Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде
Экспериментально показана возможность замены сыворотки крови в средах для криоконсервирования перевиваемых клеток на метилцеллюлозу (МЦ). Наиболее высокие показатели сохранности клеток после замораживания-отогрева обеспечивало использование в среде консервирования комбинации МЦ с диметилсульфоксидом...
Збережено в:
| Дата: | 2013 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68714 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде / C.В. Кощий, А.Н. Гольцев, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.М. Гурина, Л.В. Сокол // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 116-123. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68714 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-687142014-10-05T14:07:47Z Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде Кощий, С.В. Гольцев, А.Н. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Гурина, Т.М. Сокол, Л.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология Экспериментально показана возможность замены сыворотки крови в средах для криоконсервирования перевиваемых клеток на метилцеллюлозу (МЦ). Наиболее высокие показатели сохранности клеток после замораживания-отогрева обеспечивало использование в среде консервирования комбинации МЦ с диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентрациях 0,1 и 5% соответственно. После замораживания-отогрева в среде, содержавшей МЦ и не включавшей ДМСО, количество сохранных клеток существенно снижалось. Клетки, предварительно культивированные в среде с 0,5% эмбриональной сыворотки (ЭС) и 0,1% МЦ, показали лучшую сохранность после замораживания-отогрева в бессы-вороточной среде по сравнению с клетками, предварительно культивированными в среде с 10% ЭС. Експериментально показана можливість заміни сироватки крові в середовищах для кріоконсервування клітин, що перевиваються, на метилцелюлозу (МЦ). Найбільш високі показники збереженості клітин після заморожування-відігріву забезпечувало використання середовища консервування з комбінацією МЦ із диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентраціях 0,1 и 5% відповідно. Після заморожування-відігріву в середовищі, яке містило МЦ і не мало ДМСО, кількість збережених клітин істотно знижувалася. Клітини, які були попередньо культивовані в середовищі з 0,5% ембріональної сироватки (ЕС) і 0,1% МЦ, показали кращу збереженість після заморожування-відігріву в безсироватковому середовищі в порівнянні з клітинами, які були попередньо культивовані в середовищі з 10% ЕС. There was experimentally shown a possibility to replace blood serum for methylcellulose (MC) in the media for cryopreservation of inoculated cells. Combination of 0.1% MC with 5% dimethyl sufoxide (DMSO) in the preservation media provided the highest indices of post-thaw cell survival. Freeze-thawing of cells in the medium contained MC, but without DMSO resulted in a significant reduction of survived cells. The cells, which were pre-cultured in the medium with 0.5% fetal serum (FS) and 0.1% MC, showed higher survival post freeze-thawing in serum-free medium comparing to the cells, which we pre-cultured in the medium with 10% FS. 2013 Article Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде / C.В. Кощий, А.Н. Гольцев, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.М. Гурина, Л.В. Сокол // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 116-123. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. 2307-6143 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68714 57.043:615.014.41 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Кощий, С.В. Гольцев, А.Н. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Гурина, Т.М. Сокол, Л.В. Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Экспериментально показана возможность замены сыворотки крови в средах для криоконсервирования перевиваемых клеток на метилцеллюлозу (МЦ). Наиболее высокие показатели сохранности клеток после замораживания-отогрева обеспечивало использование в среде консервирования комбинации МЦ с диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентрациях 0,1 и 5% соответственно. После замораживания-отогрева в среде, содержавшей МЦ и не включавшей ДМСО, количество сохранных клеток существенно снижалось. Клетки, предварительно культивированные в среде с 0,5% эмбриональной сыворотки (ЭС) и 0,1% МЦ, показали лучшую сохранность после замораживания-отогрева в бессы-вороточной среде по сравнению с клетками, предварительно культивированными в среде с 10% ЭС. |
| format |
Article |
| author |
Кощий, С.В. Гольцев, А.Н. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Гурина, Т.М. Сокол, Л.В. |
| author_facet |
Кощий, С.В. Гольцев, А.Н. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Гурина, Т.М. Сокол, Л.В. |
| author_sort |
Кощий, С.В. |
| title |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| title_short |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| title_full |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| title_fullStr |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| title_full_unstemmed |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| title_sort |
защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68714 |
| citation_txt |
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании перевиваемых клеток в бессывороточной среде / C.В. Кощий, А.Н. Гольцев, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.М. Гурина, Л.В. Сокол // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 116-123. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT koŝijsv zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede AT golʹcevan zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede AT vysekancevip zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede AT marcenûkvf zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede AT gurinatm zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede AT sokollv zaŝitnyjéffektmetilcellûlozyprikriokonservirovaniiperevivaemyhkletokvbessyvorotočnojsrede |
| first_indexed |
2025-07-05T18:31:40Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:31:40Z |
| _version_ |
1836832837922193408 |
| fulltext |
УДК 57.043:615.014.41
C.В. Кощий*, А.Н. Гольцев, И.П. Высеканцев,
В.Ф. Марценюк, Т.М. Гурина, Л.В. Сокол
Защитный эффект метилцеллюлозы при криоконсервировании
перевиваемых клеток в бессывороточной среде
UDC 57.043:615.014.41
S.V. Koschiy*, A.N. Goltsev, I.P. Vysekantsev,
V.F. Martsenyuk, T.M. Gurina, L.V. Sokol
Protective Effect of Methylcellulose during Cryopreservation
of Inoculated Cells in Serum-Free Medium
Реферат: Экспериментально показана возможность замены сыворотки крови в средах для криоконсервирования пе-
ревиваемых клеток на метилцеллюлозу (МЦ). Наиболее высокие показатели сохранности клеток после замораживания-
отогрева обеспечивало использование в среде консервирования комбинации МЦ с диметилсульфоксидом (ДМСО) в
концентрациях 0,1 и 5% соответственно. После замораживания-отогрева в среде, содержавшей МЦ и не включавшей
ДМСО, количество сохранных клеток существенно снижалось. Клетки, предварительно культивированные в среде с 0,5%
эмбриональной сыворотки (ЭС) и 0,1% МЦ, показали лучшую сохранность после замораживания-отогрева в бессы-
вороточной среде по сравнению с клетками, предварительно культивированными в среде с 10% ЭС.
