Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека
Методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии исследовано влияние оксиэтилированного производного глицерина со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) на термодинамические и кинетические параметры плавления гемоглобина. Показано, что ОЭГn=5 снижает температуру и калориметрическ...
Gespeichert in:
| Datum: | 2013 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68716 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека / А.В. Зинченко, Ю.С. Говорова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 135-142. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68716 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-687162014-10-05T13:23:33Z Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека Зинченко, А.В. Говорова, Ю.С. Компаниец, А.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология Методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии исследовано влияние оксиэтилированного производного глицерина со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) на термодинамические и кинетические параметры плавления гемоглобина. Показано, что ОЭГn=5 снижает температуру и калориметрическую энтальпию термоденатурации гемоглобина с ростом концентрации криопротектора в растворе. Предполагается, что увеличение концентрации криопротектора вызывает разрыхление молекул гемоглобина, способствуя тем самым снижению термостабильности белка. Показана возможность применения кинетического подхода при анализе процесса плавления гемоглобина. Методом диференціальної адіабатичної скануючої мікрокалориметрії досліджено вплив оксиетильованого похідного гліцерину зі ступенем полімерізації n=5 (ОЕГn=5) на термодинамічні і кінетичні параметри плавлення гемоглобіну. Показано, що ОЕГn=5 знижує температуру і калориметричну ентальпію термоденатурації гемоглобіну зі збільшенням концентрації кріопротектора в розчині. Припускається, що збільшення концентрації кріопротектора викликає розпушування молекул гемоглобіну, сприяючи зниженню термостійкості гемоглобіну. Показана можливість застосування кінетичного підходу при аналізі процесу плавлення гемоглобіну. The effect of oxyethylated derivative of glycerol with polymerization degree n = 5 (OEGn=5) on thermodynamic and kinetic parameters of hemoglobin melting was studied by the method of differential adiabatic scanning microcalorimetry. It was shown that increase of OEGn=5 concentration in solution resulted in reduction of the temperature and calorimetric enthalpy of hemoglobin thermodenaturation. It was suggested that the increasing of cryoprotective concentration induced the loosening of hemoglobin molecules thereby contributing to the reduction of thermal stability of protein. The possibility of using kinetic approach when analyzing hemoglobin melting process was shown. 2013 Article Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека / А.В. Зинченко, Ю.С. Говорова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 135-142. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. 2307-6143 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68716 577.322.72:547.42:536.6 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Зинченко, А.В. Говорова, Ю.С. Компаниец, А.М. Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии исследовано влияние оксиэтилированного производного глицерина со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) на термодинамические и кинетические параметры плавления гемоглобина. Показано, что ОЭГn=5 снижает температуру и калориметрическую энтальпию термоденатурации гемоглобина с ростом концентрации криопротектора в растворе. Предполагается, что увеличение концентрации криопротектора вызывает разрыхление молекул гемоглобина, способствуя тем самым снижению термостабильности белка. Показана возможность применения кинетического подхода при анализе процесса плавления гемоглобина. |
| format |
Article |
| author |
Зинченко, А.В. Говорова, Ю.С. Компаниец, А.М. |
| author_facet |
Зинченко, А.В. Говорова, Ю.С. Компаниец, А.М. |
| author_sort |
Зинченко, А.В. |
| title |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| title_short |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| title_full |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| title_fullStr |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| title_full_unstemmed |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| title_sort |
влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68716 |
| citation_txt |
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью полимеризации n = 5 на термостабильность гемоглобина человека / А.В. Зинченко, Ю.С. Говорова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 135-142. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT zinčenkoav vliânieoksiétilirovannogoglicerinasostepenʹûpolimerizaciin5natermostabilʹnostʹgemoglobinačeloveka AT govorovaûs vliânieoksiétilirovannogoglicerinasostepenʹûpolimerizaciin5natermostabilʹnostʹgemoglobinačeloveka AT kompaniecam vliânieoksiétilirovannogoglicerinasostepenʹûpolimerizaciin5natermostabilʹnostʹgemoglobinačeloveka |
| first_indexed |
2025-07-05T18:31:46Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:31:46Z |
| _version_ |
1836832843699847168 |
| fulltext |
УДК 577.322.72:547.42:536.6
А.В. Зинченко*, Ю.С. Говорова, А.М. Компаниец
Влияние оксиэтилированного глицерина со степенью
полимеризации n = 5 на термостабильность
гемоглобина человека
UDC 577.322.72:547.42:536.6
A.V. Zinchenko*, Yu.S. Govorova, A.M. Kompaniets
Effect of Oxyethylated Glycerol with Polymerization Degree n = 5
on Human Hemoglobin Thermostability
Реферат: Методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии исследовано влияние
оксиэтилированного производного глицерина со степенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) на термодинамические и кинетические
параметры плавления гемоглобина. Показано, что ОЭГn=5 снижает температуру и калориметрическую энтальпию термо-
денатурации гемоглобина с ростом концентрации криопротектора в растворе. Предполагается, что увеличение концентрации
криопротектора вызывает разрыхление молекул гемоглобина, способствуя тем самым снижению термостабильности
белка. Показана возможность применения кинетического подхода при анализе процесса плавления гемоглобина.
