylomeH
%,çèëîìåÃ
,nibolgomeheerF
l/g
,òèðêîòàìåÃ
%
%,tircotameH
lCaN%6,0 lCaN%9,0
1
ÃÝÎ%03 52=n GEO/ 52=n 55,0±5,4 62,0±8,1 23,0±6,1 2,0±38,0 36,0±6,82
ÃÝÎ%51 52=n GEO/ 52=n
cAMD/öÀÌÄ%51+
62,0±8,1 * 52,0±7,0 * 1,1±2,5 * 67,0±3,2 * 4,0±7,72
42
ÃÝÎ%03 52=n GEO/ 52=n 52,0±9,6 95,0±22,7 82,0±8,1 91,0±78,0 15,0±2,82
ÃÝÎ%51 52=n GEO/ 52=n
cAMD/öÀÌÄ%51+
51,1±7,4 * 6,0±5,1 * 88,1±3,5 * 46,0±5,2 * 11,1±9,72
84
ÃÝÎ%03 52=n GEO/ 52=n 5,0±53,5 80,0±6 35,0±2,1 32,0±8,1 89,0±2,32
ÃÝÎ%51 52=n GEO/ 52=n
cAMD/öÀÌÄ%51+
72,0±1,1 * 93,0±1,1 * 26,0±8,1 52,0±78,2 3,1±9,52
of the membrane in only a small fraction of total RBC
population. Increasing levels of free hemoglobin in the
suspension on the background of decreased hematocrit
as well as the reduced hemolysis and osmotic fragility
of RBCs after 48 hrs of hypothermic storage may
indicate that some fraction of damaged red blood cells
were lysed, and the remaining cells had a greater
osmotic stability.
Conclusion
The results of the conducted research have shown
a high cryoprotective activity of extracellular cryopro-
tectant OEGn = 25 during freeze-thawing of human
RBCs.
The supplementing of cryoprotective solutions
based on OEGn = 25 with penetrating cryoprotectants
1,2-PD, DMSO or DMAc in 5:1 ratio, as well as with
DMAc in 2:1 and 1:1 ratios allowed to reduce the
osmotic fragility of frozen-thawed RBCs. The highest
level of osmotic stability of frozen-thawed RBCs was
obtained in case of solution contained OEGn = 25 and
DMAc in 1:1 ratio. Thus, for the first time we succeded
to reduce significantly the osmotic fragility of RBCs
after the freeze-thawing of the cells in the solution
based on extracellular polymeric cryoprotectant
OEGn = 25.
Hypothermic storage during 48 hrs of RBCs
frozen-thawed in OEGn = 25 solution combined with other
cryoprotectants or as single cryoprotectant and sus-
pended after thawing in plasma-substitute solution
TsOLIPK-8c resulted in insignificant loss of cells (in
terms of hematocrit index), as well as no significant
increase in indices of hemolysis, free hemoglobin
content and osmotic fragility were found. These data
Выводы
Результаты проведенных исследований показа-
ли высокую криозащитную активность экстрацел-
люлярного криопротектора ОЭГn = 25 при замора-
живании эритроцитов донорской крови человека.
Введение в состав криозащитных растворов на
основе ОЭГn = 25 проникающих криопротекторов
1,2-ПД, ДМСО или ДМАц в соотношении 5:1, а
также ДМАц в соотношении 2:1 и 1:1 способство-
вало уменьшению осмотической хрупкости размо-
роженных эритроцитов. Наиболее высокий уровень
осмотической устойчивости криоконсервирован-
ных эритроцитов получен при использовании
раствора, содержащего ОЭГn = 25 и ДМАц в соотно-
шении 1:1. Таким образом, впервые при заморажи-
вании эритроцитов в криоконсерванте на основе
полимерного экстрацеллюлярного криопротектора
ОЭГn = 25 удалось значительно снизить их осмоти-
ческую хрупкость.
По результатам экспериментов по 48-часовому
гипотермическому хранению эритроцитов, криокон-
сервированных с ОЭГn = 25 в составе комбинирован-
ного или однокомпонентного раствора и взвешен-
ных после отогрева в плазмозамещающем раство-
ре ЦОЛИПК-8в, установлены отсутствие сущест-
венных потерь клеток (показатель гематокрита),
а также значительного увеличения показателей ге-
молиза, свободного гемоглобина и осмотической
хрупкости. Полученные данные можно трактовать
как подтверждение целесообразности применения
в качестве непроникающего криопротектора для
замораживания эритроцитов ОЭГn = 25, а также необ-
ходимости дальнейших исследований по созданию
комбинированных криоконсервантов на его основе.