Ключевые слова: перевиваемые клетки, криоконсервирование, защитная среда, метилцеллюлоза.
Реферат: Експериментально показана можливість заміни сироватки крові в середовищах для кріоконсервування клітин,
що перевиваються, на метилцелюлозу (МЦ). Найбільш високі показники збереженості клітин після заморожування-відігріву
забезпечувало використання середовища консервування з комбінацією МЦ із диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентраціях
0,1 и 5% відповідно. Після заморожування-відігріву в середовищі, яке містило МЦ і не мало ДМСО, кількість збережених
клітин істотно знижувалася. Клітини, які були попередньо культивовані в середовищі з 0,5% ембріональної сироватки (ЕС)
і 0,1% МЦ, показали кращу збереженість після заморожування-відігріву в безсироватковому середовищі в порівнянні з
клітинами, які були попередньо культивовані в середовищі з 10% ЕС.
Ключові слова: клітини, які перевиваються, кріоконсервування, захисне середовище, метилцелюлоза.
Abstract: There was experimentally shown a possibility to replace blood serum for methylcellulose (MC) in the media for
cryopreservation of inoculated cells. Combination of 0.1% MC with 5% dimethyl sufoxide (DMSO) in the preservation media provided
the highest indices of post-thaw cell survival. Freeze-thawing of cells in the medium contained MC, but without DMSO resulted in a
significant reduction of survived cells. The cells, which were pre-cultured in the medium with 0.5% fetal serum (FS) and 0.1% MC,
showed higher survival post freeze-thawing in serum-free medium comparing to the cells, which we pre-cultured in the medium with
10% FS.
Key words: inoculated cells, cryopreservation, preservation medium, methylcellulose.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-41-11, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: sveta_kos@rambler.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 4111, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: sveta_kos@rambler.ru
Department of Long-Term Strorage of Biological Objects at Low
Temperatures and Cryomicrobiology, and Department of Cryobiol-
ogy of Reproductive System, Institute for Problems of Cryobiology
and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine,
Kharkov, Ukraine
Отдел долгосрочного хранения биологических объектов при низ-
ких температурах и криомикробиологии и отдел криобиологии
системы репродукции, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 28.08.2012
Принята в печать 30.01.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №2. – С. 116–123.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received August 28, 2012
Accepted January 30, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 2. – P. 116–123.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Современные протоколы криоконсервирования
перевиваемых клеточных культур предусмат-
ривают введение в состав консервирующей среды
криопротекторов и сыворотки крови [4, 5]. Сыво-
ротка крови является также обязательным компо-
нентом ростовых сред для культивирования кле-
точных культур [2, 5]. Криоконсервированные
клеточные культуры все шире используются в
медицине и биотехнологических процессах [1, 4].
В связи с тем, что сыворотка крови может содер-
жать ряд компонентов, варьирующих по наличию
Current protocols for cryopreservation of inocula-
ted cell cultures involve the introduction of cryopro-
tectants and blood serum into preservation medium
[4, 5]. Blood serum is also a mandatory component
of growth media for culturing the cell cultures [2, 5].
Cryopreserved cell cultures are increasingly widely
used in medicine and biotechnological processes [1,
4]. Since the blood serum can contain the range of
components with concentration varying from batch
to batch (immunoglobulins, various proteins and biolo-
gically active substances, infectious agents etc.) the
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
117
и концентрации в разных партиях изготовления
(иммуноглобулины, различные белки и биологи-
чески активные вещества, инфекционные агенты
и т.д.), приобрела актуальность проблема разработ-
ки препаратов для клеточной терапии с исполь-
зованием бессывороточных сред.
Внимание исследователей привлекла возмож-
ность замены сыворотки крови в составе консерви-
рующей среды на метилцеллюлозу (МЦ) – гетеро-
генный полимер с высокометилированными гидро-
фобными участками и низкометилированными
гидрофильными зонами. Водные растворы МЦ
обладают способностью к созданию гелеобразной
структуры в растворе [14]. Для этого полимера
характерны доступность, низкая стоимость, био-
совместимость, биодеградация обычными мета-
болическими путями, отсутствие иммуногенности,
отрицательного действия на адгезию и пролифе-
рацию клеток, а также сходство с натуральным
экстрацеллюлярным матриксом [15]. Метилцел-
люлоза применяется в виде биологически нейт-
рального геля (в концентрации 1,0–3,0%) как мат-
рица для культивирования нормальных и опухоле-
вых клеток в тканевой инженерии [12]. Установ-
лено, что МЦ в концентрации 0,1% при введении в
состав культуральных бессывороточных сред спо-
собствует повышению устойчивости мембраны
клеток к механическим стрессам и стимулирует
пролиферацию клеток [2, 10, 13]. Показана возмож-
ность применения МЦ в комбинации с диметил-
сульфоксидом (ДМСО) для криоконсервирования
перевиваемых клеточных культур, культивируе-
мых в свободной от сыворотки среде [3,11], первич-
ных культур астроцитов [17], мезенхимальных
стволовых клеток человека [16].