Ключевые слова: плавление, гемоглобин, термостабильность, оксиэтилированное производное глицерина со степенью
полимеризации n = 5, дифференциальная адиабатическая сканирующая микрокалориметрия.
Реферат: Методом диференціальної адіабатичної скануючої мікрокалориметрії досліджено вплив оксиетильованого
похідного гліцерину зі ступенем полімерізації n=5 (ОЕГn=5) на термодинамічні і кінетичні параметри плавлення гемоглобіну.
Показано, що ОЕГn=5 знижує температуру і калориметричну ентальпію термоденатурації гемоглобіну зі збільшенням
концентрації кріопротектора в розчині. Припускається, що збільшення концентрації кріопротектора викликає розпушування
молекул гемоглобіну, сприяючи зниженню термостійкості гемоглобіну. Показана можливість застосування кінетичного підходу
при аналізі процесу плавлення гемоглобіну.
Ключові слова: плавлення, гемоглобін, термостійкість, оксиетильоване похідне гліцерину зі ступенем полімерізації
n = 5, диференціальна адіабатична скануюча мікрокалориметрія.
Abstract: The effect of oxyethylated derivative of glycerol with polymerization degree n = 5 (OEGn=5) on thermodynamic and
kinetic parameters of hemoglobin melting was studied by the method of differential adiabatic scanning microcalorimetry. It was shown
that increase of OEGn=5 concentration in solution resulted in reduction of the temperature and calorimetric enthalpy of hemoglobin
thermodenaturation. It was suggested that the increasing of cryoprotective concentration induced the loosening of hemoglobin
molecules thereby contributing to the reduction of thermal stability of protein. The possibility of using kinetic approach when analyzing
hemoglobin melting process was shown.
Key words: melting, hemoglobin, thermal stability, oxyethylated derivative of glycerol with polymerization degree n = 5, differential
adiabatic scanning microcalorimetry.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-41, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: alexazin@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3141, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: alexazin@mail.ru
Department of Cryobiophysics, and Department of Cryoprotectants,
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the
National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криобиофизики и отдел криопротекторов, Институт
проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 25.12.2012
Принята в печать 04.06.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №2. – С. 135–142.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received December 25, 2012
Accepted June 6, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 2. – P. 135–142.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
В последние десятилетия значительное число
работ посвящено изучению влияния криопротек-
торов на конформационную стабильность макро-
молекул [1, 2, 7]. Эти исследования важны как для
раскрытия механизмов криоповреждения-криоза-
щиты биологических объектов, так и для создания
новых методов их криоконсервирования.
В криобиологии наряду с традиционно исполь-
зуемыми криопротекторами (глицерин, диметил-
сульфоксид, этиленгликоль и др.) создаются и
исследуются новые. Одним из перспективных спо-
Recent decades are characterized with a significant
number of researches concerned with the study of
cryoprotectants effect on conformational stability of
macromolecules [1, 2, 7]. These studies are important
both for revealing the mechanisms of cryodamage and
cryoprotection in biological objects and for developing
new methods of their cryopreservation.
Cryobiological applications demand along with tra-
ditionally used cryoprotectants (glycerol, dimethyl sul-
foxide, ethylene glycol etc.) a screening and investi-
gation of the new ones. One of the perspective ways
оригинальное исследование research article
собов их создания является оксиэтилирование раз-
личных мономеров: глицерина, этиленгликоля, ами-
дов и др. [5]. Оксиэтилирование известных
криопротекторов приводит к тому, что синтезиро-
ванные олигомеры утрачивают способность прони-
кать в клетки и в отличие от исходного вещества
приобретают свойства криопротекторов экзоцел-
люлярного действия. Так, синтезированные окси-
этильные производные глицерина с разной сте-
пенью полимеризации (n = 5, n = 25, n = 30) позво-
лили расширить спектр экзоцеллюлярных веществ,
используемых в качестве криопротекторов для
различных биологических объектов [5]. В связи с
этим важно исследовать влияние новых криопро-
текторов на конформационную стабильность бел-
ков, при изменении которой нарушается функцио-
нальная активность макромолекул. Изучение ста-
бильности пространственной структуры белков в
растворах неэлектролитов, обладающих криоза-
щитным действием, представляет определенный
научный интерес при анализе межмолекулярных
взаимодействий в сложных системах, включаю-
щих биологические макромолекулы, и практичес-
кий – при разработке методов и технологий крио-
консервирования.
Одним из прямых экспериментальных подходов
в исследовании термодинамических и кинетичес-
ких параметров, характеризующих термическую
денатурацию макромолекул, является дифферен-
циальная сканирующая калориметрия (ДСК). Ана-
логичный подход использовали при изучении влия-
ния глицерина, 1,2-пропандиола (1,2-ПД) и этилен-
гликоля (ЭГ) [4] на теплофизические параметры
перехода спираль-клубок молекул гемоглобина
человека.