Сохранность размороженных эритроцитов, криоконсервированных в 30%-м растворе ОЭГn = 25 и 15%-м ОЭГn = 25
с 15% ДМАц, в процессе гипотермического хранения в среде ЦОЛИПК-8в при температуре 4 ± 2°С (M ± S; n = 5)
Survival of RBCs during hypothermic storage at (4 ± 2)°C in COLIPK-8v medium after freeze-thawing in 30% OEGn = 25
solution, and 15% OEGn = 25 with 15% DMAc solution (M ± S; n = 5)
Примечание: * – отличия статистически достоверны по сравнению с 30%-м раствором ОЭГn = 25, p ≤ 0,05.
Note: * – the differences are statistically significant if compared with 30% OEGn = 25 solution, p ≤ 0.05.
36 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
Литература
1. Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее
клиническое применение. – М.: Медицина, 1983. – 96 с.
2. Бабийчук Л.А. Конформационные изменения эритроцитов
под влиянием криопротектора ПЭО-1500 // Проблемы
криобиологии. – 1997. – № 1–2. – С. 95–99.
3. Бабийчук Л.А., Землянских Н.Г. Оптимизация и преиму-
щества безотмывочного метода криоконсервирования
эритроцитов с ПЭО–1500 // Проблемы криобиологии. –
2001. – №1. – С. 35–41.
4. Багаутдинов Ш.М. Совершенствование методов долго-
срочного хранения крови и костного мозга в заморожен-
ном состоянии в службе крови Вооруженных Сил: Авто-
реф. дис. … докт. биол. наук. – СПб, 2000. – 31 c.
5. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения био-
логических мембран при охлаждении. – Киев: Наук. думка,
1982. – 255 с.
6. Виноград-Финкель Ф.Р., Леонтович В.А. Теоретические
проблемы криоконсервированных клеток крови // Проб-
лемы гематологии и переливания крови. – 1977. – Т. 22,
№2. – С.3–9.
7. Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И., Семенова Н.В.
Полноценность эритроцитов, хранившихся 12–16 лет при
–196°С // Проблемы гематологии и переливания крови. –
1980. – Т. 25, №1. – С. 8–11.
8. Гордієнко О.І., Гордієнко Є.О., Ліннік Т.П., Компанієць А.М.
Механізми проникання кріопротекторів крізь мембрани
еритроцитів // Проблемы криобиологии. – 2002. – №4. –
С. 9–15.
9. Есипова Ю.С., Николенко А.В., Чеканова В.В., Компа-
ниец А.М. Влияние оксиэтилированных производных
глицерина на устойчивость эритроцитов к действию ги-
пертонического стресса // Материалы VII Международной
научно-технической конференции «Актуальные вопросы
биологической физики и химии. БФФХ». – 2011. – С. 76–77.
10. Животова Е.Н., Зинченко А.В., Чеканова В.В., Компа-
ниец А.М. Термический анализ бинарных систем вода –
оксиэтилированный глицерин (степень полимеризации n =
5 и 25) при температурах ниже 273 К // Доп. НАН України. –
2006. – №9. – С. 74–79.
11. Животова Е.Н., Кулешова Л.Г., Зинченко А.В., Чекано-
ва В.В. Исследование физических состояний бинарных
систем вода – оксиэтилированный глицерин со степенью
полимеризации n = 5 и 25 при температурах ниже 273 К
методом криомикроскопии // Доп. НАН України. – 2007. –
№4. – С. 78–84.
12. Козлов А.А., Простакова Т.М., Берковский А.Л. Пособие
для врачей-лаборантов по методу определения гемогло-
бина. – М.: НПО «Ренам», 2006. – 26 с.
13. Компаниец А.М., Николенко А.В., Чеканова В.В., Троц Ю.П.
Криоконсервирование эритроцитов под защитой олиго-
мера оксиэтилированного глицерина // Проблемы крио-
биологии. –2005. – Т. 15, №3.– С. 561–565.