На основании вышесказанного целью работы
было изучение сохранности перевиваемых клеток
после криоконсервирования в бессывороточной
среде, содержащей МЦ в разных концентрациях.
Материалы и методы
Исследования проводили с тремя культурами
перевиваемых клеток: мышиными фибробластами
линии L929 и двумя сублиниями эпителиальных
клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-5, СПЭВ-0,5.
Фибробласты линии L929, полученные из коллек-
ции Института вирусологии им. Д.И. Ивановского
РАМН (Москва), культивировали в среде 199 с
добавлением 10% эмбриональной сыворотки (ЭС)
крупного рогатого скота («Биолот», Россия). Клет-
ки СПЭВ-5, полученные из коллекции ННЦ
«ИЭКВМ» УААН (Харьков), выращивали в среде
199 с добавлением 5% ЭС. Сублиния клеток
СПЭВ-0,5, адаптированная к росту в среде 199 с
issue of developing the preparations for cell-based
therapy on the base of serum-free media is signifi-
cant.
Methylcellulose (MC), heterogenic polymer with
highly methylated hydrophobic regions and lowly
methylated hydrophilic zones attracted the attention
of researchers as a possible alternative for blood se-
rum in the preservation medium. Aqueous solutions
of MC are able to form gel structures in the solution
[14]. This polymer is characterized by availability, low
cost, biocompatibility, biodegradation by common
metabolic ways, absence of immunogeneity, negative
effect on cell adhesion and proliferation as well as
similarity to natural extracellular matrix [15]. Methyl-
cellulose is applied as biologically neutral gel (in
concentration of 1.0–3.0%) being a matrix for culture
of normal and tumor cells in tissue engineering [12].It
was revealed that MC of 0.1% concentration added
into the culture serum-free media contributed to the
rise in cell membrane resistance to mechanic stress
and stimulated cell proliferation [2, 10, 13]. The pos-
sibility of using MC combined with dimethyl sulfoxide
(DMSO) was reported for cryopreservation of inocu-
lated cell cultures cultured in serum-free medium [3,
11], primary cultures of astrocytes [17], human me-
senchymal stromal cells [16].
In view of the above, the research aim was to
study the survival of inoculated cells after cryopre-
servation in serum-free medium containing MC in
different concentrations.
Materials and methods
The investigations were performed with three
cultures of inoculated cells: murine fibroblasts of
L929 line and two sublines of epithelial cells of
porcine embryo kidney SPEV-5, SPEV-0.5. Fibro-
blasts of L929 line obtained from the collection of
the Ivanovsky Institute of Virology of the Russian
Academy of Medical Sciences (Moscow, Russia)
were cultured in medium 199 with 10% fetal bovine
serum (FBS) (Biolot, Russia). Cells of SPEV-5 line
obtained from the collection of the Institute of Expe-
rimental and Clinical Veterinary Medicine of the Na-
tional Academy of Agricultural Sciences (Kharkov,
Ukraine) were grown in medium 199 with 5% FBS.
Cell subline SPEV-0.5 adapted to the growth in me-
dium 199 with 0.5% FBS and 0.1% MC was pre-
viously derived by us [3, 8]. Cell adaptation was
performed by stepwise decrease of FBS concent-
ration in culture medium by 0.5–1%. Each decrease
of FBS concentration was carried out following 6-
10 passages. Concentration of MC during adapta-
tion period was 0.1%. Cell cultures were grown in
glass cultural flasks of 0.2 l volume (area of culture
118 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
0,5% ЭС и 0,1% МЦ, была получена нами ранее
[3,8]. Для адаптации клеток поэтапно снижали кон-
центрацию ЭС в культуральной среде на 0,5–1%.
При каждом снижении концентрации ЭС проводи-
лось 6–10 пассажей. Концентрация МЦ в течение
адаптации составляла 0,1%. Клеточные культуры
выращивали в стеклянных культуральных флако-
нах объемом 0,2 л (площадь культуральной поверх-
ности 43 см2). Клеточные культуры пересевали
через 2–3 суток после образования в культураль-
ных флаконах конфлюэнтного монослоя. Посевная
доза во флакон составляла (0,8–2,0)×105 кл/мл.
Клетки линий L929 и СПЭВ-5 смывали со стекла
смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го
раствора Версена (оба раствора получены из
ГУПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, Россия) в
соотношении 1:4–1:5, а клетки линии СПЭВ-0,5 –
0,02%-м раствором Версена. Характер и динамику
формирования клеточного монослоя контролиро-
вали визуально с использованием инвертирован-
ного микроскопа БИОЛАМ П-1 (ЛОМО, Россия).
Раствор МЦ в концентрации 2% (МЦ-100, ОАО
«УсольеХимпром», Россия) предварительно готови-
ли на ростовой среде 199: навеску сухой МЦ стери-
лизовали в автоклаве 20 мин при 121°С, растворяли
в среде 199, перемешивали, оставляли на сутки при
комнатной температуре, затем флаконы помещали
в холодильник (4°С) до полного растворения МЦ.
Этот раствор МЦ вносили в консервирующие
среды до конечных концентраций 0,1 и 1,5%.
Консервирующие среды готовили на основе
среды 199, в которую добавляли ДМСО, ЭС и МЦ
в следующих концентрациях и комбинациях: 5%
ДМСО + 5% ЭС; 5% ДМСО + 0,5% ЭС; 5% ДМСО +
0,1%МЦ; 5% ДМСО + 1,5% МЦ; 5% ДМСО +
1,5% МЦ; 0,1% МЦ; 1,5% МЦ; 5% ДМСО. Один
образец клеток, консервируемых в среде 199 с
добавлением 5% ДМСО и 0,1% МЦ, перед вне-
сением в среду консервирования дважды отмы-
вали от ростовой среды. Остальные образцы кле-
ток осаждали центрифугированием (1500 g) в тече-
ние 10 мин и переносили в консервирующие среды
без отмывания.