Целью настоящей работы было исследование
влияния оксиэтилированного глицерина со сте-
пенью полимеризации n = 5 (ОЭГn=5) на термодина-
мические (температура и энтальпия) и кинетичес-
кие (энергия активации) параметры плавления ге-
моглобина человека на основе анализа ДСК-термо-
грамм.
Постановка данной задачи обусловлена тем,
что одним из первых этапов криоконсервирования
биологического материала является его инкубиро-
вание в криозащитных средах, в результате кото-
рого могут происходить определенные изменения
в пространственной организации белков, влияющие
на их термостабильность.
Материалы и методы
Гемоглобин (HbA) получали из отмытых эрит-
роцитов донорской крови: 1 мл цельной крови и
10 мл физиологического раствора NaCl смешивали
of their development is oxyethylation of various
monomers such as glycerol, ethylene glycol, amides
etc. [5]. Due to oxyethylation of the known cryopro-
tectants the synthesized oligomers loose the ability to
penetrate into the cells and in contrast to the original
substance aquire the properties of cryoprotectants of
exocelullar action. So the synthesized oxyethylated
glycerol derivatives with different polymerization
degree (n = 5, n = 25, n = 30) allowed to extend the
spectrum of exocellular substances used as cryoprotec-
tants for various biological objects [5]. Herewith it is
important to study the effect of new cryoprotectants
on conformational stability of proteins the changes of
which affect functional activity of macromolecules.
Investigating the stability of protein steric structure in
solutions of non-electrolytes possessing a cryoprotec-
tive effect is of a special scientific interest when ana-
lyzing the molecular interactions in complex systems,
including biological macromolecules, and of practical
interest during the development of cryopreservation
methods and techniques.
One of the direct experimental approaches for
studying the thermodynamic and kinetic parameters
characterizing thermal denaturation of macromolecules
is differential scanning calorimetry (DSC). A similar
approach was used to investigate the influence of
glycerol, 1,2-propanediol (1,2-PD) and ethylene glycol
(EG) [4] on thermophysical parameters of the helix-
coil transition of human hemoglobin molecules.
This research was aimed to investigate the impact
of oxyethylated glycerol with a polymerization degree
n = 5 (OEGn=5) on thermodynamic (temperature and
enthalpy) and kinetic (activation energy) parameters
of human hemoglobin thawing based on the analysis
of DSC thermograms.
Such a setting of the task was stipulated by the
fact that one of the first cryopreservation stages of
biological material is its incubation in cryoprotective
media which could result in appearance of certain
changes in the steric organization of proteins affecting
their thermal stability.
Materials and methods
Hemoglobin (HbA) was obtained from the washed
erythrocytes of donor blood, viz. 1 ml of whole blood
and 10 ml of physiological NaCl solution were mixed
and centrifuged at 1,500g during 5 min, and the
supernatant was removed. Washing was performed
thrice. The derived erythromass was hemolysed in
hypotonic solution (5 mM phosphate buffer, pH 7.8)
and centrifuged at 27,500g for 15 min. Hemoglobin
concentration was determined spectrophotometrically.
Protein concentration in calorimeter cell was 5 mM.
Oxyethylated glycerol n = 5 (Barva, Ukraine) was
136 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
и центрифугировали при 1500g в течение 5 мин, над-
осадочную жидкость удаляли. Процедуру отмыва-
ния проводили 3 раза. Полученную эритромассу
гемолизировали в гипотоническом растворе (фос-
фатный буфер 5 мM, pH 7,8) и центрифугировали
при 27500g в течение 15 мин. Концентрацию гемо-
глобина определяли спектрофотометрическим ме-
тодом. Концентрация белка в калориметрической
ячейке составляла 5 мМоль. Оксиэтилированный
глицерин n = 5 («Барва», Украина) был очищен и
идентифицирован в отделе криопротекторов Инс-
титута проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины.
Термограммы регистрировали на дифферен-
циальном адиабатическом сканирующем микрока-
лориметре ДАСМ-4 (СКБ БП Пущино, Россия).
Область сканирования – от 25 до 80°C при избы-
точном давлении 2,5 атм. Скорость нагрева –
1 град/мин. Данный калориметр предназначен для
высокочувствительного теплового анализа жидкос-
тей в интервале температур от –10 до 130°С и поз-
воляет регистрировать тепловые эффекты растяну-
тых по температуре процессов внутримолекуляр-
ных превращений биологических веществ, находя-
щихся в растворе с низкой исходной концентрацией
(~0,1%), а также их парциальную теплоемкость,
как функцию от температуры.
Термограммы обрабатывали с помощью прог-
раммного пакета MS Excel. Данные интерпрети-
ровали согласно описанным ранее методам [3, 4].
Статистическую обработку экспериментальных
данных проводили с использованием пакета «Ori-
gin 7.5» («OriginLab Corporation», США).