14. Компанієць А.М., Ніколенко О.В., Чеканова В.В., Єсіпо-
ва Ю.С. Кріозахисна ефективність середовищ на основі
оксиетильних похідних поліолів при заморожуванні ерит-
роцитів людини // Проблемы криобиологии. – 2008. – Т. 18,
№3. – С. 299–301.
15. Лоевский М.М. Влияние глицерина (пропантриола) и 1,2-
пропандиола на структурно-функциональные характерис-
тики криоконсервированных эритроцитов : Автореф.
дис. … канд. биол. наук. – Харьков, 1984. – 21 с.
16. Лубяный В.Г., Бредихина Л.П., Шраго М.И. Криопротектор-
ная активность олигомеров ОЭГ в низкотемпературном
консервировании эритроцитов // Криобиология и криоме-
дицина. – 1981. – Вып. 8. – С. 34–40.
17. Мартыненко А.А., Луговой В.И. Влияние ПЭО-1500 и низ-
ких температур на изоосмотическую резистентность
эритроцитов человека // Криобиология и криомедицина. –
1989. – Вып. 8. – С. 13–16.
can be interpreted as an approval of OEGn = 25 as the
prospective non-penetrating cryoprotectant for freeze-
thawing of RBCs, and that further research on the
creation of combined cryopreservatives on its base is
essential.
References
1. Agranenko V.A., Fedorova L.I. Frozen blood and its clinical
application. – M.: Medicine, 1983. – 96 p.
2. Babijchuk L.A. Conformational changes in erythrocytes under
the effect of PEO–1500 cryoprotectant // Problems of
Cryobiology. – 1997. – N1–2. – P. 95–99.
3. Babijchuk L.A., Zemlyanskikh N.G. Optimization and advan-
tanges of washing-out method for erythrocytes cryopreser-
vation with PEO-1500 // Problems of Cryobiology. – 2001. –
N1. – P. 35–41.
4. Bagautdinov S.M. Improving of long-term storage of blood and
bone marrow in a frozen state in Blood transfusion services
of the Armed Forces: Author’s abstract of thesis ... Doctor of
Biol. Sciences. – St. Petersburg, 2000. – 31 p.
5. Belous A.M., Bondarenko V.A. Structural changes in biological
membranes during cooling. – Kiev: Nauk. Dumka, 1982. – 255 p.
6. Vinograd-Finkel F.R., Leontovich V.A. Theoretical problems of
cryopreserved blood cells // Problemy Gematologii i Perelivaniya
Krovi. – 1977. – Vol. 22, N2. – P. 3–9.
7. Vinograd-Finkel F.R., Fedorova L.I., Semenova N.V. Valuability
of red blood cells, stored during 12–16 years at –196°C //
Problemy Gematologii i Perelivaniya Krovi. – 1980. – Vol. 25,
N1. – P. 8–11.
8. Gordienko O.I., Gordienko E.A., Linnik T.P., Kompaniets A.M.
Mechanisms of cryoprotectant permeation via erythrocytes
membranes // Problems of Cryobiology. – 2002. – N4. – P. 9–
15.
9. Yesipova Yu.S., Nikolenko A.V., Chekanova V.V., Kompa-
niets A.M. Influence of ethoxylated derivatives of glycerol on
the stability of red blood cells to the action of hypertonic
stress // Proceedings of the VII International Scientific and
Technical Conference ‘Actual Problems of Biological Physics
and Chemistry. BFFH’. – 2011. – P. 76–77.
10.Zhivotova E.N., Zinchenko A.V., Chekanova V.V., Kompa-
niets A.M. Thermal analysis of binary systems of water –
ethoxylated glycerol (degree of polymerization n = 5 and 25)
at temperatures below 273 K // Dopovidi of National Academy
of Sciences of Ukraine. – 2006. – N9. – P. 74–79.
11.Zhivotova E.N., Kuleshova L.G., Zinchenko A.V., Chekano-
va V.V. Investigation of the physical states of the binary
systems of water – glycerol ethoxylated with a degree of
polymerization of n = 5 and 25 at temperatures below 273 K
using cryomicroscopyi // Dopovidi of the National Academy of
Sciences of Ukraine. – 2007. – N4. – P. 78–84.
12.Kozlov A.A., Prostakova T.M., Berkovskiy A.L. Manual for
laboratory doctors for assessing hemoglobin content. –
Moscow, 2006. – 26 p.
13.Kompaniets A.M., Nikolenko A.V., Chekanova V.V., Trots Yu.P.
