К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов

Рассмотрены преимущества модели кластерной кристаллизации при описании фазовых переходов в криопротекторных растворах. Сформулированы принципы построения диаграмм состояния, содержащих области cуществования кластерной фазы. На основании этих диаграмм проведен анализ экспериментально наблюдаемых тепл...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2014
Автор:	Осецкий, А.И.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2014
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68798
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов / А.И. Осецкий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 102-117. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-68798
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-687982014-10-11T22:00:56Z К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов Осецкий, А.И. Теоретическая и экспериментальная криобиология Рассмотрены преимущества модели кластерной кристаллизации при описании фазовых переходов в криопротекторных растворах. Сформулированы принципы построения диаграмм состояния, содержащих области cуществования кластерной фазы. На основании этих диаграмм проведен анализ экспериментально наблюдаемых тепловых и объемных эффектов, сопровождающих процессы кристаллизации и плавления криопротекторных растворов. При этом особое внимание уделено различию фазовых траекторий, соответствующих охлаждению и последующему нагреву растворов, и введено понятие совмещенных диаграмм состояния для описания процессов, вызванных этим различием. С помощью модели кластерной кристаллизации определены равновесные структурные состояния замороженных криопротекторных растворов и возможные процессы, направленные на их достижение. Розглянуто переваги моделі кластерної кристалізації при описі фазових переходів у кріопротекторних розчинах. Сформульовано принципи побудови діаграм стану, які включають області існування кластерної фази. На основі цих діаграм проведено аналіз теплових і об’ємних ефектів, які супроводжують процеси кристалізації та плавлення кріопротекторних розчинів. При цьому значну увагу приділено розрізненню фазових траєкторій, які відповідають охолодженню та подальшому нагріву розчинів, і введено поняття сумісних діаграм стану для опису викликаних цією різницею процесів. За допомогою моделі кластерної кристалізації визначено рівноважні структурні стани заморожених кріопротекторних розчинів і можливі процеси, спрямовані на їхнє досягнення. The paper considers the advantages of cluster crystallization model when describing phase transitions in cryoprotective solutions. The principles of plotting the diagrams of state are described, with emphasis on the fields of existing cluster phase. Basing on these diagrams the experimentally observed heat and volume effects are analyzed, which accompany the crystallization and melting of cryoprotective solutions. Herewith a special attention is paid to the distinguishing of phase curves, corresponding to cooling and following heating of the solutions and the definition of superposed diagrams of state was made to describe the processes caused by appearing differences. Model of cluster crystallization was used to determine the balanced structure state of frozen cryoprotective solutions and possible processes directed to their achieving. 2014 Article К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов / А.И. Осецкий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 102-117. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ. 2307-6143 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68798 547.42:532.78:539.213 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Осецкий, А.И. К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Рассмотрены преимущества модели кластерной кристаллизации при описании фазовых переходов в криопротекторных растворах. Сформулированы принципы построения диаграмм состояния, содержащих области cуществования кластерной фазы. На основании этих диаграмм проведен анализ экспериментально наблюдаемых тепловых и объемных эффектов, сопровождающих процессы кристаллизации и плавления криопротекторных растворов. При этом особое внимание уделено различию фазовых траекторий, соответствующих охлаждению и последующему нагреву растворов, и введено понятие совмещенных диаграмм состояния для описания процессов, вызванных этим различием. С помощью модели кластерной кристаллизации определены равновесные структурные состояния замороженных криопротекторных растворов и возможные процессы, направленные на их достижение.
format	Article
author	Осецкий, А.И.
author_facet	Осецкий, А.И.
author_sort	Осецкий, А.И.
title	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
title_short	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
title_full	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
title_fullStr	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
title_full_unstemmed	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
title_sort	к теории диаграмм состояния криопротекторных растворов
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2014
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68798
citation_txt	К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов / А.И. Осецкий // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 102-117. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT oseckijai kteoriidiagrammsostoâniâkrioprotektornyhrastvorov
first_indexed	2025-07-05T18:34:57Z
last_indexed	2025-07-05T18:34:57Z
_version_	1836833044515782656
fulltext	УДК 547.42:532.78:539.213 А.И. Осецкий К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов UDC 547.42:532.78:539.213 A.I. Osetsky To Theory of Diagrams of State for Cryoprotective Solutions Реферат: Рассмотрены преимущества модели кластерной кристаллизации при описании фазовых переходов в крио- протекторных растворах. Сформулированы принципы построения диаграмм состояния, содержащих области cуществования кластерной фазы. На основании этих диаграмм проведен анализ экспериментально наблюдаемых тепловых и объемных эффектов, сопровождающих процессы кристаллизации и плавления криопротекторных растворов. При этом особое внимание уделено различию фазовых траекторий, соответствующих охлаждению и последующему нагреву растворов, и введено понятие совмещенных диаграмм состояния для описания процессов, вызванных этим различием. С помощью модели кластерной кристаллизации определены равновесные структурные состояния замороженных криопротекторных растворов и возможные процессы, направленные на их достижение. Ключевые слова: криопротекторный раствор, кластерная кристаллизация, диаграмма состояния, стеклование, струк- тура. Реферат: Розглянуто переваги моделі кластерної кристалізації при описі фазових переходів у кріопротекторних розчинах. Сформульовано принципи побудови діаграм стану, які включають області існування кластерної фази. На основі цих діаграм проведено аналіз теплових і об’ємних ефектів, які супроводжують процеси кристалізації та плавлення кріопротекторних розчинів. При цьому значну увагу приділено розрізненню фазових траєкторій, які відповідають охолодженню та подальшому нагріву розчинів, і введено поняття сумісних діаграм стану для опису викликаних цією різницею процесів. За допомогою моделі кластерної кристалізації визначено рівноважні структурні стани заморожених кріопротекторних розчинів і можливі процеси, спрямовані на їхнє досягнення. Ключові слова: кріопротекторний розчин, кластерна кристалізація, діаграма стану, склування, структура. Abstract: The paper considers the advantages of cluster crystallization model when describing phase transitions in cryoprotective solutions. The principles of plotting the diagrams of state are described, with emphasis on the fields of existing cluster phase. Basing on these diagrams the experimentally observed heat and volume effects are analyzed, which accompany the crystallization and melting of cryoprotective solutions. Herewith a special attention is paid to the distinguishing of phase curves, corresponding to cooling and following heating of the solutions and the definition of superposed diagrams of state was made to describe the processes caused by appearing differences. Model of cluster crystallization was used to determine the balanced structure state of frozen cryoprotective solutions and possible processes directed to their achieving. Key words: cryoprotective solution, cluster crystallization, diagram of state, vitrification, structure. Адрес для корреспонденции: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-40-80, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: cryocon@rambler.ru Address for correspondence: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 3734080, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryocon@rambler.ru Department of Low Temperature Preservation, Institute for Prob- lems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Отдел низкотемпературного консервирования, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Поступила 25.01.2014 Принята в печать 14.02.2014 Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №2. – С. 102–117. © 2014 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Received January 25, 2014 Accepted February 14, 2014 Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(2): 102–117. © 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine оригинальное исследование research article 1. Введение Диаграммы состояния, описывающие фазовые траектории криопротекторных растворов в коорди- натах «состав-температура», используются при создании новых и оптимизации существующих тех- нологий криоконсервирования биообъектов. Одна- ко следует отметить, что несмотря на большое количество работ в этой области [1, 3–6, 8, 11–15], до сих пор четко не классифицированы экспери- ментально получаемые диаграммы и, соответст- венно, не установлен их обобщенный тип в рамках геометрической термодинамики. Во многом