Результаты и обсуждение
Процесс денатурации гемоглобина (HbA) про-
текает в две стадии: первая – обратимая диссо-
циация тетрамера на протомеры, вторая – кинети-
чески необратимый переход в денатурированное
состояние [8, 10]. Таким образом, плавление гемо-
глобина подчиняется двухстадийной модели
Ламри-Эйринга, являющейся наиболее распрост-
раненной схемой моделирования необратимой
денатурации [10]:
N
1
1
k
k−
↔ U
2k
→ D,
где N – нативное состояние белка; U – промежу-
точное обратимое состояние; D – денатурирован-
ное состояние.
Если скорость второй стадии велика по сравне-
нию с первой, то модель Ламри-Эйринга может
быть сведена к одностадийной необратимой мо-
дели: N
k
→ D [9].
purified and identified at the Department of Cryopro-
tectants of the Institute for Problems of Cryobiology
and Cryomedicine of the National Academy of
Sciences of Ukraine).
Thermograms were recorded with a differential
adiabatic scanning microcalorimeter DASM-4 (Special
Construction Bureau of Biological Instrumentation,
Puschino, Russia). Scan area was within 25...80°C at
a pressure of 2.5 atmospheres. Heating rate was
1 deg/min. This calorimeter is intended for a high-
sensitive thermal analysis of liquids within the tempe-
rature range from –10 to 130°C and enables to reveal
the thermal effects of temperature stretched intramo-
lecular transformations of biological substances being
in solution with low initial concentration (~0.1%) as
well as their thermal capacity as a function of tem-
perature.
Thermograms were processed with MS Excel. The
data were interpreted according to the papers [3, 4].
Experimental data were statistically processed with
Origin 7.5 (OriginLab Corporation, USA).
Results and discussion
Hemoglobin (HbA) denaturation proceeds in two
stages: the first one is reversible tetramer dissociation
into protomers, the second one is kinetically irreversible
transition to denaturated state [8, 10]. Thus, the melting
of hemoglobin complies with Lumry-Eyring's two-
stage model, which is the most common pattern of
irrever-sible denaturation modeling [10]:
N
1
1
k
k−
↔ U
2k
→ D,
where N is a native state of protein; U represents
intermediate reversible condition; D is a denatured
state.
If the rate of the second stage is high comparing
with the first one the model of Lumry-Eyring can be
reduced to one-stage irreversible model: N
k
→ D [9].
Calorimetric profiles characteristic for hemoglobin
denaturation in the presence of OEGn=5 are shown in
Fig. 1. Endothermic peak in the thermograms displays
a denaturing process of native Hb as well as the protein
in the presence of 25 and 50% OEGn=5. Denaturation
temperature (Td) of native hemoglobin makes 343 K.
In the presence of OEGn=5 the shape of hemoglobin
absorption curve generally coincides with the thermo-
denaturation peak of globular proteins. Melting tem-
perature and curve shape of hemoglobin absorption
are properly agreed with the data for human hemoglobin
presented reported previously [2, 4, 8].
To test the reversibility or irreversibility of dena-
turation process, we performed the procedure of samp-
le re-warming [3]: after revealing the hemoglobin dena-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
137
Характерные калориметрические профили де-
натурации гемоглобина в присутствии ОЭГn=5 при-
ведены на рис. 1. Эндотермический пик на термо-
граммах отображает процесс денатурации натив-
ного Hb, а также белка с добавлением 25 и 50%
ОЭГn=5. Температура денатурации (Td) нативного
гемоглобина составляет 343 К. В присутствии
ОЭГn=5 форма кривой теплопоглощения гемоглоби-
на в целом совпадает с формой пика термодена-
турации глобулярных белков. Температура плавле-
ния и форма кривой теплопоглощения гемоглобина
хорошо согласуются с данными, приведенными в
литературе для гемоглобина человека [2, 4, 8].
Для проверки обратимости или необратимости
процесса денатурации нами была проведена пр-
оцедура повторного прогрева образца [3]: после
регистрации пика денатурации гемоглобина обра-
зец охлаждали, затем заново снимали зависимость
теплоемкости от температуры. При повторном
сканировании поглощения тепла не наблюдалось,
что указывает на необратимость процесса денату-
рации гемоглобина.
В данной работе мы проводили расчеты для
второй необратимой стадии денатурации гемогло-
бина, модель которой описана выше.
При необратимом плавлении белков кинетичес-
кий анализ более предпочтителен, так как дает воз-
можность рассчитать энергии активации и конс-
танты скоростей процесса денатурации [3, 9].
