Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией
Разработанный ранее высокоэффективный метод криоконсервирования нормозооспермического эякулята был применен для единичных эпидидимальных спермиев с целью использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Клетки охлаждали в капиллярах с раствором 20% сахарозы и 15% глицерина...
Gespeichert in:
| Datum: | 2013 |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68731 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией / В.В. Подуфалий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 260-266. — Бібліогр.: 23 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68731 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-687312014-10-06T22:13:14Z Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией Подуфалий, В.В. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Разработанный ранее высокоэффективный метод криоконсервирования нормозооспермического эякулята был применен для единичных эпидидимальных спермиев с целью использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Клетки охлаждали в капиллярах с раствором 20% сахарозы и 15% глицерина от 22 до –35°С со скоростью 1 град/мин, от –35 до –70°С со скоростью 20 град/мин, а затем микрокапилляры погружали в жидкий азот. После отогрева выживаемость сперматозоидов составила 92%. Ооциты оплодотворяли микроинъекцией единичного спермия, после культивирования и оценки качества эмбрион переносили в полость матки. Частота наступления беременности после использования криоконсервированных спермиев была выше (53,1%), чем свежеаспирированных клеток (46,1%). Таким образом показана применимость использованного метода криоконсервирования в ВРТ для пациентов с азооспермией. Розроблений раніше високоефективний метод кріоконсервування нормозооспермічного еякуляту було застосовано для поодиноких епідидімальних сперміїв з метою використання в програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ). Клітини охолоджували в капілярах з розчином 20% сахарози і 15% гліцерину від 22 до –35°С зі швидкістю 1 град/хв, від –35 до –70°С зі швидкістю 20 град/хв, а потім мікрокапіляри занурювали в рідкий азот. Після відігріву виживаність сперматозоїдів склала 92%. Ооцити запліднювали мікроін’єкцією поодинокого спермія, після культивування та оціювання якості ембріон переносили до порожнини матки. Частота настання вагітності після використання кріоконсервованих сперміїв була вищою (53,1%), ніж свіжоаспірованих клітин (46,1%). Таким чином, показано придатність застосованого методу кріоконсервування в ДРТ для пацієнтів з азооспермією. Previously developed highly effective method for cryopreservation of normozoospermic ejaculate was applied for single epididymal spermatozoa for following using in assisted reproductive technologies (ART). The cells were cooled in microcapillaries with solution of 20% sucrose and 15% glycerol from 22 down to –35°C with rate of 1 deg/min, from –35 down to –70°C with rate of 20 deg/min and thereafter plunged into liquid nitrogen. Post-thaw survival of spermatozoa was 92%. Oocytes were fertilized by injection of single spermatozoa, the embryos were cultured, assessed for pronuclei peresence and transfered into uterus. Pregnancy rate after using cryopreserved cells was higher (53.1%) than after using fresh asperated cells (46.1%). Thus the utilized method of cryopreservation could be effectively used in ART for patients with azoospermy. 2013 Article Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией / В.В. Подуфалий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 260-266. — Бібліогр.: 23 назв. — рос., англ. 2307-6143 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68731 615.361.013.11.014.41:616.697 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| spellingShingle |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Подуфалий, В.В. Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Разработанный ранее высокоэффективный метод криоконсервирования нормозооспермического эякулята был применен для единичных эпидидимальных спермиев с целью использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Клетки охлаждали в капиллярах с раствором 20% сахарозы и 15% глицерина от 22 до –35°С со скоростью 1 град/мин, от –35 до –70°С со скоростью 20 град/мин, а затем микрокапилляры погружали в жидкий азот. После отогрева выживаемость сперматозоидов составила 92%. Ооциты оплодотворяли микроинъекцией единичного спермия, после культивирования и оценки качества эмбрион переносили в полость матки. Частота наступления беременности после использования криоконсервированных спермиев была выше (53,1%), чем свежеаспирированных клеток (46,1%). Таким образом показана применимость использованного метода криоконсервирования в ВРТ для пациентов с азооспермией. |
| format |
Article |
| author |
Подуфалий, В.В. |
| author_facet |
Подуфалий, В.В. |
| author_sort |
Подуфалий, В.В. |
| title |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| title_short |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| title_full |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| title_fullStr |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| title_full_unstemmed |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| title_sort |
клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68731 |
| citation_txt |
Клинический опыт использования криоконсервированных спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией / В.В. Подуфалий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 260-266. — Бібліогр.: 23 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT podufalijvv kliničeskijopytispolʹzovaniâkriokonservirovannyhspermievpolučennyhpribiopsiiupacientovsazoospermiej |
| first_indexed |
2025-07-05T18:32:24Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:32:24Z |
| _version_ |
1836832884252475392 |
| fulltext |
УДК 615.361.013.11.014.41:616.697
В.В. Подуфалий*
Клинический опыт использования криоконсервированных
спермиев, полученных при биопсии у пациентов с азооспермией
UDC 615.361.013.11.014.41:616.697
V.V. Podufaliy*
Clinical Case of Using Cryopreserved Spermatozoa Obtained by
Biopsy in Patients with Azoospermia
Реферат: Разработанный ранее высокоэффективный метод криоконсервирования нормозооспермического эякулята
был применен для единичных эпидидимальных спермиев с целью использования в программах вспомогательных
репродуктивных технологий (ВРТ). Клетки охлаждали в капиллярах с раствором 20% сахарозы и 15% глицерина от 22 до
–35°С со скоростью 1 град/мин, от –35 до –70°С со скоростью 20 град/мин, а затем микрокапилляры погружали в жидкий
азот. После отогрева выживаемость сперматозоидов составила 92%. Ооциты оплодотворяли микроинъекцией единичного
спермия, после культивирования и оценки качества эмбрион переносили в полость матки. Частота наступления
беременности после использования криоконсервированных спермиев была выше (53,1%), чем свежеаспирированных
клеток (46,1%). Таким образом показана применимость использованного метода криоконсервирования в ВРТ для пациентов
с азооспермией.