это связано с особенностями кристаллизации криопро- текторных растворов, обусловленными сложным характером взаимодействия молекул воды А с мо- лекулами криопротекторного вещества В. Возни- 1. Introduction Diagrams of state describing phase trajectories of cryoprotective solutions in the coordinates of ‘compo- sition vs. temperature’ are used to develop new and optimize existing technologies used for cryopreserva- tion of biological objects. However, it should be noted, despite of numerous reports in this field [1–4, 6, 9, 10, 12–15] there is no accurate classification of experi- mentally obtained diagrams yet and herewith these have no established generalized type within the framework of geometric thermodynamics. This is largely due to the peculiarities of crystallization of cryoprotective solu- tions stipulated by a complicated character of inter- action between water molecules, A, and molecules of cryoprotective agent, B. Emerging hydrogen bonds be- tween them have a wide energy range (1…10 kcal/mol) Main legends Т Temperature T& Temperature change rate −T& Cooling rate +T& Heating rate T0 Initial temperature of solution to be cooled Тm Melting temperature of pure component either A or B TC Crystallization temperature of pure component either A or B Тg Vitrification (devitrification) temperature of highly concentrated liquid fractions ТL – Temperature parameters of liquidus line when cooling solution ТL + Temperature parameters of liquidus line when heating frozen solution Тeut Eutectics temperature Ceut Eutectic concentration TC – Temperature of cluster crystallization onset when cooling the solution ТC + Temperature of ceasing the melting of clusters when heating CB Mass concentration of cryoprotective substance B C0, CC, Cg, C1 Concentration parameters of diagram of states AS Ice crystals aS Ice nanocrystals bS Nanocrystals of substance B in cluster covers bg Amorphous fraction of substance in cluster covers BS Crystals of cryoprotective substances B L Liquid phase βC Cluster phase G Solid amoprphous fraction ∆Gas Change of solution free energy when forming spatial AB-associates ∆Has Change of solution enthalpy when forming spatial AB-associates ∆Sas Change of solution entropy when forming spatial AB-associates βаc, βbc Cluster particles based on nanocrystals of ice and cryoprotective substance, respectively ∆CВ Change of liquid phase concentration during cluster crystallization ∆CА Change of liquid phase concentration during ice crystal formation ∆Vaс Change of system volume during cluster crystallization ∆VA Change of system volume during ice crystal formation ∆Vbс Change of system volume during formation or melting of cluster membranes ∆QA, ∆Qaс Heating effect accompanying formation of ice crystals and cluster particles <εH> Average energy of hydrogen A–B bonds in associate AnBm f Number of degrees of freedom in multiphase system in equilibrium state r Number of phases in equilibrium q Number of components in system (solution) Rd Dimensionality of phase diagram Ф+, Ф– Number of forming and disappearing phase when transiting interphase boundary of dimension Rb r0C Size of ice critical nucleus being in the base of cluster particle formation at temperature TC0 λ, ω Concentration parameters of nonvariant horizontal in diagram of state (AS + G)– Phase compositions characteristic for cooled solutions (AS + L + βC)+ Phase compositions characteristic for heated solutions (BS + L + βCb)* Phase compositions not observed in the used cryoprotective solutions Основные обозначения Т Температура T& Скорость изменения температуры −T& Скорость охлаждения +T& Скорость нагрева T0 Начальная температура охлаждаемого раствора Тm Температура плавления чистого компонента А или В TC Температура кристаллизации чистого компонента А или В Тg Температура стеклования (расстеклования) высококонцентрированных жидких фракций ТL – Температурные параметры линии ликвидуса при охлаждении раствора ТL + Температурные параметры линии ликвидуса при нагреве замороженного раствора Тeut Температура эвтектики Ceut Эвтектическая концентрация TC – Температура начала кластерной кристаллизации при охлаждении раствора ТC + Температура окончания плавления кластеров при нагреве замороженного раствора CB Весовая концентрация криопротекторного вещества В C0, CC, Cg, C1 Концентрационные параметры диаграмм состояния AS Кристаллы льда aS Нанокристаллы льда bS Нанокристаллы вещества В в оболочке кластера bg Аморфная фракция вещества В в оболочке кластера BS Кристаллы криопротекторного вещества В L Жидкая фаза βC Кластерная фаза G Твердая аморфная фракция ∆Gas Изменение свободной энергии раствора при образовании пространственных АВ-ассоциатов ∆Has Изменение энтальпии раствора при образовании АВ-ассоциатов ∆Sas Изменение энтропии раствора при образовании АВ-ассоциатов βаc, βbc Кластерные частицы на основе нанокристаллов льда и криопротекторного вещества соответственно ∆CВ Изменение концентрации жидкой фазы при кластерной кристаллизации ∆CА Изменение концентрации жидкой фазы при образовании кристаллов льда ∆Vaс Изменение объема системы при кластерной кристаллизации ∆VA Изменение объема системы при образовании кристаллов льда ∆Vbс Изменение объема системы при образовании или плавлении кластерных оболочек ∆QA, ∆Qaс Тепловые эффекты, сопровождающие образо- вание кристаллов льда и кластерных частиц <εH> Средняя энергия водородных связей А–В в комплексе АnВm f Число степеней свободы многофазной равновесной системы r Число находящихся в равновесии фаз q Число компонентов в системе (растворе) Rd Размерность диаграммы состояния Rb Размерность границ, разделяющих области существования фаз на диаграмме состояния Ф+, Ф– Число образующихся и исчезающих фаз при переходе через межфазную границу размерности Rb r0C Размер критического зародыша льда, лежащего в основе образования кластерной частицы при температуре ТС0 λ, ω Концентрационные параметры нонвариантной горизонтали на диаграмме состояния (AS + G)– Фазовые композиции, характерные для охлаждаемых растворов (AS + L + βC)+ Фазовые композиции, характерные для отогреваемых растворов (BS + L + βCb)* Фазовые композиции, не наблюдаемые в используемых криопротекторных растворах проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 103 кающие между ними водородные связи имеют широкий энергетический диапазон (1…10 ккал/моль) и могут существенно отличаться по величине даже в пределах одного комплекса АnВm, где n и m – количество молекул воды и криопротекторного вещества в комплексе. В результате слабо связан- ные молекулы могут участвовать в образовании отдельных кристаллов льда Аs или криопротек- торного вещества Bs. В то же время сильно свя- занные фрагменты комплексов АnВm при охлаж- дении раствора не диссоциируют и переходят в твердофазное состояние в виде аморфной фракции G [5, 6] или второй твердой фазы [3, 11, 13]. Харак- терно, что эта фаза, как правило, образуется не при охлаждении криопротекторного раствора, а при его последующем нагреве выше температуры рас- стеклования Тg [1, 4, 13–15]. Данный факт противоречит классическим представлениям о процессах кристаллизации водных растворов и крайне затрудняет выяснение как природы этой фазы, так и принципов ее отображения на диаграм- мах состояния. Фактически изучение особенностей образования второй фазы в данном случае затра- гивает не только сугубо криобиологические во- просы, связанные с обеспечением сохранности замораживаемых биообъектов, но и определенные разделы теории фазовых превращений. Последнее обусловлено тем, что ранее процесс образования подобных фаз в системах с межмолекулярным взаимодействием компонентов, которое приводит к образованию комплексов, не диссоциирующих в процессе кристаллизации раствора, детально не изучался. В связи с вышеизложенным в работе был про- веден анализ термодинамических аспектов воз- никновения второй твердой фазы в криопротектор- ных растворах при их охлаждении и последующем нагреве, а также принципов отображения областей ее существования на соответствующих диаграм- мах состояния (фазовых диаграммах). Установленный тип диаграмм может использо- ваться для объяснения экспериментально наблю- даемых закономерностей кристаллизации-плавле- ния наиболее востребованных в криобиологии криопротекторных растворов. 2. Особенности изображения кластерной фазы на диаграммах состояния двухкомпо- нентных систем Известно, что большинство криопротекторных веществ полностью растворимы в воде, а кристал- лы льда практически не содержат примесных ато- мов или молекул. Этот факт является веским осно- ванием для описания диаграммами состояния and can significantly differ in size even within the range of one complex AnBm, where n and m are the numbers of water molecules and cryoprotective agent in the associate. As a result, loosely bound molecules may participate in formation of single crystals of ice As or cryoprotective agent Bs. However, strongly bound fragments of AnBm associates during cooling of solution do not dissociate and transit into a solid state as an amorphous fraction G [2, 3] or the second solid state [1, 9, 12]. Specifically, this phase is usually not formed during cooling of cryoprotective solution, but when further heating up to devitrification temperature Tg [2, 12–15]. This fact contradicts the common ideas on the crystallization of aqueous solutions and extremely complicates revealing the nature of this phase as well as the principles of its visualization in diagrams of state. In fact, the study of peculiarities of the second phase formation in this case affects not only very cryobio- logical issues associated with providing preservation of frozen biological objects, but also certain parts of theory of phase transitions. The latter is stipulated by the fact that to the moment there are no detailed studies on formation of these phases in systems with intermo- lecular interactions between components, resulting in a formation of associates, which do not dissociate during crystallization of solution. In view of the aforesaid this study deals with analysis of thermodynamic aspects which underlie the appearance of the second solid state in cryoprotective solutions during their cooling and following heating as well as principles of visualizing the ranges of its existence in the corresponding diagrams of state (phase diagrams). The type of diagrams set may be used to explain experimentally observed regularities of crystallization, i.e. melting of the most applicable cryoprotective solutions in cryobiology. 