Для определения параметров уравнения Арре-
ниуса из экспериментальных кривых, удовлетво-
ряющих одностадийной необратимой модели,
Sanchez-Ruiz и соавт. [9] предложили 4 способа
расчета энергии активации. В настоящей работе с
целью определения энергии активации мы восполь-
зовались одним из них. Из уравнения Аррениуса
для константы скорости k = A exp(–Ea/RT) и
уравнения для константы скорости, полученного
Sanchez-Ruiz и соавт. [3, 10], k = v Cp
ex(∆H – Q)
отношение Ea/R может быть определено как тан-
генс угла наклона зависимости ln [vCp
ex/(∆Hcal – Q)
от 1/T, где Ea – энергия активации; R – универсаль-
ная газовая постоянная; ∆H – энтальпия денатура-
ции, которая определяется как площадь под кривой
зависимости избыточной теплоемкости от темпе-
ратуры; Q – текущее количество теплоты, погло-
щаемое в процессе денатурации; T – текущая тем-
пература.
На рис. 2 приведены графики в координатах
(ln [vCp
ex/(∆Hcal – Q)]; 1/T) для системы гемогло-
бин-ОЭГn=5 для второй стадии денатурации гемо-
глобина.
Как указывалось выше, плавление гемоглобина
подчиняется двустадийной необратимой модели.
Рис. 1. Термограммы гемоглобина в присутствии
ОЭГn=5: А – в физиологическом растворе; В – в растворе
25% ОЭГn=5; С – 50% ОЭГn=5.
Fig. 1. Thermograms of hemoglobin with OEGn=5: A – in
physiological saline; B – in solution of 25% of OEGn=5; C –
50% of OEGn=5.
turation peak the sample was cooled, then we recorded
the dependence of thermal capacity vs. temperature
again. Repeated scanning did not reveal any heat
absorption, indicating the irreversibility of hemoglobin
denaturation.
In this paper we performed the calculations for the
second irreversible stage of hemoglobin denaturation,
the model of which is described above.
During the irreversible melting of proteins the kine-
tic analysis is more preferable because it allows to
calculate the activation energy and the rate constants
for denaturation [3, 9].
To determine the parameters of the Arrhenius
equation from the experimental curves satisfying a one-
stage irreversible model, Sanchez-Ruiz et al. [9] propo-
sed four ways of calculating the activation energy. In
this paper, in order to determine the activation energy
we used one of them. From the Arrhenius equation
for the rate constant k = A exp(–Ea/RT) and the equa-
tion for rate constant obtained by Sanchez-Ruiz et al.
[3, 10] k = v Cp
ex(∆H – Q), the ratio of Ea/R can be
determined as the slope of the dependence ln [vCp
ex/
(∆Hcal – Q) vs. 1/T, where Ea is an activation energy;
R – universal gas constant; ∆H – enthalpy of denatu-
ration determined as the area under the curve of depen-
dence of excessive thermal capacity from temperature;
Q is a current amount of heat absorbed during dena-
turation; T is a current temperature.
0
5
10
15
20
25
320 325 330 335 340 345 350
A
C
B
C
p,
кД
ж⋅
м
ол
ь–
1 ⋅К
–1
C
p,
KJ
⋅m
ol
–1
⋅K
–1
Температура, К
Temperature, K
138 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
Одним из критериев применимости данной модели
является линейность графика в координатах
(ln [vCp
ex/(∆Hcal – Q)]; 1/T) [3, 9]. Зависимости в
указанных координатах для гемоглобина с добав-
лением исследованных концентраций криопротек-
тора линейны (рис. 2). Это свидетельствует о том,
что присутствие ОЭГn=5 не влияет на необрати-
мость плавления гемоглобина и подтверждает при-
менимость кинетического подхода при анализе
процесса плавления гемоглобина.
Большинство процессов, отвечающих за необ-
ратимость денатурации белков, протекают мед-
ленно, и в каждый момент времени система нахо-
дится в локальном равновесии, несмотря на то, что
денатурация белков необратима и форма пика де-
натурации в данном случае не меняется. Описание
таких процессов возможно с использованием
моделей равновесной термодинамики [3].
Учитывая вышеизложенное, из полученных тер-
мограмм были рассчитаны калориметрические
энтальпии (∆Hcal) и температуры плавления гемо-
глобина, построены зависимости ∆Hcal и Td от кон-
центрации ОЭГn=5 (рис. 3 и таблица). Как видно на
рис. 3, при добавлении 5% ОЭГn=5 значения тем-
пературы денатурации и калориметрической эн-
тальпии в пределах погрешности равны таковым
для HbA в буферном растворе, что свидетельст-
вует о сохранении конформационной стабильности
Рис. 3. Зависимости изменения энтальпии (A) и темпе-
ратуры (B) денатурации гемоглобина от концентрации
ОЭГn=5 в растворе.
Fig. 3. Dependences of changes in denaturation enthalpy
(A) and temperature (B) vs. OEGn=5 concentration.
Рис. 2. Зависимость ln[υCp
ex/(∆H – Q)] от обратной
температуры для гемоглобина с добавлением ОЭГ:
А – в физиологическом растворе; В – в растворе 8,75%
ОЭГn=5; С – 25% ОЭГn=5; D – 50% ОЭГn=5.
Fig. 2. Dependence ln[υCpex/(∆H – Q)] on reciprocal tem-
perature of hemoglobin with addition of OEG: A – in
physiological saline; B – 8.75% OEGn=5; C – 25% OEGn=5;
D – 50% OEGn=5.