Ключевые слова: сперматозоиды, криоконсервирование, вспомогательные репродуктивные технологии.
Реферат: Розроблений раніше високоефективний метод кріоконсервування нормозооспермічного еякуляту було
застосовано для поодиноких епідидімальних сперміїв з метою використання в програмах допоміжних репродуктивних
технологій (ДРТ). Клітини охолоджували в капілярах з розчином 20% сахарози і 15% гліцерину від 22 до –35°С зі швидкістю
1 град/хв, від –35 до –70°С зі швидкістю 20 град/хв, а потім мікрокапіляри занурювали в рідкий азот. Після відігріву виживаність
сперматозоїдів склала 92%. Ооцити запліднювали мікроін’єкцією поодинокого спермія, після культивування та оціювання
якості ембріон переносили до порожнини матки. Частота настання вагітності після використання кріоконсервованих сперміїв
була вищою (53,1%), ніж свіжоаспірованих клітин (46,1%). Таким чином, показано придатність застосованого методу кріокон-
сервування в ДРТ для пацієнтів з азооспермією.
Ключові слова: сперматозоіди, кріоконсервування, допоміжні репродуктивні технології.
Abstract: Previously developed highly effective method for cryopreservation of normozoospermic ejaculate was applied for
single epididymal spermatozoa for following using in assisted reproductive technologies (ART). The cells were cooled in microcapillaries
with solution of 20% sucrose and 15% glycerol from 22 down to –35°C with rate of 1 deg/min, from –35 down to –70°C with rate of
20 deg/min and thereafter plunged into liquid nitrogen. Post-thaw survival of spermatozoa was 92%. Oocytes were fertilized by
injection of single spermatozoa, the embryos were cultured, assessed for pronuclei peresence and transfered into uterus. Pregnancy
rate after using cryopreserved cells was higher (53.1%) than after using fresh asperated cells (46.1%). Thus the utilized method of
cryopreservation could be effectively used in ART for patients with azoospermy.
Key words: spermatozoa, cryopreservation, assisted reproductive technologies.
*Адрес для корреспонденции:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-19, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: cryo@online.kharkov.ua
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3119, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Department of Cryobiology of Reproduction System, Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Acad-
emy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Third Municipal Clinical Hospital, Lviv, Ukraine
Отдел криобиологии системы репродукции, Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
3-я городская больница, г. Львов
Поступила 18.12.2012
Принята в печать 30.04.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №3. – С. 260–266.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received December, 18, 2012
Accepted April, 30, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 3. – P. 260–266.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Одной из причин низких демографических
показателей в Украине является бесплодный брак,
в структуре которого мужской фактор составляет
40% [1]. В начале 90-х годов развитие репродук-
тивной медицины привело к возможности использо-
вания вспомогательных репродуктивных техноло-
гий с оплодотворением сперматозоидами пациен-
тов с олигоастенотератозооспермией, а также
сперматозоидами, полученными хирургическим
путем у пациентов с азооспермией [2]. В настоя-
One of the causes of low demographic indices in
Ukraine is an infertile couple in structure of which male
factor makes 40% [1]. In the early 90s the development
of reproductive medicine made possible the assisted
reproductive technologies in terms of fertilization with
spermatozoa of patients with azoospermia [2]. Cur-
rently the treatment of severe forms of infertility
involves the following methods: MESA (microsurgical
epididymal sperm aspiration); PESA (percutaneous
epididymal sperm aspiration); MESE (microepididymal
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
261
щее время для лечения тяжелых форм бесплодия
широко применяются такие методики: MESA
(микрохирургическая эпидидимальная аспирация
сперматозоидов); PESA (перкутанная эпидиди-
мальная аспирация сперматозоидов); MESE (полу-
чение сперматозоидов при проведении открытой
биопсии придатка яичка) и TESE (получение
сперматозоидов при проведении открытой биопсии
яичка) [4, 10, 18, 19].
Для лечения бесплодия при азооспермии мужа
в большинстве случаев используют свежеаспи-
рированные сперматозоиды и технологию экстра-
корпорального оплодотворения (ЭКО) с микро-
инъекцией единичного спермия в ооцит (ICSI) [7,
8, 20]. При этом пригодных для оплодотворения
подвижных нормальных сперматозоидов может
быть крайне мало, а их выделение требует боль-
ших усилий и затрат времени. Кроме того, не су-
ществует надежных дооперационных методов, га-
рантирующих извлечение сперматозоидов при
пункции яичка и придатка яичка.
Если в силу разных причин невозможно пов-
торно получить этот генетический материал, то
выделенные единичные сперматозоиды необхо-
димо криоконсервировать. В данном случае па-
циент может быть застрахован от возможного не-
получения сперматозоидов непосредственно в
день аспирации ооцитов супруги.