Клеточные суспензии вносили в криопробирки
(«Nunc», Дания) с рабочим объемом 1 мл. Образ-
цы замораживали в программном замораживателе
(«Cryoson», Германия) со скоростью охлаждения
1 град/мин до –40°С, затем погружали в жидкий
азот. После хранения при –196°С в течение 4-х
месяцев образцы отогревали на водяной бане при
37°С. Для удаления среды консервирования к клет-
кам после размораживания медленно добавляли
среду 199 в конечном соотношении 10:1. После это-
го клетки осаждали центрифугированием и осадок
ресуспендировали в 1 мл среды культивирования.
surface was 43 cm2). Cell cultures were reinocu-
lated in 2–3 days after formation of confluent mono-
layer in cultural flasks. Seeding dose in flask made
(0.8–2.0)×105 cells/ml. L929 and SPEV-5 cells were
detached with the mixture of 0.25% trypsin solution
and 0.02% Versen solution (both solutions were
obtained from the Chumakov Institute of Poliomyelitis
and Viral Encephalitides of the Russian Academy of
Medical Sciences, Russia) in 1:4–1:5 ratio, and the
cells of SPEV-0.5 line were detached with 0.02%
Versen solution. Character and dynamics of cell mo-
nolayer formation were imaged with inverted micro-
scope BIOLAM P-1 (LOMO, Russia).
MC solution of 2% concentration (MC-100, JSC
Usoliekhimprom, Russia) was preliminary prepared
in growth medium 199: weighed portion of dry MC
was sterilized in autoclave for 20 min at 121°C,
dissolved in medium 199, agitated, left for 24 hours
at room temperature, then the flasks were placed in
the freezer (4°C) until complete dissolution. This MC
solution was added to preservation media to reach
the final concentrations of 0.1 and 1.5%.
Preservation media were prepared on the base
of medium 199 supplemented with DMSO, FBS and
MC in the following concentrations and combinations:
5% DMSO + 5% FBS; 5% DMSO + 0.5% FBS;
5% DMSO + 0.1% MC; 5% DMSO + 1.5% MC;
5% DMSO + 1.5% MC; 0.1% MC; 1.5% MC;
5% DMSO. One sample of the cells prior to intro-
ducing into medium 199 supplemented with 5%
DMSO and 0.1% MC was twice washed from
growth medium. Other cell samples were sedimented
by centrifuging (1500 g) during 10 min and transf-
erred into preservation media without washing.
Cell suspensions were transfered in cryovials
(Nunc, Denmark) with 1 ml handling volume. The sam-
ples were frozen in programmable freezer (Cryoson,
Germany) with the cooling rate of 1 deg/min down to
–40°C, then plunged into liquid nitrogen. After storage
at –196°C during 4 months the samples were thawed
in water bath at 37°C. To remove preservation medium
post thaw the cell samples were diluted with medium
199 in 10:1 final ratio. Thereafter the cells were sedi-
mented by centrifuging and the sediment was re-
suspended in 1 ml of culture medium.
The cell survival was assessed by standard me-
thod of supravital staining with 0.4% trypan blue
solution characterizing the integrity of cell memb-
ranes. Index of survival was calculated as the ratio
of number of non-stained cells to their total number.
In addition we assessed the cell ability to adhere to
the cultural glass and calculated adhesion index, i.e.
relation of number of adhered cells to total number
of cells after 24 hrs of incubation in 0.2 l cultural
glass flasks [2, 6].
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
119
Сохранность клеток определяли стандартным
методом суправитального окрашивания 0,4%-м
раствором трипанового синего, характеризующим
целостность клеточных мембран. Показатель со-
хранности вычисляли как отношение числа неок-
рашенных клеток к их общему количеству. Также
оценивали способность клеток адгезировать к куль-
туральному стеклу и вычисляли индекс адгезив-
ности, т. е. отношение числа прикрепившихся кле-
ток к общему числу клеток через 24 ч инкуби-
рования в стеклянных культуральных флаконах
объемом 0,2 л [2, 6].
Для статистической обработки данных исполь-
зовали пакет программ Microsoft Office Excel 2007,
при сравнении средних – t-критерий Стьюдента.
Различия считали достоверными при р < 0,05 [7].
Результаты и обсуждение
После криоконсервирования клеток линий
СПЭВ-5 и СПЭВ-0,5 в среде, содержащей 5%
ДМСО и 5% ЭС, количество сохранных клеток и
их индекс адгезивности не изменялись (рисунок,
A, B). Индекс адгезивности нативных клеток до
перевода в консервирующую среду для линии
СПЭВ-5 составлял – (94,8 ± 3)%; для линии СПЭВ-
0,5 – (95,7 ± 3,1)%. Снижение концентрации ЭС до
0,5% привело к уменьшению количества сохран-
ных клеток после криоконсервирования до 54,6 и
58,3% соответственно. Индекс адгезивности кле-
ток достоверно снижался после переноса их в среду,
содержащую 5% ДМСО и 0,5% ЭС, а также после
замораживания-отогрева.