2. Features of visualization of cluster phase in diagrams of state for two-component systems It is known that most of cryoprotective substances completely dissolve in water, and ice crystals are almost free of foreign atoms or molecules. This fact is strong case to apply phase diagrams of an eutectic type for describing the crystallization of both saline and aqueous solutions of cryoprotective agents [1, 6, 12, 14]. It is also believed that these diagrams are also suitable to describe the formation of crystal hydrates as intermediate phases (akbl)s in aqueous solutions of cryoprotective agents. Here the parameters k and l denote the ratio of water molecules A and cryoprotec- tive agent B in elementary unit of a crystal hydrate. In this case a whole diagram is divided into two or more unified eutectic diagrams, and eutectic crystallization 104 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 эвтектического типа процессов кристаллизации не только солевых растворов, но и водных растворов криопротекторных веществ [1, 3, 8, 13]. Считается также, что эти диаграммы пригодны и для описания процессов образования кристаллогидратов как про- межуточных фаз (akbl)s в водных растворах крио- протекторных веществ. Здесь параметры k и l оп- ределяют соотношение молекул воды А и крио- протекторного вещества В в элементарной ячейке кристаллогидрата. В этом случае общая диаграм- ма распадается на две или более слитные эвтек- тические диаграммы, а под эвтектической крис- таллизацией подразумевается переход жидкой фазы в смесь микрокристаллов льда as или микро- кристаллов криопротекторного вещества bs с крис- таллогидратами строго определенного состава (akbl)s [13]. Однако при детальном анализе процессов крис- таллизации и последующего плавления реальных криопротекторных растворов возникает ряд проти- воречий между экспериментальными данными и закономерностями эвтектической кристаллизации. Прежде всего, при экспериментальном изучении кинетики кристаллизации водных растворов на основе глицерина, диметилсульфоксида, этиленгли- коля, полиэтиленоксида и целого ряда других крио- протекторных веществ не удается четко зафикси- ровать не только эвтектическую концентрацию Сeut, но и температуру образования эвтектики при охлаждении Тeut. Фактически эта температура при концентрациях криопротекторного раствора СВ < C’eut (C’eut – предполагаемая эвтектическая кон- центрация) должна определяться по моменту крис- таллизации второй твердой фазы. Однако в реаль- ных системах процесс образования этой фазы наблюдается не при конкретных значениях темпе- ратуры Т = Т’eut и концентрации раствора СВ = C’eut, а в широких температурных и концентрационных интервалах. Кроме того, в большинстве случаев процесс образования второй фазы вообще не наб- людается при охлаждении, а ее образование и пос- ледующее плавление фиксируются двумя раздель- ными пиками на термограммах при последующем отогреве. При этом как величина площади под тепловыми пиками, так и расстояние между ними абсолютно не соответствуют эвтектическим зако- номерностям. Так, например, площадь под первым эндотермическим пиком, который обычно трак- туется как пик плавления «эвтектики», резко уменьшается при условии СВ → C’eut [1, 4, 13, 14], что явно противоречит канонам эвтектической кристаллизации. Не соответствует положениям теории фазовых превращений и тот эксперимен- тальный факт, что при достижении температуры is supposed as the transition of liquid phase in the mixture of ice microcrystals as or the cryoprotective agent microcrystals bs with crystal hydrates of strongly determined composition (akbl)s [12]. However, the detailed analysis of crystallization and following melting of real cryoprotective solutions re- veals some contradictions between experimental data and regularities of eutectic crystallization. First of all, experimental study of crystallization kinetics in aqueous solutions of glycerol, dimethyl sulfoxide, ethylene gly- col, polyethylene oxide and the range of other cryopro- tective agents do not allow to precisely locate either eutectic concentration, Сeut, or temperature when an eutectics forms during cooling, Teut. Actually, if con- centrations of cryoprotective solution are СВ < C’eut (C’eut is estimated eutectic concentration) this tempera- ture could be determined by the point of crystallization of the second solid state. However, in real systems this phase is formed within wide temperature range and concentration intervals rather than at certain values of temperature Т = Т’eut and concentration of solution СВ = C’eut. In addition, most cases do not show the appearance of the second phase during cooling, and its appearance and following melting are visualized by two separate peaks in thermograms only during following heating. Herewith, both value of area under thermal peaks and the distance between them are fully not consistent with the eutectic regularities. For examp- le, the area under the first endothermic peak usually interpreted as peak of ‘eutectics’ melting decreases dramatically if СВ → C’eut [3, 12–14], that obviously contradicts the canons of eutectic crystallization. No consistence with the regulations of theory of phase transitions one could find with the fact that when reaching the temperature Т’eut, conventionally denoted as eutectic one in the diagrams of state, the cooled cryoprotectants are not crystallized entirely. The remaining liquid fractions transit into solid amorphous state only at more lower temperatures Tg < Т’eut [3, 4, 14, 15]. It is also quite hard to explain a supposed preci- pitation of eutectics, being a mechanical mixture of single ice crystals as, cryoprotective agent bs and crys- tal hydrates (akbl)s [12]. This process requires a suf- ficient number of free molecules of water and cryo- protective substance in a solution. However, the con- centrations C’eut in the diagrams denote a liquid phase solely of strongly bound associates AnBm. Appearance of pure crystals as or bs in this solution could be possible if substance B would lose its cryoprotective properties stipulated by H-bonds, i. e. the following conditions could be fulfilled: <εH> → 0 at T → Т’eut, where <εH> is the average energy of H-bonds in the associate. Another case of this transition requires a проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 105 Т’eut, которая условно обозначается на диаграммах состояния как эвтектическая, охлаждаемые крио- протекторные растворы не кристаллизуются пол- ностью. Остающиеся жидкие фракции переходят в твердое аморфное состояние при более низких температурах Tg < Т’eut [1, 5, 6, 15]. Достаточно сложным для объяснения является и предполагаемый процесс выпадения эвтектик, состоящих из механической смеси отдельных кристаллов льда as, криопротекторного вещества bs и кристаллогидратов (akbl)s [13]. Для реализации этого процесса в растворе должно находиться дос- таточное количество свободных молекул воды и криопротекторного вещества. Однако обозначае- мым на диаграммах концентрациям Ceut соответ- ствует жидкая фаза, состоящая исключительно из сильно связанных комплексов АnВm. Для возникно- вения в таком растворе отдельных кристаллов as или bs вещество В должно терять свои криопротек- торные свойства, обусловленные Н-связями, т. е. необходимо выполнение условия <εH> → 0 при T → Т’eut, где <εH> – средняя энергия Н-связей в ассо- циате. Другой вариант такого перехода требует резкого повышения вероятности флуктуационных разрывов Н-связей при T → Т’eut. Очевидно, что оба условия противоречат физическому смыслу. Особенно проблематично использование термина «эвтектическая кристаллизация» для систем, в которых один из компонентов при реаль- но используемых режимах охлаждения-отогрева не кристаллизуется вообще, например для водно- глицериновых растворов. Очень спорным представляется описание крис- таллизации криопротекторных растворов набором слитных эвтектических диаграмм, в которых промежуточными фазами выступают кристалло- гидраты. Такими фазами могут являться только кристаллогидраты строго постоянного состава с регулярной кристаллической решеткой, которые образуются как в процессе предварительного охлаждения, ниже линии ликвидуса, так и при эв- тектическом переходе жидкой фазы в смесь крис- таллов льда as и кристаллогидратов (akbl)s. Однако регулярные кристаллические решетки на основе молекул воды и перечисленных криопротекторных веществ до настоящего времени не обнаружены. Особенно сложно представить образование таких решеток в условиях, при которых в охлаждаемом растворе вследствие роста кристаллов Аs или Bs постоянно изменяется соотношение молекул А и В. В таком случае необходимо постулировать воз- можность существования вдоль оси концентраций СВ набора кристаллогидратов разного состава [13]. В то же время смоделировать соответствующие этому предположению регулярные кристалличес- sharp increase of probability of fluctuation breaks in H-bonds at T → Т’eut. Both conditions apparently have no physical sense. Using the term ‘eutectic crystallization’ is especially questionable for systems wherein one of the compo- nents do not crystallize at all under the used regimens of freeze-thawing, for instance, aqueous-glycerol solu- tions. Quite controversial is also the visualization of crys- tallization of cryoprotective solutions by the set of superposed eutectic diagrams where crystal hydrates serve as intermediate phases. These phases may