Криоконсервирование эякуляторных спермиев –
стандартная процедура, и в большинстве случаев
она дает высокий выход жизнеспособных клеток,
а сперматозоиды, извлеченные путем биопсии,
имеют после замораживания-отогрева низкое ка-
чество. Описаны лишь единичные случаи наступ-
ления беременности после ЭКО замороженно-
оттаянными спермиями, полученными при обст-
руктивной и необструктивной азооспермии [13, 14].
В настоящее время разработаны высокоэффек-
тивные методы криоконсервирования нормозоо-
спермического эякулята, однако не выработан под-
ход к криоконсервированию единичных эякуля-
торных и эпидидимальных спермиев.
Целью данного исследования явилось изучение
морфофункциональных характеристик, оплодо-
творяющей способности и частоты наступления
беременности после использования криоконсер-
вированных единичных спермиев, полученных при
MESA/PESA в программе ICSI.
Материалы и методы
У 58 супружеских пар в связи с азооспермией
супруга были проведены программы ЭКО + ICSI
эпидидимальными спермиями, из них у 32 (груп-
па 1) свежеаспирированными, 26 (группа 2) – крио-
консервированными спермиями.
spem extraction, i. e. obtaining sperm during an open
biopsy of the epididymis) and TESE (testicular sperm
extraction, i. e. obtaining sperm during an open testi-
cular biopsy) [4, 10, 18, 19].
To treat infertility at husband’s azoospermia there
are mostly used freshly aspirated spermatozoa and in
vitro fertilization (IVF) with intracytoplasmic sperm
injection (ICSI) [7, 8, 20]. Moreover the number of
suitable for fertilization normal active spermatozoa may
be very low, and their isolation is difficult and time-
consuming. In addition there are no reliable non-
surgical methods guaranteeing the extraction of sper-
matozoa at the puncture of epididymis and testis.
If for different reasons it is impossible to re-obtain
this genetic material the isolated spermatozoa are to
be cryopreserved. In this case the patient may be
insured against possible non-obtaining of spermatozoa
in the day of aspiration of wife’s oocytes.
Cryopreservation of ejaculatory sperm cells has
become a standard procedure and it gives mostly a
high outcome of viable cells. However, the spermato-
zoa isolated by biopsy have a low quality after freeze-
thawing. There are described only a few cases of preg-
nancy after IVF with frozen-thawed sperm obtained
at obstructive and non-obstructive azoospermia [13,
14]
Currently the highly effective methods for cryo-
preservation of normozoospermic ejaculate have been
developed, but no approach for cryopreservation of
single ejaculatory or epididymal sperm has been deve-
loped.
The research aim was to study morphofunctional
characteristics, fertilizing ability and frequency of preg-
nancies after using the cryopreserved single sper-
matozoa obtained at MESA/PESA with ICSI.
Materials and methods
For 58 couples wherein husband had azoospermia
were performed IVF + ICSI programs with epididymal
spermatozoa, among them for 32 couples (group 1)
the freshly aspirated cells were used, and for 26 coup-
les (group 2) the cryopreserved sperm was applied.
Clinical and laboratory data of women in both groups
were comparable. Stimulation was done using agonists
of gonadotropin-releasing hormone with initial dose of
recombinant follicle-stimulating hormone of 225 IU.
MESA/PESA methods were applied in the day of
transvaginal follicle aspiration.
Men were andrologically examined, analysis of
ejaculate, study of hormonal status, cytogenetical
analysis of lymphocytes of peripheral blood were done.
When performing MESA/PESA we obtained the
aspirate and placed it into Sperm Preparation Medium
(Cook, Australia). If there were present any sperma-
tozoa the aspirate was centrifuged at 900 g for 10 min.
262 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
Клинико-лабораторные данные женщин обеих
групп были сопоставимы. Стимуляция проводилась
с применением агонистов гонадотропин-релизинг-
гормона со стартовой дозой рекомбинантного фол-
ликулостимулирующего гормона 225 МЕ. Мето-
дики MESA/PESA применялись в день трансва-
гинальной аспирации фолликулов.
Мужчины прошли общее андрологическое об-
следование: анализ эякулята, исследование гормо-
нального статуса, цитогенетический анализ лимфо-
цитов периферической крови.
При проведении MESA/PESA получали аспират,
который помещали в среду «Sperm Preparation
Medium» («Cook», Австралия). При обнаружении
сперматозоидов аспират центрифугировали при
900g 10 мин. Осадок ресуспендировали в 20 мкл
среды, подсчитывали количество сперматозоидов,
оценивали их морфологию и кинетическую актив-
ность (количество активно-подвижных клеток).
Для криоконсервирования сперматозоидов исполь-
зовали метод Г.Г. Юрченко и соавт. [3]. К суспен-
зии сперматозоидов добавляли 20 мкл фосфатно-
буферной среды с 20% сахарозы и 15% глицерина.
После 15 мин эквилибрации в капилляры диамет-
ром 100 мкм и объемом 50 мкл помещали 40 мкл
раствора криопротектора с суспензией спермато-
зоидов. Биоматериал криоконсервировали по двух-
этапной программе: от 22 до –35°С со скоростью
1 град/мин, от –35 до –70°С со скоростью
20 град/мин, затем микрокапилляры погружали в
жидкий азот.