После замены ЭС в среде консервирования на
МЦ в концентрации 0,1% количество сохранных
клеток СПЭВ-5 после криоконсервирования умень-
шилось до 89,2%, а линии СПЭВ-0,5 – не измени-
лось. Индекс адгезивности после перевода в среду,
содержащую 5% ДМСО и 0,1% МЦ, уменьшился
у клеток линии СПЭВ-5 и далее не изменялся у
клеток обеих линий после отогрева. Когда в эту
же среду внесли клетки, дважды отмытые от рос-
товой среды, количество сохранных клеток линии
СПЭВ-5 уменьшилось после криоконсервирования
до 84,2%, а линии СПЭВ-0,5 – не изменилось. У
отмытых клеток линии СПЭВ-5 после криоконсер-
вирования в этой среде индекс адгезивности сни-
жался. В среде, содержащей 5% ДМСО и 1,5%
МЦ, количество сохранных клеток линии СПЭВ-5
после криоконсервирования составило около 68%,
линии СПЭВ-0,5 – около 80%. У клеток обеих ли-
ний после перевода в среду криоконсервирования
индекс адгезивности снижался, а у клеток линии
СПЭВ-5 после замораживания-отогрева наблю-
далось его дополнительное снижение.
For statistical data processing we used Microsoft
Office Excel 2007 software, to compare the means
we used Student's t-criterion. The differences were
considered as significant at p < 0.05 [7].
Results and discussion
After cryopreservation of SPEV-5 and SPEV-0.5
cells in the medium containing 5% DMSO and 5%
FBS the number of survived cells and their index of
adhesion were not changed (Figure A, B). Adhesion
index of cells prior to transfer into preservation
medium for SPEV-5 line was (94.8 ± 3)%; for
SPEV-0.5 it made (95.7 ± 3.1)%. After decrease of
FBS concentration down to 0.5% the number of
survived cells post thaw lowered down to 54.6 and
58.3%, respectively. Adhesion index of cells signi-
ficantly decreased after their transfer to the medium
containing 5% DMSO and 0.5% FBS as well as
after freeze-thawing.
When FBS in preservation medium was replaced
by MC in 0.1% concentration the number of survived
SPEV-5 cells after cryopreservation decreased down
to 89.2%, and the one of SPEV-0.5 did not change.
Adhesion index after transfer into the medium
containing 5% DMSO and 0.1% MC was decreased
in SPEV-5 cells and later it was not changed in the
cells of both lines post thaw. When this medium was
supplemented with the cells twice washed of the
growth medium, the number of survived cells of
SPEV-5 line was reduced post thaw down to 84.2%,
and the one of SPEV-0.5 line was not changed. The
washed cells of SPEV-5 line had a decreased ad-
hesion index after freeze-thawing in this medium. In
the medium containing 5% DMSO and 1.5% MC the
number of survived cells of SPEV-5 line post thaw
made 68%, the one of SPEV-0.5 line was about
80%. The cells of both lines after transfer into cryo-
preservation medium had a decreased adhesion in-
dex, and the cells of SPEV-5 line were observed to
have additional reduction of the index post thaw.
After freeze-thawing of the studied cell cultures
in the media with monocomponent additives of 0.1
or 1.5% MC and 5% DMSO, the number of survi-
ved cells of both lines was lower than in the pre-
servation media with two-component additives. The
survival of SPEV-5 cells after freeze-thawing in the
medium with 5% DMSO was significantly higher if
compared to the media containing MC. Adhesion
index in the cells of both lines was decreased after
transfer into the media with monocomponent addi-
tives, in SPEV-5 cells it was lowered after cryopre-
servation in all the media with monocomponent
additives, and in SPEV-0.5 cells it was in the me-
dium with 5% DMSO.
120 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
0
20
40
60
80
100
5% ДМСО + 5%
ЭС
5% ДМСО + 0,5%
ЭС
5% ДМСО + 0,1%
МЦ
5% ДМСО + 0,1%
МЦ(2)
5% ДМСО + 1,5%
МЦ
0,1% МЦ 1,5% МЦ 5% ДМСО
#*
*
#
*
*
* *
*
*
* *
*
*
#
#
#
#
#
0
20
40
60
80
100
5% ДМСО + 5%
ЭС
5% ДМСО +
0,5% ЭС
5% ДМСО +
0,1% МЦ
5% ДМСО +
0,1% МЦ(2)
5% ДМСО +
1,5% МЦ
0,1% МЦ 1,5% МЦ 5% ДМСО
*
*
*
* *
*#
#
# #
#
0
20
40
60
80
100
5% ДМСО + 5%
ЭС
5% ДМСО +
0,5% ЭС
5% ДМСО +
0,1% МЦ
5% ДМСО +
0,1% МЦ(2)
5% ДМСО +
1,5% МЦ
0,1% МЦ 1,5% МЦ 5% ДМСО
*
*
* *
*
*
* * *
*
*
*
# #
#
#
#
Сохранность и индекс адгезивности перевиваемых клеток линий СПЭВ-5 (A), СПЭВ-0,5 (B) и L929 (C) после
замораживания-отогрева в различных средах: – количество сохранных клеток после замораживания-отогрева,
%; – индекс адгезивности клеток до замораживания, %; – индекс адгезивности клеток после замораживания-
отогрева, %. (2) – образцы с клетками, которые дважды отмывали перед переводом в консервирующую среду;
* – уровень доверительной вероятности различий между количеством сохранных клеток и индексами
адгезивности до и после криоконсервирования, р < 0,05; # – уровень доверительной вероятности различий
между индексом адгезивности клеток до и после перевода в среду консервирования, р <0,05.
Survival and adhesion index of inoculated cells of SPEV-5 (A), SPEV-0.5 (B) and L929 (C) after freeze-thawing in diffe-
rent media: – number of survived cells after freeze-thawing, %; – adhesion index of cells prior to freezing, %; –ad-
hesion index of cells after freeze-thawing, %; (2) – samples with the cells twice washed before transfer into preservation
medium; * – the level of significance of differences between the number of survived cells and adhesion indices prior to
and after cryopreservation, p < 0.05; # – the level of significance of differences between the adhesion index of cells prior
to and after transfer into preservation medium, p < 0.05.