be only the crystal hydrates of strictly constant composition with regular lattice formed both during precooling below liquidus line and during eutectic transition of liquid state into the mixture of ice crystals as and crystal hydrates (akbl)s. However, no regular lattices based on water molecules and mentioned cryoprotective agents have been revealed so far. It is hard to imagine the formation of these lattices under conditions when the ratio of molecules A and B constantly change in a cooled solution due to the growth of crystals As or Bs. In this case one has to postulate the possible existence of set of crystal hydrates of different composition along the concentration axis CB [12]. At the same time, it is impossible to model regular lattices corresponding to this assumption. Such an inconsistency of experimental data and parameters of eutectic crystallization rise the issue concerning the nature of the second phase in aqueous solutions of cryoprotective agents and peculia- rities of its visualization in diagrams of state. As one of the possible answers to this question is previously investigated probability of formation of microcrystals as and bs without breaks in hydrogen bonds in associates AnBm [8–10]. In particular, for crys- tals as during cooling of cryoprotective solution such a possibility appears at T ≤ TC (Fig. 1) [9, 10] when of ice crystal nuclei acquire such a critical size whereby they can form the clusters without breaks of A–B bonds due to combination of AnBm associates. Herewith, the number of water molecules in the forming cluster should be consistent with the condition of critical nucleus within the specific temperature interval [11]. Naturally, in this case the aggregates are primarily replenished by the associates with maximum amount of bound wa- ter, and then by less hydrated molecules as temperature decreases. This means that cluster crystallization is implemented within quite a wide temperature range TC…Tg that is totally different to cluster crystallization, occurring at constant temperature T = Teut. The model of cluster particle formed of water molecules A and cryoprotective agent B without break in existing be- tween them H-bonds is presented in Fig. 2. Typical structure of the forming particles of cluster phase βc is schematically shown in Fig. 3. The forming 106 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 кие решетки практически невозможно. В резуль- тате такого несоответствия между эксперименталь- ными результатами и параметрами эвтектической кристаллизации возникает вопрос относительно природы второй твердой фазы в водных растворах криопротекторных веществ и особенностей ее отображения на диаграммах состояния. Как один из вариантов ответа на этот вопрос ранее была рассмотрена вероятность образования микрокристаллов as и bs без разрыва водородных связей в комплексах АnВm [10–12]. В частности, для кристаллов as такая возможность в процессе охлаждения криопротекторного раствора возни- кает при температурах T ≤ TC (рис. 1) [11, 12], когда критические зародыши кристаллов льда достига- ют таких размеров, при которых они могут образо- вываться вследствие соединения комплексов АnВm в кластеры без разрыва связей А–В. При этом необходимо, чтобы количество молекул воды, находящихся в образуемом кластере, соответство- вало условию для критического зародыша в конк- ретном температурном интервале [2]. Естествен- но, что в этом случае в агрегаты сначала перехо- дят комплексы с максимальным количеством связанной воды, а по мере понижения температуры менее гидратированные молекулы. Это означает, что кластерная кристаллизация реализуется в до- статочно широком диапазоне температур TC…Tg, что принципиально отличает ее от эвтектической кристаллизации, протекающей при постоянной температуре Т = Тeut. Модель кластерной частицы, образованной из молекул воды А и криопротек- торного вещества В без разрыва существующих между ними Н-связей, показана на рис. 2. Типичная структура образующихся частиц клас- терной фазы βc схематически показана на рис. 3. clusters are not crystal hydrates which possess a tight ratio of water molecules and cryoprotective agent as well as strictly regular distribution of spatial crystalline lattice. Furthermore, this approach admits the formation of cluster particles of two types: with amorphous (Fig. 3A) or crystalline (Fig. 3B) membranes of cryo- protective agent molecules. However, the principles of plotting such phase diagrams with cluster phase being the particles with stated structure require a careful analysis based on the regularities of geometric thermodynamics. To begin with, these diagrams must meet the main conditions resulting from Gibbs phase rule [11]. The first condition is the variance of system (the number of its degree of freedom) f at constant pressure: f = q – r + 1, (1) where q is the number of components, r – number of equilibrium phases. The second condition is the dimensionality of boundaries between the phases in equilibrium: Rb = Rd – Φ+ – Φ–, (2) where Rb is the dimensionality of the boundary; Rd is the dimensionality of diagram; Φ+ and Φ– are the Рис. 1. Фрагмент диаграммы состояния, включающей область существования кластерной фазы βС и соответ- ствующей условию ТС – > Tg, где ТС – – линия ликвидуса фазы βС при охлаждении раствора. Fig. 1. Fragment of diagram of state which includes the areas of cluster phase, βС, existence and meeting the condition ТС – > Tg, where ТС – is the liquidus line of phase βС during cooling the solution. Рис. 2. Модель поперечного сечения кластера, образованного из 28 комплексов AnB и содержащего 150 молекул воды A в составе микрокристалла льда аs. Не заштрихованы связанные молекулы воды, лежащие вне плоскости сечения. Fig. 2. Model of cross-section of a cluster formed of 28 AnB complexes and containing 150 water molecules A as a component of ice microcrystals as. Bound water mole- cules being beyond section plane are unshaded. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 107 Образующиеся кластеры не являются кристалло- гидратами, которые характеризуются заданным соотношением молекул воды и криопротекторного вещества, а также их строго регулярным располо- жением в пространственной кристаллической решетке. Более того, данный подход допускает об- разование кластерных частиц двух типов: с аморф- ной (рис. 3, A) или кристаллической (рис. 3, B) оболочками из молекул криопротекторного ве- щества. Однако принципы построения диаграмм состояния, содержащих кластерную фазу в виде частиц с такой структурой, требует очень тщатель- ного анализа на основе закономерностей геомет- рической термодинамики. В первую очередь, такие диаграммы должны удовлетворять основным условиям, вытекающим из правила фаз Гиббса [2]. Первое условие – вариантность системы (число ее степеней свободы) f при постоянном давлении: f = q – r + 1, (1) где q – число компонентов, r – число равновесных фаз. Второе условие – размерность границ между находящимися в равновесии фазами: Rb = Rd – Φ+ – Φ–, (2) где Rb – размерность границы; Rd – размерность диаграммы; Ф+ и Ф– – число образующихся и ис- чезающих фаз при переходе через межфазную гра- ницу соответственно. Анализ показывает, что фрагмент такой диаг- раммы может иметь вид, представленный на рис. 1. Данная диаграмма описывает следующие особен- ности кластерной кристаллизации: – кластеры βc образуются в широком диапазоне температур TC0…Tg, а не при Т = Тeut = const, как этого требует эвтектическая кристаллизация; – существуют концентрационные интервалы СВ > CC0, в которых не образуются отдельные кристаллы льда или криопротекторного вещества, что обязательно в диаграммах эвтектического типа вдоль всей оси концентраций СВ; – структура кластеров принципиально отличает- ся от структуры кристаллогидратов, для которых характерны регулярные кристаллические решетки из молекул А и В; – при исходных концентрациях водного раствора СВ < Сg кластер состоит из кристаллического ядра as, окруженного молекулами В, создающими меж- фазную границу, которая может находиться как в аморфном, так и в кристаллическом состоянии; number of forming and disappearing phases when tran- siting interphase boundary, respectively. The analysis shows the appearance of fragment of such diagram as in Fig. 1. The presented diagram could describe the following peculiarities of cluster crystal- lization: – clusters βc are formed within the wide tempe- rature range TC0…Tg rather than T = Teut = const as is required during eutectic crystallization; – there are the concentration ranges CB>CC0 wherein no single crystals of ice or cryoprotective agent are formed, that is mandatory in eutectic diag- rams along the whole axis of concentrations CB; – structure of the cluster principally differs from the structure of crystal hydrates with regular lattices of molecules A and B; – in case of initial concentrations CB < Cg the cluster consists of crystalline nucleus as surrounded by mole- cules B creating interphase boundary which may be both in amorphous and crystal state; – temperature decrease is accompanied with changes in cluster phase composition changes, as less and less hydrated molecules start to take part in cluster formation, so the ratio of molecules A and B is not constant. The last peculiarity of cluster crystallization eli- minates apparent disconformity with the condition of variance (l) which could be found in diagram shown in Fig. 1. According to this condition a three-phase binary system is non-variant. Its geometric appearance in diagram of state consists of three superposed figurative points on horizontal line T = T(CB) = const correspon- ding to composition of phases being at this temperature in equilibrium with each other. Typical example of this non-variant system is an eutectic horizontal Teut = const describing the equilibrium of phases As, Bs and L. While Рис. 3. Схематическое изображение кластерных час- тиц, включающих ядра из микрокристаллов льда