Для деконсервирования образцы помещали на
водяную баню с температурой 37°С. Немедленно
удаляли криопротектор путем 10-минутного цент-
рифугирования среды при 900g. К осадку добавляли
20 мкл среды «Sperm Preparation Medium». Спер-
матозоиды эквилибрировали 10 мин в инкубаторе
при температуре 37°С, 6% СО2. Выживаемость
сперматозоидов после размораживания определя-
ли как количество подвижных клеток. Для вы-
полнения ICSI проводили селекцию спермиев по
морфофункциональным характеристикам. Через
16 ч после оплодотворения регистрировали наличие
пронуклеусов. Полученные эмбрионы культиви-
ровали in vitro в условиях 6% СО2, 37°С в альбу-
мин-содержащей среде («Cook»).
Эмбрионы в полость матки переносили на
5-е сутки. Для оценки бластоцист использовали
классификацию D. Gardner [9].
Данные статически обрабатывали с использо-
ванием t-теста. Показатели в таблице и тексте
представлены в виде среднего ± стандартной
ошибки среднего. Различия показателей считали
значимыми при p < 0,05.
The sediment was resuspended in 20 ml of medium,
the number of spermatozoa was calculated, their
morphology and kinetic activity (the number of active
cells) were assessed. To cryopreserve the sperm we
used the method of Yurchenko et al. [3]. Sperm suspen-
sion was supplemented with 20 ml phosphate buffer
medium with 20% sucrose and 15% glycerol. After
15 min equilibration the capillaries of 100 mm diameter
and 50 ml volume were filled with 40 ml cryoprotectant
solution mixed with sperm suspension. Biological ma-
terial was cryopreserved by two-step program: from
22 down to –35°C with 1 deg/min rate, from –35 down
to –70°C with the rate of 20 deg/min, then the micro-
capillaries were plunged into liquid nitrogen.
For thawing the samples were placed in water bath
at 37°C. The cryoprotectant was immediately removed
by 1 minute long centrifugation of the sample at 900g.
The sediment was resuspended in 20 µl of Sperm
Preparation Medium. The spermatozoa were incubated
during 10 min at 37°C and 6% CO2. The survival of
spermatozoa after thawing was determined as a
number of active cells with a normal structure. To per-
form ICSI we selected the spermatozoa by morpho-
functional characteristics. In 16 hours after fertilization
we checked the presence of pronuclei. The obtained
embryos were in vitro cultured in albumin-containing
medium (Cook, Australia) at 6% CO2, 37°C.
Embryos were transfered into uterine cavity to the
5th day. Classification of Gardner was used to assess
blastocysts [9].
The data were statistically processed with t-test.
The indices in table and text were presented as a
mean ± standard error of the mean. The differences
of indices were considered as significant at p < 0.05.
Results and discussion
The using of native and cryopreserved epididymal
spermatozoa was the formation criterion of the studied
groups. Herewith the distribution of females in the
groups by age was identical in the groups 1 and 2:
30.0 ± 6.2 and 31.7 ± 3.4 years, respectively. Woman
age is an important prognostic factor of efficiency of
assisted reproductive technologies and must be consi-
dered at randomization of the studied groups.
During follicle aspiration there were procured 202
oocytes in the group 1 and 177 in the group 2. No
significant differences in average number of aspirated
oocytes in the groups 1 and 2 groups were found
(Table), i.e. the results of ovary stimulation in the studied
patients were comparable.
An average number of spermatozoa in aspirates of
the men of the groups 1 and 2 was comparable as well
(see Table). The studying of morphofunctional charac-
teristics of epididymal spermatozoa showed a signifi-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
263
Результаты и обсуждение
Критерием формирования исследуе-
мых групп было использование свежеас-
пирированных и криоконсервированных
эпидидимальных спермиев. При этом рас-
пределение групп по возрасту женщин-
партнеров было тождественным: 30,0 ± 6,2
и 31,7 ± 3,4 года в группах 1 и 2 соответст-
венно. Возраст женщин является важным
прогностическим фактором эффективнос-
ти вспомогательных репродуктивных
технологий и должен учитываться при ран-
домизации исследуемых групп.
При аспирации фолликулов было выде-
лено 202 ооцита в группе 1 и 177 – в груп-
пе 2. Различия среднего количества аспи-
рированных ооцитов в группах 1 и 2 были
незначимыми (таблица), т. е. результаты
стимуляции яичников у исследуемых па-
циенток были сопоставимыми.
Среднее количество спермиев в аспи-
ратах мужчин групп 1 и 2 было также со-
поставимо (см. таблицу). Исследование
морфофункциональных характеристик
эпидидимальных спермиев показало зна-
чительное снижение общего количества
спермиев и активно-подвижной фракции по
сравнению с нормозооспермическими
эякулятами (данные ВОЗ по нормозоо-
Параметры ICSI/MESA/PESA циклов
при использовании свежеаспирированных
и криоконсервированных спермиев
Parameters of ICSI/MESA/PESA cycles
with fresh or frozen-thawed sperm
ыртемараП
sretemaraP
-ирипсаежевС
иимрепсеыннавор
)1аппург(
mrepshserF
)1puorG(
-оривреснокоирK
иимрепсеыннав
)2аппург(
dewaht-nezorF
)2puorG(mreps
рапхиксежурпусолсиЧ
selpuocdeirramforebmuN 23 62
тел,котнеицаптсарзоВ
sraey,selameffoegA 2,6±0,03 4,3±7,13
овтсечилок)еещбо(еендерС
елкицввотицоохыннаворирипса
forebmun)latot(egarevA
elcycanisetycoodetaripsa
)202(0,1±3,6 )771(6,1±8,6
веимрепсовтсечилокеендерС
aozotamrepsforebmunegarevA 2,61±9,871 6,81±2,171
овтсечилок)еещбо(еендерС
IIМиидатсанвотицоо
setycooforebmun)latot(egarevA
egatsIIMta
)991(9,0±2,6 )561(9,0±3,6
овтсечилок)еещбо(еендерС
вотицоохыннаворицеъни
detaertforebmun)latot(egarevA
setycoo
)991(9,0±2,6 )561(9,0±3,6
%,иицазилитрефатотсаЧ
%,etarnoitazilitreF 8,7±8,49 6,6±9,69
%,яинелбордатотсаЧ
%,etaregavaelC 1,5±1,89 6,4±53,89
спермии – 50% [23]). Так, количество активно-
подвижных спермиев в группе 1 составило 12 ±
0,8, в группе 2 – 8 ± 0,8%. После замораживания
сперматозоиды хранили в жидком от месяца до
года. Выживаемость спермиев после отогрева
составила 92 ± 8,8%.