5% ДМСО +
5% ЭС
5% DMSO +
5% FS
5% ДМСО +
0,5% ЭС
5% DMSO +
0.5% FS
5% ДМСО
5% DMSO
5% ДМСО +
0,1% МЦ
5% DMSO +
0.1% MC
5% ДМСО +
0,1% МЦ(2)
5% DMSO +
0.1% MC(2)
5% ДМСО +
1,5% МЦ
5% DMSO +
1.5% MC
0,1% МЦ
0.1% MC
1,5% МЦ
1.5% MC
П
ок
аз
ат
ел
ь,
%
о
т
ко
нт
ро
ля
In
de
x,
%
o
f c
on
tro
l
П
ок
аз
ат
ел
ь,
%
о
т
ко
нт
ро
ля
In
de
x,
%
o
f c
on
tro
l
П
ок
аз
ат
ел
ь,
%
о
т
ко
нт
ро
ля
In
de
x,
%
o
f c
on
tro
l
A
B
5% ДМСО +
5% ЭС
5% DMSO +
5% FS
5% ДМСО +
0,5% ЭС
5% DMSO +
0.5% FS
5% ДМСО
5% DMSO
5% ДМСО +
0,1% МЦ
5% DMSO +
0.1% MC
5% ДМСО +
0,1% МЦ(2)
5% DMSO +
0.1% MC(2)
5% ДМСО +
1,5% МЦ
5% DMSO +
1.5% MC
0,1% МЦ
0.1% MC
1,5% МЦ
1.5% MC
5% ДМСО +
5% ЭС
5% DMSO +
5% FS
5% ДМСО +
0,5% ЭС
5% DMSO +
0.5% FS
5% ДМСО
5% DMSO
5% ДМСО +
0,1% МЦ
5% DMSO +
0.1% MC
5% ДМСО +
0,1% МЦ(2)
5% DMSO +
0.1% MC(2)
5% ДМСО +
1,5% МЦ
5% DMSO +
1.5% MC
0,1% МЦ
0.1% MC
1,5% МЦ
1.5% MC
C
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
121
После замораживания-отогрева исследуемых
клеточных культур в средах с монокомпонентными
добавками, содержащими 0,1 и 1,5% МЦ и 5%
ДМСО, количество сохранных клеток обеих линий
было ниже, чем в средах консервирования с
двухкомпонентными добавками. Сохранность кле-
ток линии СПЭВ-5 после замораживания-отогрева
в среде с 5% ДМСО была существенно выше по
сравнению со средами, содержащими МЦ. Индекс
адгезивности у клеток обеих линий снижался после
перевода в среды с монокомпонентными добав-
ками, у клеток линии СПЭВ-5 – после криоконсер-
вирования во всех средах с монокомпонентными
добавками, а у клеток линии СПЭВ-0,5 – в среде
с 5% ДМСО.
В экспериментах с клетками линии L929 были
получены данные, аналогичные для клеток линии
СПЭВ-5. Индекс адгезивности нативных клеток
до переноса их в консервирующую среду для линии
L929 составлял 96,5 ± 2,3%. Наиболее высокие по-
казатели сохранности этих клеток обеспечивало
криоконсервирование в среде, содержащей 5%
ДМСО и 5% ЭС, и в среде с 5% ДМСО и 0,1%
МЦ. После уменьшения концентрации ЭС до 0,5%
и повышения концентрации МЦ до 1,5% сохран-
ность клеток после замораживания-отогрева сни-
жалась. Показатели сохранности клеток линии
L929 после замораживания-отогрева в средах с
монокомпонентными добавками были ниже, чем
в средах с 5% ДМСО и ЭС либо МЦ. Данный пока-
затель после замораживания-отогрева в среде с
5% ДМСО превышал таковой в средах с 0,1 и 0,5%
МЦ.
Полученные результаты свидетельствуют о
том, что для криоконсервирования клеточных
культур можно использовать многокомпонентные
консервирующие среды, в которых ЭС заменена
на МЦ. Обязательным условием, обеспечиваю-
щим эффективность таких сред для криоконсерви-
рования, является наличие в их составе ДМСО.
Если криозащитный эффект среды, содержащей
ЭС, снижался с уменьшением концентрации сы-
воротки с 5 до 0,5%, то в проведенных нами экспе-
риментах со средами, содержащими МЦ, он сни-
жался по мере увеличения концентрации МЦ с 0,1
до 1,5%.
Механизм криозащитного действия МЦ пред-
стоит изучить. Мы предполагаем, что МЦ связы-
вает часть воды и тем самым влияет на процессы
кристаллизации во внеклеточном растворе. Кроме
того, при культивировании клеток линии СПЭВ-0,5
МЦ, находящаяся в среде культивирования, вероят-
но, может выполнять роль структурно-механичес-
кого барьера и защищать клетки от внешних воз-
In the experiments with L929 cells we have
obtained the data similar to SPEV-5 cells. Adhesion
index of native cells prior to their transfer into pre-
servation medium for L929 line made 96.5 ± 2.3%.
The highest indices of survival of these cells were
provided by freeze-thawing in the medium containing
5% DMSO and 5% FBS and in the medium with 5%
DMSO and 0.1% MC. After decreasing the FBS
concentration down to 0.5% and increasing the MC
concentration up to 1.5% the cell survival after
freeze-thawing was increased. The indices of L929
cells survival after freeze-thawing in the media with
monocomponent additives were lower than in the
media with 5% DMSO and FBS or MC. This index
after freeze-thawing in the medium with 5% DMSO
exceeded the one in the media with 0.1 and 0.5%
MC.