as и оболочки из молекул криопротекторного вещества, находящиеся в аморфном bg (A) и кристаллическом bs (B) состояниях. Fig. 3. Schematic image of cluster particles including the nuclei of ice microcrystals as and cover of cryoprotective substance molecules being in amorphous bg (A) and crystalline bs (B) states. A B 108 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 – с понижением температуры изменяется сос- тав кластерной фазы, так как в образовании класте- ров принимают участие все менее гидратирован- ные молекулы, и соотношение молекул А и В в кластере не является постоянным. Последняя особенность кластерной кристал- лизации устраняет кажущееся несоответствие условию вариантности (1), представленной на рис. 1 диаграммы. Согласно этому условию, трех- фазная бинарная система нонвариантна. Ее гео- метрический образ на диаграмме состояний – три сопряженные фигуративные точки на горизонталь- ной линии Т = Т(СВ) = const, которые соответствуют составу фаз, находящихся при данной температуре в равновесии друг с другом. Типичным примером такой нонвариантной системы является эвтекти- ческая горизонталь Тeut = const, описывающая рав- новесие фаз As, Bs и L. Поскольку составы этих фаз строго определены, то их равновесие не может больше реализоваться ни при какой другой темпе- ратуре. Принципиально иная ситуация наблюдается в случае кластерной кристаллизации. Ее начало при охлаждении раствора описывает горизонталь ТC0 = const (см. рис. 1). Здесь точка ω соответствует крис- таллической фазе Аs, точка λC0 представляет собой слившиеся фигуративные точки жидкой L и клас- терной βc фаз, состав которых определяется кон- центрацией СC0 и размером r0C критического заро- дыша льда при температуре ТC0. С дальнейшим понижением температуры, например от ТC0 до ТC1, размер критического зародыша льда внутри клас- терной частицы уменьшается от r0C до r1C. Это при- ведет к изменению соотношения числа молекул А и В в кластерных частицах, т. е. к вариациям соста- ва кластерной фазы. Поэтому при температуре ТC1 в равновесии с кристаллами льда Аs в точке λC1 будут находиться фазы L и βc другого состава, со- ответствующего концентрации СC1. Это отражено на рис. 1 равновесной горизонталью ТC1 = const. Аналогичные горизонтали ТC2 = const и TCg = Tg = const отражают трехфазные равновесные состоя- ния при дальнейшем понижении температуры. Таким образом, в отличие от эвтектической крис- таллизации, у системы с кластерной фазой появ- ляется дополнительная переменная – состав фазы βc, которая увеличивает число степеней свободы трехфазной бинарной системы. В результате равновесные состояния фаз Аs, L и βc в интервале температур ТC0… Tg соответствовуют линии λC0– λg (см. рис.1). Следует отметить, что составы фаз L и βc изменяются коррелированно, поэтому число степеней свободы в двухфазной системе L + βc удовлетворяет классическому условию (1) (см. рис.1). composition of these phase is strictly determined, their equilibrium could not be implemented at any other tem- perature. Principally different situation is observed in case of cluster crystallization. Its onset during cooling of solution is described by a horizontal TC0 = const (Fig. 1). Here the point ω corresponds to a crystal phase As, λC0 represents the superposed figurative points of liquid L and cluster βc phase, which composition is determined by concentration CC0 and size r0C of critical ice nucleus at temperature TC0. The following fall of temperature, e. g. TC0 down to TC1, is accompanied with a decrease of the size of critical ice nucleus inside the cluster particle from r0C down to r1C. This causes the change in ratio between A and B molecules number in cluster particles, i. e. variations in composition of cluster phase. Thus, at the temperature of TC1 the ice crystals As in the point λC1 would be in an equilibrium with the phases L and βc of another composition corresponding to concentration CC1. Fig. 1 represents this as a horizontal TC1 = const. Similar horizontals TC2 = const and TCg = Tg = const reflect three-phase equilibrium states during following temperature decrease. Thus, unlike eutectic crystalliza- tion a system with cluster phase has an additional variable, i. e. the composition of phase βc which increases the number of degrees of freedom in three- phase binary system. As a result the equilibrium states of phases As, L and βc within the temperature range TC0…Tg correspond to the curve λC0– λg (Fig. 1). It should be noted that compositions of phases L and βc change correlatively, so the number of degrees of freedom in two-phase system L + βc meets a classical condition (1) (see Fig. 1). 3. Description of cooling-heating processes for cryoprotective solutions with superposed state diagrams According to the experimental data [1, 2, 4, 12– 15], the second solid phase βc in cryoprotective solutions with an initial concentration CB < Cg in most cases is formed not during cooling of solution, but during its following heating from the temperature of amorphous fractions devitrification. This enables suggesting the phase βc to be formed in two stages. At the first stage the spatial associates of hydrated molecules of a cryo- protective agent appear in the solution during cooling, and the single fragments of them are involved into formation of the cluster phase particles at the second stage. In this case one should consider the fact of a decrease in the system entropy by ∆Sas as a result of associate formation and solution structurization. If the value ∆Sas is essential, the first phase implementation is only possible at low temperatures T < Tas, when Tas∆Sas summand meets the following condition: проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 109 3. Описание процессов охлаждения-ото- грева криопротекторных растворов совме- щенными диаграммами состояний Согласно экспериментальным данным [1, 3, 4, 6, 13–15] вторая твердая фаза βc в криопротек- торных растворах с исходной концентрацией CB < Cg в большинстве случаев образуется не при охлаждении раствора, а при его последующем ото- греве от температуры расстеклования аморфных фракций. Это позволяет предположить, что фаза βc образуется в два этапа. На первом этапе в ох- лаждаемом растворе возникают пространственные ассоциаты гидратированных молекул криопротек- торного вещества, из отдельных фрагментов кото- рых образуются частицы кластерной фазы на втором этапе. При этом необходимо учитывать, что в результате образования ассоциатов и струк- турирования раствора уменьшается энтропия сис- темы на ∆Sas. Если величина ∆Sas существенна, то реализация первого этапа возможна только при низких температурах T < Tas, когда слагаемое Tas∆Sas удовлетворяет следующему условию: ∆Gas = ∆Has – Tas∆Sas< 0, (3) где ∆Gas – изменение свободной энергии системы при образовании ассоциатов; Tas – температура начала процессов ассоциации при охлаждении раствора. Очевидно, что в растворах с Tas ≈ Tg реализация второго этапа при охлаждении маловероятна в силу резкого повышения вязкости жидких фракций в процессе стеклования. Однако при последующем нагреве выше Тg, по мере увеличения тепловой подвижности молекул в образовавшихся при ох- лаждении ассоциатах, сворачивание этих ассоциа- тов или их фрагментов в кластеры βc-фазы может происходить достаточно активно. Естественно, что в данной ситуации диаграммы состояния, описывающие охлаждение и последую- щий нагрев, раствора будут иметь разный вид. Так, например, типичный вид диаграммы, описывающей поведение охлаждаемых двухкомпонентных вод- ных растворов криопротекторных веществ с исход- ной концентрацией CB < Cg, показан на рис. 4. В то же время, если при последующем отогреве этих растворов в них протекает кластерная кристалли- зация, их фазовые состояния соответствуют диаг- рамме, представленной на рис. 1. Фактически нагрев предварительно охлажденного ниже темпе- ратуры Tg раствора сопровождается переходом от диаграммы, представленной на рис. 4, к диаграмме, приведенной на рис. 1. Анализ протекающих при этом процессов удобно проводить, наложив данные ∆Gas = ∆Has – Tas∆Sas< 0, (3) where ∆Gas is a change in the system free energy during formation of associates; Tas is the temperature of onset of association processes during cooling of the solution. It is evident that in the solutions with Tas ≈ Tg the implementation of the second stage during cooling is slightly probable due to a sharp increase in the viscosity of liquid fractions during vitrification. However, during subsequent heating above Tg, with a rise of thermal mobility of molecules in the associates, formed during cooling, the folding of these associates or their frag- ments into βc phase clusters may occur quite actively. Of course, the state diagrams describing the cooling and subsequent heating of the solution would appear differently in this situation. For example, Fig. 4 shows a typical appearance of diagram that describes the behaviour of cooled two-component aqueous solutions of cryoprotective agents with an initial concentration of CB < Cg. Meanwhile, if during the subsequent heating of these solutions the cluster crystallization occurs, their phase states correspond to the diagram shown in Fig. 1. Actually, the heating of the solution, previously cooled below temperature Tg is accompa- Рис. 4. Фрагмент диаграммы состояния, описывающей охлаждение криопротекторного раствора при условии ТС – ≈ Tg в интервале концентраций криопротекторного вещества С0…Cg –. Fig. 4. Fragment of diagram of state describing cooling of cryoprotective solution under the condition ТС – ≈ Tg within the range of cryoprotective substance concentration С0…Cg –. 