Figure 2 shows the plots in the coordinates (ln [vCp
ex/
(∆Hcal – Q)]; 1/T) for hemoglobin-OEGn=5 system ob-
tained for the second stage of hemoglobin denaturation.
As mentioned above hemoglobin melting is subjec-
ted to the two-stage irreversible model. One of the
criteria for the applicability of this model is the linearity
of the curve in the coordinates (ln [vCp
ex/(∆Hcal – Q)];
1/T) [3, 9]. The dependencies in the given coordinates
for hemoglobin in the presence of the studied concent-
rations of cryoprotectants are linear (see Fig. 2). This
indicates that the presence of OEGn=5 does not affect
the irreversible melting of hemoglobin and confirms
the applicability of kinetic approach when analyzing
the hemoglobin melting.
Most processes responsible for the irreversible de-
naturation of proteins occur slowly and in each time-
point the system is in local equilibrium, despite the fact
that protein denaturation is irreversible, and denatura-
tion peak shape in this case does not change. Descrip-
tion of these processes is possible using equilibrium
thermodynamics models [3].
Considering the above mentioned, the obtained
thermograms were used to calculate calorimetric en-
thalpies (∆Hcal) and hemoglobin melting temperatures,
and the dependences of ∆Hcal and Td vs.the concent-
ration OEGn=5 were plotted (Fig. 3 and Table). As could
be seen in the Fig. 3 the values of denaturation tempe-
rature and calorimetric enthalpy after addition of 5%
OEGn=5 were equal within the measurement accuracy
to the indices for HbA in buffer solution, testifying to
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
2,88 2,93 2,98 3,03 3,08
А
C
D
B
ln
[υ
C
pex
/(∆
H
–
Q
)]
Температура, К
Temperature, K
330
335
340
345
350
355
360
365
370
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
А
B
Те
м
пе
ра
ту
ра
д
ен
ат
ур
ац
ии
, К
D
en
at
ur
at
io
n
te
m
pe
ra
tu
re
,
K
Концентрация ОЭГn=5, % масс.
OEGn=5 concentration, % w/w
∆H
,
кД
ж/
м
ол
ь
∆H
, K
J/
m
ol
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
139
ца). Таким образом, можно предположить, что
используемое вещество в данном случае вызы-
вает разрыхление молекул гемоглобина, снижая
тем самым термостабильность белка [6]. Анало-
гичное влияние снижения термостабильности ге-
моглобина в присутствии ЭГ и 1,2-ПД было уста-
новлено в другой работе [4] и предполагалось, что
влияние криопротекторов обусловлено изменением
пространственной упаковки простетической группы
и глобиновой части молекул. Снижение значений
энергий активации при росте концентрации крио-
протектора в растворе также подтверждает пред-
положение о разрыхлении молекул гемоглобина
(таблица), в основе которого лежит идея о том, что
увеличение концентрации криопротектора вызы-
вает изменение гидратного окружения молекул как
гемоглобина, так и ОЭГn=5 и приводит к умень-
шению количества воды, связанной и с криопротек-
тором, и с гемоглобином. Вследствие этого проис-
ходят изменения в гидратных слоях ОЭГn=5 и гемо-
глобина, затрагивающие прочно связанную воду,
вследствие чего молекулы воды в гидратном окру-
жении белка заменяются на молекулы криопро-
тектора.
Таким образом, изменение энтальпии и темпе-
ратуры денатурации для всех исследованных нами
растворов гемоглобина с добавками оксиэтилиро-
ванного глицерина со степенью полимеризации
n = 5 объясняется влиянием данного криопротекто-
ра на гидратную оболочку молекул гемоглобина.
Оксиэтилированный глицерин, возможно, встраи-
вается в гидратную оболочку белка и вызывает
изменение его пространственной структуры.