The obtained results attest the fact that it is pos-
sible to use multicomponent preservation media
wherein FBS is replaced by MC for cryopreservation
of cell cultures. An essential condition providing the
efficiency of such media for cryopreservation is the
presence of DMSO in their composition. The cryo-
protective effect of the medium containing FBS was
decreased with the lowering of serum concentration
from 5 down to 0.5%, whereas in our researches it
was decreased with the augmentation of MC con-
centration from 0.1 up to 1.5%.
Mechanism of MC cryoprotective effect is still
to be discovered. We suggest that MC bounds a part
of water and thereby affects the crystallization pro-
cesses in extracellular medium. Moreover, during
culture of SPEV-0.5 cells MC could function as a
structure-mechanic barrier and protect the cells from
external impacts associated with crystallization
processes. The results obtained in the experiments
with the samples of cells exposed to freeze-thawing
after double washing from growth medium indicate
to the favor of this assumption. The molecules of
MC presumably preserved on the surface of cells
prevented cell aggregation due to hydrophilic pro-
perties of MC and contributed to their higher adhe-
sion to the surface of cultural flask. This suggestion
is conformed to the results of Medzon and Merchant
[9] who reported that MC was either on or near the
surface of cells and interacted with mono- and
divalent cations. Before freezing of the washed
SPEV-5 and L929 cultures the serum from culture
medium was washed-out and did not affect the
following freezing. Peculiarities of MC effect on the
processes of intracellular ice formation and mecha-
nisms of decrease in cell survival followed the in-
creasing the MC concentration in preservation me-
dium are to be studied.
122 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
действий, связанных с процессами кристаллизации.
В пользу этого предположения свидетельствуют
результаты, полученные в экспериментах с образ-
цами клеток, подвергавшимися замораживанию-
отогреву после двукратной отмывки от ростовой
среды. Предположительно сохранившиеся на по-
верхности клеток СПЭВ-0,5 молекулы МЦ за счет
своих гидрофильных свойств предотвращали агре-
гацию клеток и способствовали их более высокой
адгезии к поверхности культурального флакона.
Это предположение согласуется с результатами
E.L. Medzon и D.J. Merchant [9], которые показали,
что молекулы МЦ присутствуют на или около по-
верхности клеток и взаимодействуют с моно- и
дивалентными катионами. При замораживании
отмытых культур СПЭВ-5 и L929 сыворотка из
культуральной среды была отмыта и не влияла на
последующее замораживание. Возможность влия-
ния МЦ на процессы внутриклеточного кристалло-
образования и механизмы снижения сохранности
клеток с увеличением концентрации МЦ в среде
консервирования до настоящего времени не изуче-
ны.
Выводы
1. Показана возможность эффективного крио-
консервирования перевиваемых клеточных культур
в бессывороточной среде на основе культуральной
среды 199 с добавлением ДМСО и МЦ.
2. Криозащитные свойства среды с моноком-
понентной добавкой МЦ значительно уступают
криозащитным свойствам среды, содержащей
ДМСО и МЦ.
3. Увеличение концентрации МЦ в криозащит-
ных средах с 0,1 до 1,5% приводит к снижению ко-
личества сохранных клеток.
4. Предшествующее криоконсервированию
культивирование клеток в ростовой среде, содер-
жащей МЦ, способствует их более высокой со-
хранности в процессе замораживания в бессыворо-
точной среде. Максимальное число сохранных
клеток было получено для СПЭВ сублинии 0,5.
Conclusions
1. It was shown the possibility of effective cryo-
preservation of inoculated cell cultures in serum-free
medium based on medium 199 supplemented with
DMSO and MC.
2. Cryoprotective properties of medium with mo-
nocomponent additive MC were significantly lower
if compared with the ones of the medium containing
DMSO and MC.
3. Increasing the MC concentration in cryopro-
tective media from 0.1 up to 1.5% led to the de-
crease of survived cells number.
4. Cell culture in growth medium containing MC
prior to freeze-thawing contributed to their higher
survival during freezing in serum-free medium.
Maximal number of survived cells was achieved for
SPEV-0.5 cells.
Литература
1. Высеканцев И.П., Марценюк В.Ф., Ананьина А.Е. и др.
Криоконсервирование промышленных и коллекционных
штаммов микроорганизмов // Актуальные проблемы
криобиологии и криомедицины / Под. ред. А.Н. Гольцева. –
Харьков, 2012. – С. 401–440.
2. Голубев Д.Б., Соломин А.А., Медведева М.Н. Руководство
по применению клеточных культур в вирусологии. – М.:
Медицина, 1976. – 224 c.
3. Кощий С.В., Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф. Пролиферация
и криоконсервирование клеток СПЭВ, культивируемых
References
1. Vysekantsev I.P., Martsenyuk V.F., Anan'ina A.E. et al.
Cryopreservation of industrial and collection strains of
microorganisms // Actual Problems of Cryobiology and
Cryomedicine / Ed. by A.N. Goltsev. – Kharkov, 2012. – P. 401–
440.
2. Golubev D.B., Solomin A.A., Medvedeva M.N. Guidelines for
application of cell cultures in virology. – Moscow: Meditsina,
1976. – 224 p.
3. Koschiy S.V., Vysekantsev I.P., Petrenko T.F. Proliferation and
cryopreservation of SPEV cells, cultured in the medium with
low content of serum // Biofizika Zhyvoy Kletki. – 2008. –
Vol. 9. – P. 70–71.