110 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 диаграммы друг на друга, как это сделано на рис. 5. Рассмотрим фрагменты таких совмещен- ных диаграмм состояния в интервале концентраций C0...Cg + подробнее. Согласно представленной на рис. 5, A схеме, при охлаждении раствора с исход- ной концентрацией CB’ в нем при температуре TL1 – начинается образование кристаллов льда As, ко- торое заканчивается при достижении температуры стеклования Tg и концентрации Cg –. В случае последующего нагрева этого раствора с той же абсолютной скоростью изменения температуры ему будет соответствовать диаграмма состояния, построенная по точкам TL + и TC +, (рис. 5, A, пунк- тирные линии). Поэтому траектория отогрева раст- вора, изображенная в координатах T(CB), будет отклоняться от диаграммы TL – и приближаться к диаграмме TL +. Такая траектория для раствора CB’ изображена на рис. 5, A отдельными стрелками, направленными в сторону повышения температуры, и отмечена цифрой 1. Согласно этой траектории в интервале температур Tg...TC + в растворе будут формироваться и затем плавиться частицы клас- терной фазы βc. Образование максимального коли- чества кластерной фазы βc при этом соответствует отклонению концентрации жидкой фазы от значения Cg – на ∆C’B. Это отклонение вызывает соответ- ствующие объемные ∆V’ac и тепловые Q’ac эффек- ты, которые отражаются на экспериментально получаемых дилато- или термограммах [1, 4 ,11, 13–15]. Фактически отогрев такого раствора при- водит к появлению трехфазной системы (As+L+βc) +, область существования которой на диаграммах на рис. 5 отмечена штриховкой. При прохождении через эту область отогреваемого раствора с началь- ной концентрацией CB < Cg – в нем может образовы- ваться не только кластерная фаза, но и дополни- тельная масса кристаллов льда Аs. Такое явление может возникать при условии −T& >> +T& и его ве- роятность существенно повышается при длитель- ных временных остановках в области температур Tg...TC +. Соответствующие этому процессу эф- фекты описали ранее V.L. Bronsteyn и P.L. Stepon- kus [7]. В свою очередь охлаждение раствора с началь- ной концентрации CB’’, (рис. 5, B) приводит к его полному стеклованию при температуре Tg без ка- ких-либо промежуточных фазовых переходов. Последующему нагреву этого раствора соответ- ствует траектория 2, согласно которой в нем проис- ходит кластерная кристаллизация, сопровождаю- щаяся максимальным отклонением концентрации раствора от исходного значения CB’’ на ∆CB’’. Температура, при которой фиксируется это откло- нение, соответствует максимуму экзотермических nied by the transition from the diagram shown in Fig. 4 to the one presented in Fig. 1. It is convenient to analyse the processes proceeding at that by fitting these diagrams, as in Fig. 5. Let us consider in details the fragments of such superposed diagrams of state within the concentration range of C0...Cg +. According to the diagram presented in Fig. 5A, cooling the solution with an initial concentration CB’ is accompanied with the formation of ice crystals As starting from the tempe- rature of TL1 – , and finishing upon reaching the vitrifi- cation temperature Tg and concentration Cg –. In case of following heating of this solution with the same absolute rate of temperature changes it will conform the diagram of state built through the points TL + and TC + (Fig. 5A, dashed lines). So the curve of the solution heating, shown in T vs. CB coordinates, will deviate from the diagram TL – and approach the TL + one. Such a curve for CB’ solution is represented in Fig. 5A with separate arrows pointing toward the temperature rise and marked with number 1. According to this path, within the temperature range of Tg ... TC + the particles of cluster phase βc will be formed in the solution and then melt. The formation of the maximum number of cluster phase βc corresponds herein to the deviation of liquid phase concentration from the value Cg – by ∆C’B. This deviation causes the corresponding volu- metric ∆V’ac and thermal Q’ac effects, which are reflected in experimentally obtained dilato- or thermograms [2, 9, 12–15]. In fact, the heating of such solution leads to occurence of a three-phase system (As+L+βc) +, the area of existence of which is shaded in diagrams shown in Fig. 5. When the solution with an initial concentration CB < Cg – being heated passes through this area not only a cluster phase in its volume forms, but an additional mass of ice crystals As too. Such a phenomenon may occur under condition −T& >> +T& and its probability is significantly increased under longer time lags within temperature range of Tg ... TC +. The effects corresponding to this process were described by Bronsteyn and Steponkus [5]. In its turn cooling the solution with an initial concentration of CB’’ (Fig. 5B) leads to its full vitrification at the temperature Tg without any inter- mediate phase transitions. The curve 2 corresponds to a subsequent heating of this solution, according to which there occurs a cluster crystallization, accompanied by the maximum deviation of solution concentration from the initial value CB’’ by ∆CB’’. The temperature of this deviation corresponds to either the maximum of exothermic heat peaks in thermograms of the studied solutions or the maximum volumetric effects ∆Vac’’ in the dependences of heated solution vs. temperature. With further increase in initial solution concentration the amount of newly formed cluster phase and hence проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 111 тепловых пиков на термограммах исследуемых растворов или максимальным объемным эффек- там ∆Vac’’ на зависимостях объема нагреваемых растворов от температуры. При дальнейшем увеличении концентрации исходного раствора количество вновь образую- щейся кластерной фазы, а значит, и величина соот- ветствующих объемных или тепловых эффектов начинают резко уменьшаться и становятся рав- the value of corresponding volumetric or thermal effects begin to decrease sharply and become equal to zero at CB ≥ Cg +. In the Fig. 5C the curve 3 demon- strates it well by describing the behaviour of the solution with concentration CB’’’. It should be noted that exactly this behaviour of thermal peaks in the thermograms is observed expe- rimentally when the initial concentration of the solutions approaches the imaginary eutectic concentration Рис. 5. Фрагменты наложенных друг на друга диаграмм состояния, описывающих охлаждение (сплошные кривые) и нагрев (пунктирные кривые) водного раствора криопротекторного вещества В с исходной концентрацией CB’ < Cg – (A), CB’’’ > Cg – (B) и CB’’’’ ≈ Cg + (C). Диаграммы соответствуют равенству скоростей охлаж- дения и нагрева, а также условию ТС – ≈ Tg. Линия ТС + определяет линию ликвидуса фазы βС при отогреве раствора от температуры Tg. Fig. 5. Fragments of superposed diagrams of state de- scribing cooling (solid curves) and heating (dotted curves) of aqueous solution of cryoprotective substance B with ini- tial concentration of CB’ < Cg – (A), CB’’’ > Cg – (B) и CB’’’’ ≈ Cg + (C). The diagrams are plotted considering the equality of cool- ing and heating rates, as well as the condition ТС – ≈ Tg. Curve ТС + denotes the liquidus line for βС phase during heating of the solution from the Tg temperature. A B C 112 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 ными нулю при CB ≥ Cg +. На схеме рис. 5, С это на- глядно демонстрирует траектория 3, описывающая поведение раствора с концентрацией CB’’’. Следует особо отметить, что именно такое пове- дение тепловых пиков на термограммах экспери- ментально наблюдается при приближении исходной концентрации растворов к мнимой эвтектической концентрации Ceut’ ≈ Cg [1, 4, 13–15] и находится в полном противоречии с диаграммами состояний эвтектического типа. Это полностью соответст- вует закономерностям кластерной кристаллизации, поскольку с увеличением концентрации СВ в раст- воре уменьшается количество гидратированных молекул В, способных участвовать в образовании частиц кластерной фазы. Необходимо уточнить, что на схемах рис. 5 интервалы изменений концентрации жидкой фазы при кластерной кристаллизации на ∆CB’, ∆CB’’ и ∆CB’’’ отмечены условно (для большей нагляднос- ти). В связи с тем, что при образовании кластерных частиц из раствора выбывают как молекулы воды, так и молекулы криопротекторного вещества, концентрация остающейся жидкой фракции может изменяться при этом незначительно. 4. Анализ равновесных состояний заморо- женных криопротекторных растворов Современные технологии криоконсервирования биообъектов используют относительно высокие скорости охлаждения, при которых структура замо- раживаемых жидких фракций (в том числе крио- протекторных растворов), как правило, является метастабильной. Поскольку практическая крио- биология работает именно с такими неравновес- ными состояниями, их изучение является целью большинства работ в области структурного ана- лиза замораживаемых криопротекторных раство- ров [5–7]. Однако анализ возможных равновесных состояний этих растворов также необходим, при- чем не только с теоретической точки зрения. Его важность определяется тем обстоятельством, что при длительном хранении биообъектов ниже темпе- ратур стеклования криопротекторных растворов в их структуре неизбежно протекают процессы, на- правленные на достижение равновесия [9]. Такие структурные перестройки могут инициировать механизмы повреждения длительно хранящегося биоматериала. Ингибировать эти механизмы не- возможно без определенных представлений о при- роде равновесных структурных состояний, которые можно получить, основываясь только на равновес- ных диаграммах состояния. В разделе 2 статьи указаны причины, по которым для замораживае- мых криопротекторных растворов нельзя исполь- зовать эвтектические диаграммы. Одной из них Ceut’ ≈ Cg [2, 12–15] and fully contradicts the state diagrams of an eutectic type. This is completely consistent with the regularities of cluster crystallization, since with increasing the concentration CB in the solution the number of hydrated molecules B, being capable to participate in forming cluster phase particles is decreased. It should be specified that Fig. 5 shows only con- ditionally marked intervals of changes in liquid phase concentration during cluster crystallization by ∆CB’, ∆CB’’ and ∆CB’’’ (for better visuability). Due to the fact that both water molecules and those of cryopro- tective agent are leaving the solution during cluster particles formation, the concentration of the remaining liquid fraction thereby may vary insignificantly. 