Cryopreservation of red blood cells under the protection of
the ethoxylated glycerol oligomer // Problems of Cryobiology. –
2005. – Vol. 15, N3. – P. 561–565.
14.Kompaniets A.M., Nikolenko O.V., Chekanova V.V., Yesipova
Yu.S. Cryoprotective efficiency of media based on oxyethyl
derivatives of polyols during freezing of human erythrocytes //
Problems of Cryobiology. – 2008. – Vol.18, N3. – P. 299–301.
15.Loevskiy M.M. Effect of glycerol (propane triol) and 1,2-
propane diol on the structural and functional characteristics
of cryopreserved erythrocytes: Author’s abstract of thesis ...
Candidate Biol. Sciences. – Kharkov, 1984. – 21 p.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
37
18. Межидов С.Х., Моисеев В.А., Нардид О. А. Дегидратация
эритроцитов компонентами криоконсервирующих сред //
Криобиология и криомедицина. – 1989. – №2. – С. 13–16.
19. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в
клинике: Методы гематологических исследований. – М.:
Медицина, 1987. – 363 c.
20. Ніколенко О.В., Єсіпова Ю.С., Компанієць А.М. Кріокон-
сервування еритроцитів людини під захистом полімерго-
мологу оксиетильованого гліцерину (ОЕГn = 30) // Гематологія
і переливання крові. – 2008. – Т. 34, Вип. 2. – С. 166–170.
21. Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Осмотические свойства
эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими
и проникающими криопротекторами // Проблемы криобио-
логии. – 2010. – Т. 20, № 1. – С. 47–57.
22. Сводный список товаров, потребление и/или продажа
которых запрещены, которые изъяты, строго ограничены
или не утверждены правительствами. Лекарственные
препараты / Департамент по экономическим и социаль-
ным вопросам. – Нью-Йорк, 1996. – 539 с.
23. Хайлачев Е.Е. Оптимизация программ криоконсервирова-
ния для резервирования гемотерапевтических средств:
Автореф. дис. … канд. мед. наук. – СПб, 2009. – 23 c.
24. Шраго М.И., Гучок М.М., Калугин Ю.В. Некоторые принципы
направленного синтеза криопротекторов // Актуальные
проблемы криобиологии / Под ред. Н.С.Пушкаря и А.М. Бе-
лоуса. – Киев: Наук. думка, 1981. – С. 157–201.
25. Chaudhari. S. Frozen red blood cells transfusion // MJAFI. –
2009. – Vol. 65, № 1. – P. 55–58.
26. Council of Europe guide to the preparation, use and quality
assurance of blood components. Recommendation R (95) 15,
11th. – Strasbourg: Council of Europe, 2005. – 266 р.
27. Fuller B.J. Cryoprotectants: The essential antifreezes to prot-
ect life in the frozen state // CryoLetters. – 2004. – Vol. 25,
№6. – P. 375–388.
28. Gurtovenko A.A., Anwar J. Modulating the structure and pro-
perties of cell membranes: the molecular mechanism of action
of dimethyl sulfoxide // J. Phys. Chem. B. – 2007.– Vol. 111,
№33. – P. 10453–10460.
29. Holovati J.L., Gyongyossy-Issa M.I., Acker J.P. Effect of tre-
galose-loaded liposomes on red blood cell response to freezing
and post-thaw membrane quality // Cryobiology. – 2009 – Vol.
58, №2. – P. 75–83.
30. Huggins C.E. Prevention of hemolysis of large volumes of red
blood cells slowly frozen and thawed in the presence of
dimethylsulfoxide // Transfusion. – 1963. – Vol. 3, № 1. – P.
483–493.
31. Lynch A.L., Chen R., Dominowski P.J. et al. Biopolymer media-
ted trehalose uptake for enhanced erythrocyte cryosurvival //
Biomaterials. – 2010. – Vol. 31, №23. – P. 6096–6103.
32. Pribor D.B. Osmotic рemolysis contrasted with freeze-thaw
hemolysis // Cryobiology. – 1971. – Vol. 8, №1. – P. 14–24.
33. Quan G., Zhang B. L., Guo Y. et al. Intracellular sugars improve
survival of human red blood cells cryopreservation at –80°C
in the presence of polyvinylpyrrolidone and human serum albu-
min // CryoLetters. – 2008. – Vol. 28, №2. – P. 95–108.