После отогрева, удаления криопротектора и ин-
кубации отбирали подвижные сперматозоиды с нор-
мальным строением и проводили оплодотворение
ооцитов с помощью ICSI. Высокая частота ферти-
лизации ооцитов (см. таблицу) свидетельствовала
о том, что криоконсервирование тестикулярных
спермиев не влияло на их оплодотворяющую спо-
собность. Изучение морфологических характерис-
тик эмбрионов на 5-е сутки культивирования по-
казало наличие динамики дробления и высокое
качество эмбрионов, поскольку стадии бластоцист
достигло более 50% эмбрионов в обеих группах.
Частота наступления беременности в группе с при-
менением криоконсервированных спермиев была
выше (53,1%), чем в группе с оплодотворением
свежеаспирированными клетками (46,1%).
Следует отметить, что результаты исследова-
ний циклов лечения бесплодия методом ICSI с при-
менением криоконсервированных эпидидимальных
cant reduction of total number of spermatozoa and
active motile fraction if compared with normozoo-
spermic ejaculates (the WHO standard for normozoo-
spermia is 50% [23]). Specifically, the number of active
motile spermatozoa in the group 1 group was 12 ± 0.8,
and in the group 2 it made (8 ± 0.8)%. After freezing
the spermatozoa were stored in liquid nitrogen during
period of one month to one year. Survival of sperma-
tozoa after freeze-thawing made (92 ± 8.85)%.
After freeze-thawing, removing of cryoprotectant
and incubation the motile spermatozoa with normal
acrosome were selected and oocytes fertilization was
performed by ICSI. A high rate of oocytes fertilization
(Table) testified to the fact that cryopreservation of
testicular spermatozoa did not affect their fertilizing
ability. Assessment of morphological characteristics
of embryos to the 5th culture day revealed the ongoing
cleavage and a high quality of embryos, since blasto-
cyte stage was achieved in more than 50% of embryos
in both groups. Pregnancy in the group where
cryopreserved spermatozoa were used was higher
(53.1%) than in the group where fertilization was done
with fresh aspirated cells (46.1%).
It should be noted that the reported results of
infertility treatment cycles by ICSI with cryopreserved
264 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
спермиев зачастую противоречивы. Наши резуль-
таты согласуются с данными многих исследовате-
лей, которые продемонстрировали увеличение час-
тоты наступления беременности при использовании
криоконсервированных эпидидимальных спермиев
[5, 6, 11, 12, 17]. Tournaye H. и соавт. показали гене-
тическую безопасность криоконсервирования эпи-
дидимальных сперматозоидов: частота оплодотво-
рения криоконсервированными спермиями не
отличалась от показателя после использования све-
жеаспирированных клеток (75,67 и 76,49%), коли-
чество эмбрионов хорошего качества составило
64,96 и 66,09%, частота наступления беременнос-
ти – 55,21 и 57,22% [21].
По данным L. Gin и соавт. [13] частота наступ-
ления беременности у пациентов после процедур
с применением криоконсервированных эпидиди-
мальных спермиев не отличалась от таковой в
случае свежеаспирированных клеток.
Известны единичные сообщения о сущест-
венной доле спонтанных абортов после выполнения
MESE/ICSI (25,7%) и TESE/ICSI (31,6%) [6], что
можно объяснить высокой частотой хромосомных
аномалий у мужчин как с обструктивной, так и
необструктивной азооспермией [12]. По данным
Munne S. и соавт. [15] частота рождения детей с
хромосомными аномалиями у мужчин с азооспер-
мией в 10 раз выше по сравнению с нормоспермией.
В работе Westlander G. и соавт. [22] представ-
лены результаты проведения ICSI с криоконсер-
вированными спермиями, полученными при пер-
кутанной биопсии яичка. Авторы сделали вывод о
необходимости изучения состояния генетического
аппарата спермиев после криоконсервирования.
Были проанализированы результаты лечения
493 супружеских пар после проведения процедуры
ICSI криоконсервированными спермиями, получен-
ными методами TESЕ, MESA, MESE, PESA.
Частота наступления беременности у пациенток
после оплодотворения ооцитов криоконсервирован-
ными спермиями, независимо от метода их полу-
чения, была выше, чем в случае свежеаспириро-
ванных клеток [11, 13, 14, 16].