4. Analysis of equilibrium states of frozen cryoprotective solutions Current techniques for biological object cryopreser- vation apply relatively high cooling rates, when the structure of frozen liquid fractions (including the cryo- protective solutions) is usually metastable. Since ap- plied cryobiology deals exactly with these non- equilibrium states, their study is the aim of most resear- ches in the field of structural analysis of frozen cryo- protective solutions [3–5]. However, it is also essential to analyse the possible equilibrium states of these solutions, and this would be not only of theoretical value. Its importance is determined by the fact that during a long-term storage of biological objects at the temperatures below vitrification points of cryoprotecti- ve solutions, the processes targeted to achieve equilib- rium occur in their structure inevitably [7]. Such a structural re-arrangements could initiate the mecha- nisms of injury in long-term stored biospecimens. It is impossible to prevent these mechanisms without certain hypotheses about the origin of equilibrium structural states, which could be obtained only basing on the equilibrium phase diagrams. The section 2 of this paper contains the reasons, restricting the use of eutectic diagrams for frozen cryoprotective solutions. One of them is a need to break H-bonds between water mole- cules and a cryoprotective agent. Without meeting this requirement it is impossible to form the equilibrium structures of eutectic type. At the same time, the diag- rams of state which consider cluster phase allow to simulate the equilibrium structures without meeting this condition. Fig. 6 shows a complete phase diagram of two- component cryoprotective solution, including cluster phase βca based on the ice nanocrystals as and the one βcb based on nanocrystals of cryoprotective agents bs. According to this plot, there is some temperature Tβ when the values of critical nuclei as o and bs o are so small that an entire liquid phase of concentration Cβ is проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 113 является необходимость разрыва Н-связей между молекулами воды и криопротекторного вещества. Без выполнения этого требования невозможно сформировать равновесные структуры эвтекти- ческого типа. В то же время диаграммы состояния, включающие кластерную фазу, позволяют смоде- лировать равновесные структуры без выполнения этого условия. На рис. 6 показана полная диаграмма состояния двухкомпонентного криопротекторного раствора, включающая кластерные фазы βca на основе нанокристаллов льда as и βcb на основе нанокрис- таллов криопротекторного вещества bs. Согласно представленной диаграмме существует некоторая температура Tβ, при которой величины критических зародышей as o и bs o малы настолько, что вся жид- кая фаза концентрации Cβ способна перейти в твер- дофазную смесь кластеров βca и βcb. В этом случае структура раствора при T < Tβ зависит от его ис- ходной концентрации. В диапазоне исходных кон- центраций C0…CCA замороженный раствор состоит из двух равновесных фаз As и βca, в диапазоне исходных концентрaций CCA…Cβ и Cβ…CCB из одной кластерной фазы βca или βcb, соответственно, а в диапазоне концентраций CCB…C1 опять из двух фаз Вs и βcb. Точка γ на данной диаграмме соот- ветствует равновесию трех фаз L, βca и βcb. Все представленные на диаграмме структурные ком- позиции не содержат аморфную фракцию и пол- ностью удовлетворяют условиям (1) и (2), т. е. являются равновесными. Однако такие равно- весные состояния могут достигаться при охлажде- нии только в случае выполнения условия Tg < Tβ. Если же выполняется условие Tg > Tβ, которое, как правило, реализуется на практике, их достижению препятствует стеклование жидких фракций, остаю- щихся в системе к моменту достижения темпе- ратуры стеклования Tg. Это условие схематически изображено на диаграмме рис. 6 двойной линией с внутренней штриховкой. В этом случае при T < Tg структурные композиции во всем интервале кон- центраций C0…C1 будут содержать аморфные фракции G, т. е. являться метастабильными. Более того, в данном случае на диаграмме состояний обязательно существует интервал исходных кон- центраций CgA...CgB, в котором охлажденный раст- вор полностью стеклуется независимо от скорости его охлаждения. Скорость охлаждения здесь влияет только на ширину этого интервала. Из пред- ставленной на рис. 6 схемы можно сделать сле- дующие выводы: – метастабильность возникающих в криопро- текторных растворах структур в большей степени связана не со скоростью их охлаждения, а с соот- ношением температур Tg и Tβ; capable of transforming into a solid phase mixture of βca and βcb clusters. In this case, the structure of the solution at T < Tβ depends on its initial concentration. Within the range of initial concentrations C0…CCA a frozen solution consists of two equilibrium phases As and βca, within the range of initial concentrations CCA…Cβ and Cβ…CCB it contains only one cluster phase βca or βcb, respectively, and within the concentra- tion range of CCB…C1 it comprises again two phases BS and βcb. The point γ in this diagram corresponds to the equilibrium of three phases L, βca and βcb. All the structural compositions presented in the diagram comprise no amorphous fraction and completely meet the conditions (1) and (2), i. e. they are in equilibrium. However, such equilibrium states can be achieved du- ring cooling only if meeting the condition Tg < Tβ. If another case is realized, i. e. Tg > Tβ, that is usually observed in practice, achievement of the equilibrium is prevented by vitrification of liquid fractions remaining Рис. 6. Полная диаграмма состояния двухкомпонент- ного криопротекторного раствора, соответствующая условиям ТСА – = ТСА + и ТСВ – = ТСВ +, где ТСА и ТСВ – линии ликвидуса кластерных фаз на основе микрокристаллов льда as и криопротекторного вещества bs соответст- венно. Линия Тβ на диаграмме обозначает линию солидуса кластерных фаз βСА и βСВ. Fig. 6. Complete diagram of state of two-component solution forТСА – = ТСА + and ТСВ – = ТСВ +, where ТСА and ТСВ are liquidus lines of cluster phases based on microcrystals of ice as and cryoprotective substance bs, correspondingly. Line Тβ in the diagram denotes the solidus line of cluster phases βСА and βСВ. 114 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 – достижение равновесных структурных сос- тояний в этих растворах, охлажденных ниже темпе- ратуры Tβ, состоит в трансформации аморфных фракций G в кластерные фазы βca и βcb (показано стрелками, направленными в равновесную зону, условно отмеченную на диаграмме двойной штри- ховкой). Приведенная на рис. 6 температура стеклования раствора Tg удовлетворяет условию: TCB < Tg < TCA. (4) Очевидно, что в этом случае в диапазоне тем- ператур Tg...Tβ не будет происходить образование кластеров на основе микрокристаллов криопро- текторного вещества непосредственно из жидкой фазы L. При выполнении условия (4) области равновесия фаз βcb + L и Bs + L + βcb на диаграмме состояний будут отсутствовать. Однако это не иск- лючает протекание процессов G → βcb в охлажден- ных ниже температуры Tβ растворах в области исходных концентраций CB > Cβ (показано соответ- ствующей стрелкой на рис. 6). 5. Заключение Рассмотренная модель кластерной кристалли- зации впервые объясняет образование второй твердой фазы в охлаждаемых криопротекторных растворах, без использования диаграмм эвтекти- ческого типа. При этом устраняется целый ряд противоречий, возникающих при попытках объяс- нить экспериментальные результаты, полученные при изучении кинетики кристаллизации и плавления растворов, в рамках классических эвтектических закономерностей. Это обусловлено особенностями структуры частиц кластерной фазы. Их образо- вание не требует разрыва Н-связей между молеку- лами воды и криопротекторного вещества, что обеспечивает протекание кластерной кристалли- зации в очень широком температурном диапазоне, вплоть до температур стеклования Tg. Кластеры могут содержать как кристаллические, так и аморфные фрагменты, что допускает их образо- вание в водных растворах некристаллизующихся криопротекторов. Также модель двухэтапного об- разования кластеров позволяет объяснить несовпа- дения диаграмм состояния, описывающих охлаж- дение и последующий отогрев замораживаемых растворов при равенстве абсолютных значений ско- ростей охлаждения и нагрева. Такое несовпадение противоречит классическим условиям образова- ния эвтектик. Представленные в работе диаграммы состоя- ния, включающие области существования кластер- in the system to the moment of reaching vitrification temperature Tg. This condition is shown schematically in Fig. 6 by double line with internal shading. In this case all the structural compositions at T < Tg within the whole range of concentrations C0…C1 would contain amorphous fraction G, i.e. these would be met- astable. Moreover, in this case a diagram of state would definitely contain a range of initial concentrations CgA...CgB, wherein the cooled solution would completely vitrify independently on the rate of its cooling. Cooling rate affects here only the width of this range. Proceed- ing from the scheme presented in Fig. 6 the following conclusions could be made: – the metastability of the structures occurred in cryoprotective solutions is associated with the ratio of Tg and Tβ temperatures rather than with the rate of their cooling; – achieving the equilibrium structural states in these solutions cooled below temperature Tβ, consists in transforming the amorphous fractions G into cluster phases βca and βcb (shown by arrows pointing to equi- librium zone, conventionally marked with double sha- ding in the diagram). The temperature of vitrification Tg of the solution shown in Fig. 6 meets the condition: TCB < Tg < TCA. (4) Obviously, in this case no formation of clusters based on microcrystals of cryoprotective agent directly from a liquid phase L will occur within the temperature range of Tg...Tβ. When meeting the condition (4) no areas of equilibrium phases βcb + L and Bs + L + βcb would be present in state diagrams. However, this does not exclude the occurence of G → βcb processes in the solutions cooled below Tβ temperature within the range of initial concentrations CB > Cβ (shown by correspon- ding arrow in Fig. 6). 