34. Singbartl K., Langer R., Henrich A. Altered membrane skeleton
of hydroxyethylstarh-cryopreserved human erythrocytes //
Cryobiology. – 1998 – Vol. 36, №2. – P. 115–123.
35.Sputtek A., Langer R., Singbartl G. Cryopreservation of red
blood cells with the non-penetrating cryoprotectant hydroxy-
ethyl starh // CryoLetters. – 1995. – Vol. 16, №4. – P. 283–
288.
36.Sputtek A., Kuehnl P., Rowe A.W. Cryopreservation of erythro-
cytes, thrombocytes and lymphocytes // Transfus. Med.
Hemother. – 2007. – Vol. 34, №4. – P. 262–267.
37.Sputtek A., Rowe A.W. Looking back from the future to the
present: biopreservation will get us there // Transfus. Med.
Hemother. – 2011. – Vol. 38, №1. – P. 85–87.
38.Stoll Ch., Wolkers W.F. Membrane stability during biopreser-
vation of blood cells // Transfus. Med. Hemother. – 2011. –
Vol. 38, №1. – P. 89–97.
16.Lubyanyi V.G., Bredikhina L.P., Shrago M.I. Cryoprotective
activity of OEG oligomers in the red cell low temperature
preservation // Kriobiologiya i Kriomeditsina. – 1981. – Issue
8. – P. 34–40.
17.Martynenko A.A., Lugovoy V.I. Effect of PEO-1500 and low
temperatures on the isoosmotic resistance of human erythro-
cytes // Kriobiologiya i Kriomeditsina. – 1989. – Issue 8. –
P. 13–16.
18.Mezhidov S.H., Moiseyev V.A., Nardid O.A. Dehydration of
erythrocyte caused by components of cryopreservation me-
dia // Kriobiologiya i Kriomeditsina. – 1989. – N2. – P. 13–16.
19.Menshikov V.V. Laboratory methods of investigation in the
clinic: Methods of hematological studies. – Moscow: Meditsina,
1987. – 363 p.
20.Nіkolenko O.V., Yesіpova Yu.S., Kompanіyets A.M. Cryo-
preservation of human erythrocytes under protection of poly-
mer homologue of oxyethylated glycerol (OEGn = 30) // Gema-
tologіya i Perelyvannya Krovі. – 2008. – Vol. 34, N2. – P. 166–
170.
21.Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Osmotic properties of
erythrocytes frozen in media containing non-penetrating and
penetrating cryoprotectants // Problems of Cryobiology. –
2010. – Vol. 20, N1. – P. 47–57.
22.Consolidated List of Products Whose Consumption and/or Sale
Have Been Banned, Withdrawn, Severely Restricted or Not
Approved by Governments. Pharmaceuticals. – New York,
1996. – 539 p.
23.Khaylachev E.E. Optimization of cryopreservation programs
for backup of hemotherapeutical means: Author’s abstract of
thesis ... Candidate Med. Sciences. – St. Petersburg, 2009. –
23 p.
24.Shrago M.I., Guchok M.M., Kalugin Yu.V. Some principles of
direct synthesis of cryoprotectants // In: Current Problems of
Cryobiology / Eds. N.S. Pushkar and A.M. Belous. – Kiev:
Naukova Dumka, 1981. – P. 157–201.
25. Chaudhari. S. Frozen red blood cells transfusion // MJAFI. –
2009. – Vol. 65, N1. – P. 55–58.
26. Council of Europe guide to the preparation, use and quality
assurance of blood components. Recommendation R (95) 15,
11th. – Strasbourg: Council of Europe, 2005. – 266 р.
27. Fuller B.J. Cryoprotectants: The essential antifreezes to prot–
ect life in the frozen state // CryoLetters. – 2004. – Vol. 25,
N6. – P. 375–388.
28. Gurtovenko A.A., Anwar J. Modulating the structure and pro-
perties of cell membranes: the molecular mechanism of action
of dimethyl sulfoxide // J. Phys. Chem. B. – 2007.– Vol. 111,
N33. – P. 10453–10460.
29. Holovati J.L., Gyongyossy-Issa M.I., Acker J.P. Effect of tre-
galose-loaded liposomes on red blood cell response to freezing
and post-thaw membrane quality // Cryobiology. – 2009 – Vol.
58, N2. – P. 75–83.