Silber S. и соавт. провели ретроспективное ис-
следование 156 циклов ICSI с применением крио-
консервированных спермиев и установили, что уро-
вень активации эмбрионального генома, оцененный
по частоте 8-клеточного блока развития и скорости
морфогенеза, не отличался после использования
криоконсервированных спермиев по сравнению с
клетками, не подвергавшимися замораживанию-
отогреву [19].
Таким образом, криоконсервирование спермиев
незаменимо при тяжелом мужском бесплодии.
Данный метод позволяет уменьшить число хирур-
epididymal spermatozoa are often contradictory. Our
results are agreed with the data of many researchers,
who presented the increasing of pregnancy rate when
using cryopreserved epididymal spermatozoa [5, 6, 11,
12, 17]. Tournaye et al. reported genetic safety of cryo-
preservation of epididymal spermatozoa: fertilization
rate of cryopreserved spermatozoa did not differ from
that after using fresh aspirated cells (75.67 and
76.49%), a number of embryos of a high quality made
64.96 and 66.09%, pregnancy rate was 55.21 and
57.22%, correspondingly [21].
According to the data of Gin et al. [13] the pregnan-
cy rate in the patients after the procedures, where
cryopreserved epididymal spermatozoa were used, did
not differ from that in the case of fresh aspirated cells.
There are single reports about significant rate of
spontaneous abortions after performing MESE/ICSI
(25.7%) and TESE/ICSI (31.6%) [6], that may be
explained by a high frequency of chromosomal abnor-
malities in men both with obstructive and nonobstructive
azoospermia [12]. According to the data of Manne
et al. [15] the frequency of birth defects caused by
chromosomal abnormalities in men with azoospermia
is 10 times higher if compared with men with normo-
spermia.
Westlander et al. [22] reported the results of ICSI
with cryopreserved spermatozoa, obtained at percu-
taneous biopsy of testes. The authors pointed to the
necessity of assessing the state of spermatozoa genetic
apparatus after cryopreservation.
Analyzis of treatment outcome in 493 married coup-
les after ICSI with cryopreserved spermatozoa,
procured by TESE, MESA, MESE and PESA allowed
to conclude that pregnancy rate in patients after ferti-
lization of oocytes with cryopreserved spermatozoa
independently of the method of their procurement was
higher than in the case of fresh aspirated cells [11, 13,
14, 16].
Silber et al. performed retrospective study of 156
cycles of infertility treatment by ICSI with cryopreser-
ved spermatozoa and found that activation level of
embryonic genome assessed by frequency of 8-cell
stage development arrest and morphogenesis rate did
not differ after using cryopreserved spermatozoa if
compared with the cells, not exposed to freeze-thawing
[19].
Thus, spermatozoa cryopreservation is essential at
severe male infertility. This method enables to reduce
a number of surgeries, avoid complications and expen-
ses on repeated surgeries as well as to select optimal
moment for assisted fertilization.
We found that the method previously developed for
ejaculatory spermatozoa [3], might be used for single
epididymal spermatozoa. Outcome of procedures of
assisted reproductive technologies using cryopreserved
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
265
гических вмешательств, избежать осложнений и
расходов, связанных с повторными хирургичес-
кими операциями, а также выбрать оптимальный
момент для проведения процедуры программиро-
ванного зачатия.
Мы установили, что метод, разработанный ра-
нее для эякуляционных спермиев [3], может при-
меняться для единичных эпидидимальных спер-
матозоидов. Исход процедур вспомогательных
репродуктивных технологий с использованием
криоконсервированных клеток (частота оплодо-
творения ооцитов, темпы дробления и качество
эмбрионов, частота наступления беременности)
существенно не отличается от результатов, полу-
ченных после использования свежеаспирирован-
ных сперматозоидов. Таким образом, аспирирован-
ные сперматозоиды могут быть успешно криокон-
сервированы, а их использование обеспечивает
эффективное лечение бесплодия методом ICSI.
Выводы
Можно заключить, что проведение ICSI спер-
матозоидами, полученными в результате МЕSА/
PESA, является эффективным при азооспермии.
Метод криоконсервирования, разработанный ранее
для эякуляторных сперматозоидов пациентов с
нормоспермией, может успешно применяться для
единичных спермиев, позволяет добиться их вы-
сокой выживаемости и не оказывает отрица-
тельного влияния на оплодотворяющую способ-
ность и дальнейшее развитие эмбрионов in vitro.
Литература
1. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогатель-
ные репродуктивные технологи / Под ред. В.И. Кулакова,
Б.В. Леонова, Л.Н. Кузьмичева. – М.: Мед. информ.
агентство, 2005. – 592 с.
2. Хилькевич Л.В., Здановский В.М., Тогобецкий С., Гоголев-
ский П.А. Вспомогательные репродуктивные технологии
(PESA и MESA) при лечении бесплодия, обусловленного
мужским фактором // Проблемы репродукции. – №2. –
1998. – C. 29–33.
3. Юрченко Г.Г., Дунаевская А.В., Крамар М.И. Влияние ме-
тода выделения подвижной фракции гамет из эякулята
человека на их морфофункциональную сохранность
после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. –
2001.– №2.– С. 30–35.
4. Craft I., Bennet V., Nicholson N. Fertilising ability of testicular
spermatozoa // Lancet.– 1993.– Vol.2, № 342.– C. 864.
5. Craft I., Tsirigotis M. Simplified recovery, preparation and cryo-
preservation of testicular spermatozoa // J. Hum. Reprod. –
1995.– Vol. 10, №7. – P. 1623–1627.