4. Cryopreservation of cell suspensions / Ed. by A.A. Tsutsaeva. –
Kiev: Naukova Dumka, 1983. – 240 p.
5. Culture of animal cells. Methods / Ed. by R. Freshney. – Moscow:
Mir, 1989. – 333 p.
6. Laboratory investigation methods in clinic: Manual / Ed. by
V.V. Menshikov. – Moscow: Meditsina, 1987. – 368 p.
7. Prisedsky Yu.G. Statistical processing of results of biological
experiments: Manual. – Donetsk, 1999. – 210 p.
8. Ukraine Patent N58224 IPC C12 N5/2. Method of adaptation of
adhesive cells to growth in serum-free media / S.V. Koschiy,
A.M. Goltsev, I.P. Vysekantsev; Filed 13.08.2010; Publ.
11.03.2011. Bull. N7.
9. Medzon E.L., Merchant D.J. Interaction of the LM cell surface
with methylcellulose and vaccinia virus. Mode of action and
implications for large scale vaccine production // In Vitro.–
1971. – Vol. 7, Issue 1. – P. 46–58.
10. Merchant D.J., Hellman K.B., Schneider H. et al. Protection of
animal cells with methylcellulose // Bact. Proc.– 1962. – P. 141.
11. Merten O.W., Petres S. and Couve E. A simple serum-free
freezing medium for serum-free cultured cells // Biologicals. –
1995. – Vol. 23. – P. 185–189.
12. Nair L.S, Laurencin C.T. Polymers as biomaterials for tissue
engineering and controlled drug delivery // Adv. Biochem. Eng.
Biotechnol. – 2006. –Vol. 102. – P. 47–90.
13. Onho T., Kurita K., Abe S. et al. A simple freezing medium for
serum-free cultured cells // Cytotechnology. – 1988. – Vol. 1. –
P. 257–260.
14. Sannino A., Demitri C., Madaghiele M. Biodegradable cellulose-
based hydrogels: design and applications // Materials. –
2009. – Vol. 2. – P. 353–373.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
123
на среде с низким содержанием сыворотки // Биофизика
живой клетки. – 2008. – Т.9. – С.70–71.
4. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под. общ.
ред. А.А.Цуцаевой.– Киев: Наук. думка, 1983. – 240 с.
5. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Фрешни. –
М.: Мир, 1989.– 333 с.
6. Лабораторные методы исследования в клинике: Спра-
вочник / Под. ред. В.В.Меньшикова. – М.: Медицина, 1987. –
368 с.
7. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біо-
логічних експериментів: Навч. посібник. – Донецьк, 1999. –
210 с.
8. Патент №58224 України, МПК С 12 N 5/2. Спосіб адаптації
адгезійних клітин до росту в середовищі без сироватки /
Koщій С.В., Гольцев А.М., Висеканцев І.П.; заявл.
13.08.2010; опубл. 11.03.2011. Бюл. №7.
9. Medzon E.L., Merchant D.J. Interaction of the LM cell surface
with methylcellulose and vaccinia virus. Mode of action and
implications for large scale vaccine production // In Vitro.–
1971. – Vol. 7, Issue 1. – P.46–58.
10. Merchant D.J., Hellman K.B., Schneider H. et al. Protection of
animal cells with methylcellulose // Bact. Proc. – 1962. – P. 141.
11. Merten O.W., Petres S. and Couve E. A simple serum-free
freezing medium for serum-free cultured cells // Biologicals. –
1995. – Vol. 23. – P. 185–189.
12. Nair L.S, Laurencin C.T. Polymers as biomaterials for tissue
engineering and controlled drug delivery // Adv. Biochem. Eng.
Biotechnol. – 2006. –Vol. 102. – P. 47–90.
13. Onho T., Kurita K., Abe S. et al. A simple freezing medium for
serum–free cultured cells // Cytotechnology. – 1988. – Vol. 1. –
P. 257–260.
14. Sannino A., Demitri C., Madaghiele M. Biodegradable cellulose-
based hydrogels: design and applications // Materials. –
2009. – Vol. 2. – P. 353–373.
15. Tate M.C., Shear D.A., Hoffmann S.W. et al. Biocompatibility of
methylcellulose-based constructs designed for intracerebral
gelation following experimental traumatic brain injury // Bio-
materials. – 2001. – Vol. 22, №10. – P. 1113–1123.
16. Thirumala S., Gimble J.M., Devireddy R.V. Evaluation of methyl-
cellulose and dimethyl sulfoxide as the cryoprotectants in a
serum-free freezing media for cryopreservation of adipose–
derived adult stem cells // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19,
№4. – P. 513–522.
17. Yoshida T., Takeuchi M. Primary culture and cryopreservation
of mouse astrocytes under serum-free conditions // Cytotech-
nology. – 1991. – Vol. 5, №2. – Р. 99–106.
15. Tate M.C., Shear D.A., Hoffmann S.W. et al. Biocompatibility of
methylcellulose-based constructs designed for intracerebral
gelation following experimental traumatic brain injury // Bio-
materials. – 2001. – Vol. 22, N10. – P. 1113–1123.
16. Thirumala S., Gimble J.M., Devireddy R.V. Evaluation of methyl-
cellulose and dimethyl sulfoxide as the cryoprotectants in a
serum-free freezing media for cryopreservation of adipose–
derived adult stem cells // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19,
N4. – P. 513–522.
17. Yoshida T., Takeuchi M. Primary culture and cryopreservation
of mouse astrocytes under serum-free conditions // Cytotech-
nology. – 1991. – Vol. 5, N2. – Р. 99–106.
|