preservation of conformational stability of hemoglobin
molecules in the presenrce of this substance. This can
be explained by the fact that if the concentration of
OEGn=5 made 5% w/w the hydration according to the
data of infrared spectroscopy and DSC made more
than 20 molecules of water per molecule of non-elect-
rolyte, corresponding to 1.15 g of water per 1 g and
even more [11], while hydration of hemoglobin is 0.51g
of water per 1g of hemoglobin [6]. Considering that
molecules of OEGn=5 and hemoglobin are surrounded
by such number of water molecules which does not
allow to interact or only slightly interact with each other,
the conformation of hemoglobin does not change. The
increasing of OEGn=5 concentration in protein solution
above 5% w/w results in monotonic reduction of both
temperature of hemoglobin denaturation and calorimet-
ric enthalpy of melting (Table). Thus, we may suggest
that the used substance in this case induced loosening
of hemoglobin molecules, reducing thermal stability of
protein. Similar effect of hemoglobin thermal stability
reduction in the presence of EG and 1,2-PD was found
previously [4]. It was suggested that the found effect
of studied substances was stipulated by the changes
in steric arrangement of prosthetic group and globin
part of molecules. The decrease of activation energy
values during concentration increase of cryoprotectant
in solution also confirms the suggestion about loosening
of hemoglobin molecules (Table), which is based on
hypothesis that increasing of studied cryoprotectant
concentration induced the change of hydrate environ-
ment of both hemoglobin and OEGn=5 molecules and
results in decrease of water amount bounded with
cryoprotectant and hemoglobin. All this provokes the
Температура денатурации, калориметрическая энтальпия и
энергия активации денатурации гемоглобина в присутствии ОЭГ n=5
(данные приведены как среднее значение ± стандартное
отклонение)
Denaturation temperature, calorimetric enthalpy and hemoglobin
denaturation activation energy with OEGn=5 (data presented
as a mean ± standard error)
молекул гемоглобина в присутствии
данного вещества. Это может быть
объяснено тем фактом, что при кон-
центрации 5 масс. % ОЭГn=5 гидрата-
ция по данным ИК-спектроскопии и
ДСК составляет больше 20 молекул
воды на молекулу неэлектролита, что
соответствует 1,15 г воды на 1 г и
больше [11], в то время как гидрата-
ция гемоглобина – 0,51 г воды на 1 г
гемоглобина [6]. Поскольку молекулы
ОЭГn=5 и гемоглобина окружены та-
ким количеством молекул воды, при
котором они не взаимодействуют или
взаимодействуют друг с другом сла-
бо, конформация гемоглобина не изме-
няется. Повышение концентрации
ОЭГn=5 в растворе белка выше
5 масс. % приводит к монотонному
снижению как температуры денату-
рации гемоглобина, так и калоримет-
рической энтальпии плавления (табли-
яицартнецноK
ГЭО 5=n %,
GEO 5=n
%,noitartnecnoc
Td К,
∆Н lac ьлом/жДк,
∆Н lac lom/JK,
Еа ьлом/жДк,
Еа lom/JK,
0 2,0±2,343 01±861 51±823
83,4 2,0±8,243 01±861 71±603
01 2,0±7,143 01±251 71±892
52 2,0±9,833 8±341 61±052
05 2,0±2,333 6±211 71±612
140 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
Следует отметить, что информация об измене-
нии термостабильности белков в присутствии крио-
протекторов, полученная из термодинамических и
кинетических показателей, позволяет определить
предельные концентрации веществ, влияющих на
конформационную стабильность белка, и является
в связи с этим важным аспектом при разработке
технологии консервирования с использованием
криозащитных сред.
Выводы
Показано, что повышение концентрации ОЭГn=5
выше 5 масс. % в растворе гемоглобина вызывает
снижение температуры и калориметрической эн-
тальпии термоденатурации белка. Эти факты ука-
зывают на то, что изменение межмолекулярных
взаимодействий в растворе гемоглобина в присут-
ствии ОЭГn=5 приводит к разрыхлению молекул
гемоглобина человека и cнижению его термоста-
бильности.
Показана применимость кинетического подхода
для исследования процесса термоденатурации ге-
моглобина с используемым криопротектором.
Литература
1. Ковригин Е.Л., Потехин С.А. Микрокалориметрическое
исследование влияния диметилсульфоксида на тепловую
денатурацию лизоцима // Биофизика. – 1996. – Т. 41, №6. –
С. 1201–1206.
2. Лапшина Е.А., Заводник И.Б, Игнатенко В.А., Степуро И.И.
Термостабильность и функциональные свойства гемогло-
бина человека в присутствии алифатических спиртов //
Молекулярная биология. – 1992. –Т. 26, №2. – С. 315–320.
3. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Изучение необратимой тепло-
вой денатурации белков методом дифференциальной
сканирующей калориметрии // Успехи биологической
химии. – 2000. – Т. 40. – С. 43–84.
4. Соловьева А.С. Калориметрические исследования термо-
денатурации изолированных и мембраносвязанных бел-
ков в присутствии некоторых криопротекторов до и пос-
ле охлаждения до -196°С: Автореф. дис. … канд. биол.
наук. – Харьков, 1999. – 15 с.
5. Шраго М.И., Гучок М.М., Калугин Ю.В. Некоторые принципы
направленного синтеза криопротекторов // Актуальные
проблемы криобиологии / Под ред. Н.С.Пушкаря и А.М. Бе-
лоуса. – Киев: Наукова думка, 1981. – С. 157–201.
6. Arosio D., Kwansa H.E., Gering H. et al. Statistic and dynamic
light scattering approach to the hydration of hemoglobin in the
presence of osmolites // Biopolymers. – 2002. – Vol. 63, №1. –
P. 1–11.
7. Meng F.-G., Hong Y.-K., He H.-W. et al. Osmophobic Effect of
Glycerol on Irreversible Thermal Denaturation of Rabbit Creatine
Kinase // Biophys. J. – 2004. – Vol. 87, №4. – P. 2247–2254.