6. Desai N., AbdelHafez F., Sabanegh E. Paternal effect on
genomic activation, clinical pregnancy and live birth rate after
ICSI with cryopreserved epididymal versus testicular sper-
matozoa // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2009.– Vol. 3, №7. –
P. 142–149.
References
1. Treatment of female and male infertility. Assisted reproductive
technologies / Ed. by Kulakov V.I., Leonov B.V., Kuzmichev
L.N. – Moscow: Med. Inform. Agenstvo, 2005. – 592 p.
2. Khilkevich L.V., Zdanovsky V.M., Togobetsky S., Gogolev-
sky P.A. Additional reproductive technologies (PESA and
MESA) at infertility treatment stipulated by male factor //
Problemy Reproduktsii. – 1998. – N2. – P. 29–33.
3. Yurchenko G.G., Dunaevskaya A.V., Kramar M.I. Effect of de-
rivation method of motile fractions of gametes from human
ejaculate on their morphofunctional integrity after cryo-
preservation // Problems of Cryobiology. – 2001. – №2. –
P. 30–35.
4. Craft I., Bennet V., Nicholson N. Fertilising ability of testicular
spermatozoa // Lancet.– 1993.– Vol. 2, N342.– C. 864.
5. Craft I., Tsirigotis M. Simplified recovery, preparation and cryo-
preservation of testicular spermatozoa // J. Hum. Reprod. –
1995.– Vol. 10, N7. –P. 1623–1627.
6. Desai N., AbdelHafez F., Sabanegh E. Paternal effect on
genomic activation, clinical pregnancy and live birth rate after
ICSI with cryopreserved epididymal versus testicular sper-
matozoa // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2009.– Vol. 3, N7. –
P. 142–149.
7. Devroey P., Liu J., Nagy Z. et al. Normal fertilization of human
oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic
sperm injection (TESE and ICSI) // Fertil. Steril. – 1994.– Vol. 62,
N3.– P. 639–641.
8. Devroey P., Nagy Z., Tournaye H. et al. Outcome of itracyto-
plasmic sperm injection with testicular spermatozoa in obstruc-
tive and non-obstructive azoospermia // J. Hum. Reprod. –
1996. – Vol. 11, N5. – P. 1015–1018.
9. Gardner D., Lane. M., Stevens J. Schoolcraft W. Noninvasive
assessment of human embryo nutrient consumption as a
measure of developmental potential // Fertil. Steril. – 2001. –
Vol. 76, N6. – P. 1175–1180.
10. Hovatta O., Moilanen J., von Smitten K. et al. Testicular needle
biopsy, open biopsy, epididymal aspiration and intracytoplasmic
sperm injection in obstructive azoospermia // J. Hum. Reprod. –
1995.– Vol. 10, N10. – P. 2595–2599.
11. Jacques I., Phillips S., Hemmingset R. et al. Ongoing pregnancy
after ICSI of frozen-thawed PESA-retrieved spermatozoa and
IVF in a controlled natural cycle // Reprod. BioMed. Online. –
2005. – Vol. 10, N5. – P. 650–652.
12.Janzen N. Use of electively cryopreserved microsurgically
aspirated epididymal sperm with IVF and intracytoplasmic
cells (oocytes fertilization rate, division rate, pregnancy
rate) did not significantly differ from the results, obtai-
ned after using fresh aspirated spermatozoa. There-
fore, aspirated spermatozoa may be successfully cryo-
preserved and their using provides an effective infer-
tility treatment by ICSI.
Conclusions
We may conclude that performing ICSI with sper-
matozoa, obtained by MESA/PESA is effective for
azoospermia. Cryopreservation method previously de-
veloped for ejaculatory spermatozoa of the men with
normospermia may be successfully used for single
spermatozoa, enables to achieve their high survival and
does not negatively affect fertilizing capacity and fur-
ther in vitro development of embryos.
266 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
7. Devroey P., Liu J., Nagy Z. et al. Normal fertilization of human
oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic
sperm injection (TESE and ICSI) // Fertil. Steril. – 1994.– Vol. 62,
№3.– P. 639–641.
8. Devroey P., Nagy Z., Tournaye H. et al. Outcome of itracyto-
plasmic sperm injection with testicular spermatozoa in obstruc-
tive and non-obstructive azoospermia // J. Hum. Reprod. –
1996. – Vol. 11, №5. – P. 1015–1018.
9. Gardner D., Lane. M., Stevens J. Schoolcraft W. Noninvasive
assessment of human embryo nutrient consumption as a
measure of developmental potential // Fertil. Steril. – 2001. –
Vol. 76, №6. – P. 1175–1180.
10. Hovatta O., Moilanen J., von Smitten K. et al. Testicular needle
biopsy, open biopsy, epididymal aspiration and intracytoplasmic
sperm injection in obstructive azoospermia // J. Hum. Reprod. –
1995.– Vol. 10, №10. – P. 2595–2599.
11. Jacques I., Phillips S., Hemmingset R. et al. Ongoing pregnancy
after ICSI of frozen-thawed PESA-retrieved spermatozoa and
IVF in a controlled natural cycle // Reprod. BioMed. Online. –
2005. – Vol. 10, №5. – P. 650–652.
12.Janzen N. Use of electively cryopreserved microsurgically
aspirated epididymal sperm with IVF and intracytoplasmic
sperm injection for obstructive azoospermia // Fertil. Steril. –
2000. – Vol. 74, №4. – P. 696–701.