30. Huggins C.E. Prevention of hemolysis of large volumes of red
blood cells slowly frozen and thawed in the presence of
dimethylsulfoxide // Transfusion. – 1963. – Vol. 3, N1. – P. 483–
493.
31. Lynch A.L., Chen R., Dominowski P.J. et al. Biopolymer media-
ted trehalose uptake for enhanced erythrocyte cryosurvival //
Biomaterials. – 2010. – Vol. 31, N23. – P. 6096–6103.
32. Pribor D.B. Osmotic рemolysis contrasted with freeze–thaw
hemolysis // Cryobiology. – 1971. – Vol. 8, N1. – P. 14–24.
33. Quan G., Zhang B. L., Guo Y. et al. Intracellular sugars improve
survival of human red blood cells cryopreservation at –80°C
in the presence of polyvinylpyrrolidone and human serum
albumin // CryoLetters. – 2008. – Vol. 28, N2. – P. 95–108.
34. Singbartl K., Langer R., Henrich A. Altered membrane skeleton
of hydroxyethylstarh–cryopreserved human erythrocytes //
Cryobiology. – 1998 – Vol. 36, N2. – P. 115–123.
35. Sputtek A., Langer R., Singbartl G. Cryopreservation of red
blood cells with the non-penetrating cryoprotectant hyd-
roxyethyl starh // CryoLetters. – 1995. – Vol. 16, N4. – P. 283–
288.
38 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
39. Sum A.K., Pablo J.J. Molecular study on the influence of
dimethylsulfoxide on the structure of phospholipids bilayers //
Biophys. J. – 2003. – Vol. 85, №6. – P. 3636–3645.
40. Takahashi T., Hirsh A., Williams R.J. Mechanism of cryoprotec-
tion by extracellular polymeric solution // Biophys. J. – 1988. –
Vol. 54, №3. – P. 509–518.
41.Thomas M.J.G. The long term storage of blood cells // Current
problems of transfusion medicine in clinical practice / Ed. by
A.A.M. Todd, U. Rossi. – Milano: ESTM, 1993.– P. 117–120.
42. Thomas M. J.G., Parry E.S, Nash S.G., Bell S.H. A method for
the cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl
starch as a cryoprotectant // Transfusion Science. – 1996. –
Vol. 17, №3. – P. 385–396.
43. Valery C.R., Ragno G., Van Houten P. et al. Automation of the
glycerolization of red blood cells with high-separation bowl in
Haemonetics ACP 215 instruments// Transfusion.– 2005.–
Vol.45, №3.– P.1621–1627.
36. Sputtek A., Kuehnl P., Rowe A.W. Cryopreservation of eryth-
rocytes, thrombocytes and lymphocytes // Transfus. Med.
Hemother. – 2007. – Vol. 34, N4. – P. 262–267.
37. Sputtek A., Rowe A.W. Looking back from the future to the
present: biopreservation will get us there // Transfus. Med.
Hemother. – 2011. – Vol. 38, N1. – P. 85–87.
38. Stoll Ch., Wolkers W.F. Membrane stability during biopreser–
vation of blood cells // Transfus. Med. Hemother. – 2011. –
Vol.38, N1. – P. 89–97.
39. Sum A.K., Pablo J.J. Molecular study on the influence of
dimethylsulfoxide on the structure of phospholipids bilayers //
Biophys. J. – 2003 – Vol. 85, N6. – P. 3636–3645.
40. Takahashi T., Hirsh A., Williams R.J. Mechanism of cryoprotec–
tion by extracellular polymeric solution // Biophys. J. – 1988 –
Vol. 54, N3. – P. 509–518.
41.Thomas M.J.G. The long term storage of blood cells // Current
problems of transfusion medicine in clinical practice / Ed. by
A.A.M. Todd, U. Rossi. – Milano: ESTM, 1993.– P. 117–120.
42. Thomas M. J.G., Parry E.S, Nash S.G., Bell S.H. A method for
the cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl
starch as a cryoprotectant // Transfusion Science. – 1996. –
Vol. 17, N3. – P. 385–396.
43. Valery C.R., Ragno G., Van Houten P. et al. Automation of the
glycerolization of red blood cells with high-separation bowl in
Haemonetics ACP 215 instruments// Transfusion.– 2005.–
Vol.45, N3.– P. 1621–1627.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
39
|