8. Michnik A., Drzazga Z., Kluczewska A., Michalik K. Differential
scanning microcalorimetry study of the thermal denaturation
of haemoglobin // Biophys. Chem. – 2005. – Vol. 118, №2–3. –
P. 93–101.
9. Sanchez-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models
in differential scanning calorimetry // Biochem. J. – 1992. –
Vol. 64, №4. – P. 921–935.
changes in hydrate layers of OEGn=5 and hemoglobin
affecting tightly bound water, and leading to replace-
ment of water molecules by cryoprotectant ones in
hydrate environment of protein.
Thus, the changes of enthalpy and denaturation
temperature in all the studied solutions of hemoglobin
supplemented with of oxyethylated glycerol of n = 5
polymerization degree could be explained by effect of
this cryoprotectant on a hydrate shell of hemoglobin
molecule. Oxyethylated glycerol, probably, incorpo-
rates into hydrate shell of protein and provokes the
changes in its steric structure.
It should be noted that information about the chan-
ges in protein thermal stability in the presence of cryo-
protectants obtained from thermodynamic and kinetic
indices enables to determine the admissible concent-
rations of substances, which affect the conformational
stability of a protein, and due to this could be an
important aspect during development of preservation
technologies which utilize cryoprotective media.
Conclusion
It was shown that the increasing of OEGn=5 con-
centration in hemoglobin solution over 5% w/w induced
the reduction of temperature and calorimetric enthalpy
of thermal denaturation of protein. These facts pointed
to the loosening of human hemoglobin molecules and
reduction of its thermal stability due to the changes in
molecular interactions in hemoglobin solution in the
presence of OEGn=5.
There was shown the possibility of using kinetic
approach to study thermodenaturation of hemoglobin
with the used cryoprotectant.
References
1. Kovrigin E.L., Potekhin S.A. Microcalorimetric study of dimethyl
sulfoxide effect on thermal denaturation of lysozyme //
Biofizika. – 1996. – Vol.41, N6. – P. 1201–1206.
2. Lapshina E.A., Zavodnik I.B., Ignatenko V.A., Stepuro I.I.
Thermal stability and functional properties of human hemoglobin
in the presence of aliphatic alcohols // Molekulyarnaya
Biologiya. – 1992. – Vol. 26, N2. – P. 315–320.
3. Lyubarev A.E., Kurganov B.I. Investigation of irreversible
thermal denaturation of proteins by differential scanning
calorimetry // Uspekhi Biologicheskoy Khimii. – 2000. – Vol. 40. –
P. 43–84.
4. Solovyeva A.S. Calorimetric studies of thermal denaturation
of isolated and membrane-bound proteins with some cryo-
protectants prior to and after cooling down to –196°C: Author's
abstract of thesis of the candidate of biological sciences. –
Kharkov, 1999. – 15 p.
5. Shrago M.I., Guchok M.M., Kalugin Yu.V. Some principles of
directed synthesis of cryoprotectants // In: Aktualnye problemy
kriobiologii / Ed. by N.S. Pushkar, A.M. Belous. – Kiev: Naukova
Dumka, 1981. – P. 157–201.
6. Arosio D., Kwansa H.E., Gering H. et al. Statistic and dynamic
light scattering approach to the hydration of hemoglobin in the
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
141
10.Sengupta B., Swenson J. Properties of normal and glycated
human hemoglobin in presence and absence of antioxidant //
Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2005. – Vol. 334, №3. –
P. 954–959.
11.Zhivotova E.N., Zinchenko A.V., Kuleshova L.G. et al. Low-
temperature phase behaviour of the binary system water-
oxyethylated glycerol of polymerization degree n = 5 and
intermolecular interactions in the system // Mol. Phys. – 2008. –
Vol. 106, №14. – P. 1751–1759.
presence of osmolites // Biopolymers. – 2002. – Vol. 63, N1. –
P. 1–11.
7. Meng F.-G., Hong Y.-K., He H.-W. et al. Osmophobic Effect of
Glycerol on Irreversible Thermal Denaturation of Rabbit Creatine
Kinase // Biophys. J. – 2004. – Vol. 87, N4. – P. 2247–2254.
8. Michnik A., Drzazga Z., Kluczewska A., Michalik K. Differential
scanning microcalorimetry study of the thermal denaturation
of haemoglobin // Biophys. Chem. – 2005. – Vol. 118, N2–3. –
P. 93–101.
9. Sanchez-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models
in differential scanning calorimetry // Biochem. J. – 1992. –
Vol. 64, N4. – P. 921–935.
10.Sengupta B., Swenson J. Properties of normal and glycated
human hemoglobin in presence and absence of antioxidant //
Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2005. – Vol. 334, N3. –
P. 954–959.
11.Zhivotova E.N., Zinchenko A.V., Kuleshova L.G. et al. Low-
temperature phase behaviour of the binary system water-
oxyethylated glycerol of polymerization degree n = 5 and
intermolecular interactions in the system // Mol. Phys. – 2008. –
Vol. 106, N14. – P. 1751–1759.
142 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue2, 2013
|