13.Jin L., Jiang L.Y., Zhu G.J. et al.Comparison between the results
of ICSI with fresh and with frozen-thawed sperm obtained by
PESA to treat azoospermia // Zhonghua Nan Ke Xue. – 2006. –
Vol. 12, №5. – P. 443–449.
14.Kalsi J., Thum MY., Muneer A. Analysis of the outcome of
intracytoplasmic sperm injection using fresh or frozen sperm //
Br. J. Urol. – 2011. – Vol. 107, №7. – P. 1124–1128.
15.Munne S., Alikani M., Tomkin G. et al. Embryo quality and chro-
mosome abnormalities after ICSI. Abstract from the IXth World
Congress on IVF and Alternate Assisted Reproduction // J.
Assist. Reprod. Genet. – 1995. – Vol. 76, №12. – P. 76.
16.Ou L., Guo YH., Sun YP. et al. Outcomes of ICSI with micro-
amount frozen-thawed sperm obtained by PESA or TESA in
the treatment of azoospermia // Zhonghua Nan Ke Xue. –
2010. – Vol. 16, №4. – P. 328–332.
17.Patrizio P. Cryopreservation of epididymal sperm // Mol. Cell
Endocrinol. – 2000. – Vol. 169, №1–2. – P. 11–14.
18.Schoysman R., Vanderzwalmen P., Nus M. Pregnancy after
fertilization with human testicular spermatozoa //Lancet.–
1993.– Vol.13, №342.– C.1237.
19.Silber S., Nagy Z., Liu J. et al. The use of epididymal and
testicular spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection:
the genetic implications for male infertility // J. Hum. Reprod. –
1995. – Vol. 10, №8. – P. 2031–2043.
20.Silber S., Van Steirteghem A.C., Liu J. et al. High fertilization
and pregnancy rates after sperm obtained from testicle bio-
psy // J. Hum. Reprod. – 1995. – Vol. 10 , №1. – P. 148–152.
21.Tournaye H., Merdad T., Silber S. et al. No differences in out-
come after intracytoplasmic sperm injection with fresh or with
frozen-thawed epididymal spermatozoa // J. Hum. Reprod. –
1999.– Vol. 14, №1. – P. 90–95.
22.Westlander G., Hamberger L., Hanson Ch. et al. Diagnostic
epididymal and testicular sperm recovery and genetic aspects
in azoospermic men // J. Hum. Reprod. – 1999. – Vol. 14,
№1. – P. 118–122.
23.World Health Organization. WHO laboratory manual for the
examination of human semen and sperm-cervical mucus
interaction. – Cambridge, UK, 1999. – 102 p.
sperm injection for obstructive azoospermia // Fertil. Steril. –
2000. – Vol. 74, N4. – P. 696–701.
13.Jin L., Jiang L.Y., Zhu G.J. et al.Comparison between the results
of ICSI with fresh and with frozen-thawed sperm obtained by
PESA to treat azoospermia // Zhonghua Nan Ke Xue. – 2006. –
Vol. 12, N5. – P. 443–449.
14.Kalsi J., Thum MY., Muneer A. Analysis of the outcome of
intracytoplasmic sperm injection using fresh or frozen sperm //
Br. J. Urol. – 2011. – Vol. 107, N7. – P. 1124–1128.
15.Munne S., Alikani M., Tomkin G. et al. Embryo quality and chro-
mosome abnormalities after ICSI. Abstract from the IXth World
Congress on IVF and Alternate Assisted Reproduction // J.
Assist. Reprod. Genet. – 1995. – Vol. 76, N12. – P. 76.
16.Ou L., Guo YH., Sun YP. et al. Outcomes of ICSI with micro-
amount frozen-thawed sperm obtained by PESA or TESA in
the treatment of azoospermia // Zhonghua Nan Ke Xue. –
2010. – Vol. 16, N4. – P. 328–332.
17.Patrizio P. Cryopreservation of epididymal sperm // Mol. Cell
Endocrinol. –2000. – Vol. 169, N1–2. – P. 11–14.
18.Schoysman R., Vanderzwalmen P., Nus M. Pregnancy after
fertilization with human testicular spermatozoa //Lancet.–
1993.– Vol.13, N342. – C.1237.
19.Silber S., Nagy Z., Liu J. et al. The use of epididymal and
testicular spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection:
the genetic implications for male infertility // J. Hum. Reprod. –
1995. – Vol. 10, N8. – P. 2031–2043.
20.Silber S., Van Steirteghem A.C., Liu J. et al. High fertilization
and pregnancy rates after sperm obtained from testicle bio-
psy // J. Hum. Reprod. – 1995. – Vol. 10 , N1. – P. 148–152.
21.Tournaye H., Merdad T., Silber S. et al. No differences in out-
come after intracytoplasmic sperm injection with fresh or with
frozen-thawed epididymal spermatozoa // J. Hum. Reprod. –
1999.– Vol. 14, N1. – P. 90–95.
22.Westlander G., Hamberger L., Hanson Ch. et al. Diagnostic
epididymal and testicular sperm recovery and genetic aspects
in azoospermic men // J. Hum. Reprod. – 1999. – Vol. 14, N1. –
P. 118–122.
23.World Health Organization. WHO laboratory manual for the
examination of human semen and sperm-cervical mucus
interaction. – Cambridge, UK, 1999. – 102 p.
|