5. Conclusion For the first time the presented model of cluster crystallization explains the formation of the second solid phase in cooled cryoprotective solutions without using the eutectic type diagrams. This eliminates a number of contradictions arising when trying to explain the experimental results obtained when studying the kinetics of solution crystallization and melting within the framework of standard eutectic regularities. This is stipulated by the structure peculiarities of cluster phase particles. Their formation requires no rupture of H-bonds between water and cryoprotective agent molecules, that allows cluster crystallization within a very wide temperature range including the temperature of vitrification Tg. Clusters may contain both crystalline проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 115 and amorphous fragments that allows their formation in aqueous solutions of non-crystallizing cryoprotec- tants. The model of a two-stage cluster formation enables also to explain the discrepancy between diagrams of state describing the cooling and subsequent heating of frozen solutions in case of equal absolute values of cooling and heating rates. Such a discrepancy could not exist according to the classic conditions for formation of eutectics. State diagrams represented here, include the areas of cluster phase existence, and admit the presence of the second solid phase on the background of liquid or amorphous fraction, that is observed experimentally and could not be explained using the classic approaches. This fact underlines the difference between the cluster and eutectic crystallizations. In the latter case, if Tg < Teut no formation of amorphous fractions is possible and if Tg > Teut no second solid phase could appear in the system. Moreover, the state diagrams which consider the areas of cluster phase existence enable to hypothesize the equilibrium structures of frozen cryoprotective solutions and to predict the nature of the processes targeted to form these structures in cryopreserved biosystems. In particular, according to these diagrams, the metastable states appearing in frozen solutions are associated with the condition Tg > Tβ originated from the solution nature rather than with high rates of their cooling. In this case, the varying of cooling rates could affect only the amount of resulting amorphous fraction. The analysis of crystallization-melting kinetics in cryoprotective solutions, performed on the basis of state diagrams, which include cluster phase, shows the neces- sity to classify the cryoprotective solutions applied in cryobiology by the parameters of their cluster crystal- lization. Of particular attention is the question of relationship of these parameters with the mechanisms of biological objects injury, stipulated by cluster crys- tallization. Detailed study of these mechanisms acting near vitrification temperatures would improve the efficiency of efforts in developing and optimizing tech- nologies to cryopreserve biological specimens. ной фазы, допускают наличие второй твердой фазы на фоне жидких или аморфных фракций, что наблюдается экспериментально и не могло быть объяснено с классической точки зрения. Этот факт подчеркивает различие между кластерной и эвтек- тической кристаллизациями. В последнем случае при условии Tg < Тeut невозможно образование аморфных фракций, а при Tg > Тeut – образование второй твердой фазы в системе. Кроме того, диаграммы состояния, включаю- щие области существования кластерной фазы, позволяют сформулировать представления о рав- новесных структурах замороженных криопротек- торных растворов и предсказать природу процес- сов, направленных на достижение этих структур в криоконсервируемых биосистемах. В частности, согласно этим диаграммам, возникающие в за- мораживаемых растворах метастабильные сос- тояния связаны не с высокими скоростями их охлаждения, а с условием Tg > Tβ, определяемым природой раствора. В данном случае вариациями скоростей охлаждения можно только изменять ко- личество образующейся аморфной фракции. Анализ кинетики кристаллизации-плавления криопротекторных растворов, проведенный на ос- нове диаграмм состояния, включающих кластер- ную фазу, показывает необходимость классифика- ции используемых в криобиологии криопротектор- ных растворов по параметрам их кластерной крис- таллизации. Особого внимания заслуживает вопрос о связи этих параметров с механизмами повреж- дения биообъектов, обусловленных кластерной кристаллизацией. Детальное изучение этих меха- низмов, действующих вблизи температур стекло- вания, позволит повысить эффективность работ по созданию и оптимизации технологий криоконсер- вирования биообъектов. Литература 1. Зинченко А.В., Манк В.В., Моисеев В.А. и др. О фазовых переходах и физических состояниях системы вода- прoпандиол // Доклады АН СССР. – 1983. – Т. 269, №1. – С. 144–146. 2. Физическое металловедение / Под ред. Р. Кана. – М.: Мир, 1968. – Т. 2. – 490 с. 3. Bevan O.J., Goates R.J. Lamb J.D. Solid-liquid phase equilibria in water + ethylene glycol // J. Chem. Thermodynamics. – 1972. – Vol. 4, №1.– P. 123–126. 4. Bohon R.G., Conway W.T. DTA studies of the glycerol-water system // Thermochim. Acta. – 1972. – Vol. 4, №3–5. – P. 321–341. 5. Boutron P., Kaufmann A. Metastable states in the system water- ethanol. Existence of a second hydrate, curious properties // J. Chem. Phys. – 1978. – Vol. 68, №11. – P. 5032–5041. 6. Boutron P., Kaufmann A. Stability of the amorphous state in the system water-1,2 propanediol // Cryobiology. – 1979. – Vol. 16, №6. – P. 557–568. References 1. Bevan O.J., Goates R.J. Lamb J.D. Solid-liquid phase equilibria in water + ethylene glycol. J Chem Thermodynamics 1972; 4(1): 123–126. 2. Bohon R.G., Conway W.T. DTA studies of the glycerol-water system. Thermochim Acta 1972; 4(3–5): 321–341. 3. Boutron P., Kaufmann A. Metastable states in the system water– ethanol. Existence of a second hydrate, curious properties. J Chem Phys 1978; 68(11): 5032–5041. 4. Boutron P., Kaufmann A. Stability of the amorphous state in the system water-1,2-propanediol. Cryobiology 1979; 16(6): 557– 568. 116 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 7. Bronsteyn V.L., Steponkus P.L. Nucleation and growth of ice crystals in concentrated solutions of ethylene glycol // Cryobiology. – 1995. – Vol. 32, №1. – P. 1–22. 8. Cocks F.H., Brower W.E. Phase diagram relationships in cryobiology // Cryobiology. – 1974. – Vol. 1, №4. – P. 340– 358. 9. Fuller B.I., Lane N.A., Benson E.E. Life in the frozen state. – Boca Raton, FL: CRC Press, 2004. – 672 p. 10.Malsam J., Aksan A. Hydrogen bonding and kinetics/thermo- dynamics transition of aqeous trehаlose solutions at cryogenic temperature // J. Phys. Chem. B. – 2009. – Vol. 113, №19. – P. 6792–6799. 11.Osetsky A.I. Peculiarities of state diagrams of aqueous solu- tions of cryoprotective agents // Cryobiology. – 2009. – Vol. 59, №2. – P. 141–149. 12. Osetsky A.I. Thermodynamic aspects of cluster crystallization in cryoprotective solution // CryoLetters. – 2011. – Vol. 32, №3. – P. 216–224. 13.Rasmussen D.H., MacKenzie A.P. Phase diagram for the system water-dimethylsulfoxide // Nature. – 1968. – Vol. 220, №5174. – P. 1315–1317. 14.Rasmussen D.H., Luyet B.J. Complementary study of some non-equlibrium phase transition in frozen solutions of glycerol, ethylene glycol, glycose and sucrose // Biodynamica. – 1969. – Vol. 10, №220. – P. 319–331. 15.Zinchenko A.V., Zinchenko V.D. On phase transitions in the water-ethylene glycol system at zubzero temperatures under nonisothermal conditions // CryoLetters. – 2001. – Vol. 22, №3. – P. 191–198. 5. Bronsteyn V.L., Steponkus P.L. Nucleation and growth of ice crystals in concentrated solutions of ethylene glycol. Cryo- biology 1995; 32(1): 1–22. 6. Cocks F.H., Brower W.E. Phase diagram relationships in cryobiology. Cryobiology 1974; 1(4): 340–358. 7. Fuller B.I., Lane N.A., Benson E.E. Life in the frozen state. Boca Raton: CRC Press, 2004. 8. Khan R.W., editor. Physical metallurgy. Amsterdam; 1965. 9. Malsam J., Aksan A. Hydrogen bonding and kinetics/thermo- dynamics transition of aqueous trehаlose solutions at cryoge- nic temperature. J Phys Chem B 2009; 113(19): 6792–6799. 10.Osetsky A.I. Peculiarities of state diagrams of aqueous solu- tions of cryoprotective agents. Cryobiology 2009; 59(2): 141– 149. 11.Osetsky A.I. Thermodynamic aspects of cluster crystallization in cryoprotective solution. CryoLetters 2011; 32(3): 216–224. 12.Rasmussen D.H., Luyet B.J. Complementary study of some non-equlibrium phase transition in frozen solutions of glycerol, ethylene glycol, glycose and sucrose. Biodynamica 1969; 10(220): 319–331. 13.Rasmussen D.H., MacKenzie A.P. Phase diagram for the system water-dimethylsulfoxide. Nature 1968; 220(174): 1315– 1317. 14.Zinchenko A.V., Mank V.V., Moiseyev V.А. et al. About phase transitions and physical sates of water-propanediol system. Proceedings of Academy of Sciences of SU 1983; 269(1): 144–146. 15. Zinchenko A.V., Zinchenko V.D. On phase transitions in the water-ethylene glycol system at zubzero temperatures under nonisothermal conditions. CryoLetters 2001; 22(3): 191–198. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 24, №/issue 2, 2014 117

К теории диаграмм состояния криопротекторных растворов

Репозитарії

Схожі ресурси