Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly

Із олії насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) одержано речовину, яка відповідає сапогенінам за фізико-хімічними властивостями, а саме: ліпофільність, розчинність у водному етанолі, інтенсивне піноутворення, позитивна реакція Лібермана- Бурхарда, гемолітична дія, відсутність вуглеводів і фосфору...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2011
Автори:	Луцик, М., Бойко, Н., Луцик, М. (мол.), Стойка, Р.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Західний науковий центр НАН України і МОН України 2011
Назва видання:	Праці наукового товариства ім. Шевченка
Теми:	Матеріяли
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/75051
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly / М. Луцик, Н. Бойко, М. Луцик (мол.), Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2011. — Т. XXVIII: Хемія і біохемія. — С. 150-159. — Бібліогр.: 16 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-75051
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-750512015-01-26T03:02:53Z Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly Луцик, М. Бойко, Н. Луцик, М. (мол.) Стойка, Р. Матеріяли Із олії насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) одержано речовину, яка відповідає сапогенінам за фізико-хімічними властивостями, а саме: ліпофільність, розчинність у водному етанолі, інтенсивне піноутворення, позитивна реакція Лібермана- Бурхарда, гемолітична дія, відсутність вуглеводів і фосфору (фосфоліпідів). Молекулярна маса основного компонента у препаратах за даними мас-спектрометрії становить 656 Da. Речовина нетоксична, при внутрішньочеревному введенні мишам у дозі 300 мг/кг не викликала загибелі тварин. В експериментах іn vivo досліджено вплив речовини на ріст асцитної форми лімфоми NK/Ly мишей і цитоморфологію пухлинних клітин. При щоденному введенні речовини по 1 мг впродовж 10 днів, починаючи із наступного дня після інокуляції пухлинних клітин, відзначено затримку росту асциту і достовірне зменшення кількості пухлинних клітин у ньому. За даними цитоморфологічного аналізу речовина викликала значне ушкодження пухлинних клітин і достовірне підвищення зв’язування лектинів сочевиці й арахісу. При введенні речовини з інтервалом що 48 годин, а також при пізньому введенні (через 7 діб після інокуляції) вплив на ріст пухлини був слабо виражений, однак ушкодження клітин і зв’язування лектинів сочевиці й арахісу було достовірно вищим, ніж у контролі. Результати свідчать про слабо виражену протипухлинну дію сапогеніну насіння чистотілу і недоцільність його використання як самостійного хіміопрепарата. Обговорено можливість його застосування як ад’юванта в комплексі з активними протипухлинними препаратами. Ключові слова: чистотіл, сапогеніни, протипухлинна активність, лімфома NK/Ly. A substance that corresponds sapogenins according to their physico-chemical characteristics (lipophilicity, solubility in ethanol-water mixture, intensive foaming, positive Lieberman-Burchard reaction, hemolytic activity, negative tests for sugars, and phosphorus (phospholipids)) was obtained from seeds oil of Greater celandine (Chelidonium majus L.). Molecular mass of principal component of that substance according to mass-spectrometry analysis equaled 656 Da. Substance was non-toxic, and its intra-abdominal injection in dose 300 mg/kg did not cause animal death. The effect of studied substance upon growth of the ascitic form of mouse lymphoma NK/Ly and cytomorphology of tumor cells was studied in the in vivo experiments. Everyday injection of 1 mg of substance per mouse during 10 days beginning from the next day after inoculation of tumor cells led to a retardation of ascite growth and significant decrease of cell number. Cytomorphological analysis showed a marked deterioration of tumor cells and significant increase in cellular binding of lentil and peanut lectins. During the injections of substance every 48 hours or in case of late beginning (7 days after inoculation), the effect upon tumor growth was negligible, but cell damage and binding of lentil and peanut lectins were significantly higher then in control. The obtained results indicate a weak anti-tumor activity of sapogenin from the seeds of greater celandine and its non expedience as a sole anti-tumor drug. A possibility of its application as adjuvant compound in complex with active anti-tumor drugs is discussed. Keywords: Greater celandine, sapogenins, anti-tumor activity, murine lymphoma NK/Ly. Из масла семян чистотела (Chelidonium majus L.) выделено вещество, соответствующее сапогенинам по физико-химическим свойствам, а именно: липофильность, растворимость в водном этаноле, интенсивное пенообразование, позитивная реакция Либермана-Бурхарда, гемолитическое действие, отсутствие углеводов и фосфора (фосфолипидов). Молекулярная масса основного компонента в препаратах по данным масс-спектрометрии составляет 656 Да. Вещество нетоксично, при внутри-брюшинном введении мышам в дозе 300 мг/кг не вызывало гибели животных. В експериментах іn vivo изучено влияние вещества на рост асцитной формы лимфомы NK/Ly мышей и цитоморфологию опухолевых клеток. При ежедневном введении вещества по 1 мг на протяжении 10 дней начиная со следующего дня после инокуляции опухолевых клеток, была отмечена задержка роста асцита и достоверное уменьшение количества опухолевых клеток в нем. По данным цитоморфологического анализа вещество вызывало существенное повреждение опухолевых клеток и достоверное повышение связывания лектинов чечевицы и арахиса. При введении вещества с интервалом 48 ч, а также при позднем введении (через 7 суток после инокуляции) влияние на рост опухолей было слабо выражено, однако повреждение клеток и связывание лектинов чечевицы и арахиса было достоверно выше, чем в контроле. Результаты свидетельствуют о слабо выраженном противоопухолевом действии сапогенина семян чистотела и нецелесообразность его использования как самостоятельного химиопрепарата. Обсуждается возможность его использования как адьюванта в комплексе с активными противоопухолевыми препаратами. Ключевые слова: чистотел, сапогенин, противоопухолевая активность, лимфома NK/Ly. 2011 Article Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly / М. Луцик, Н. Бойко, М. Луцик (мол.), Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2011. — Т. XXVIII: Хемія і біохемія. — С. 150-159. — Бібліогр.: 16 назв. — укр. 1563-3569 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/75051 616-006.441: 577.122 uk Праці наукового товариства ім. Шевченка Західний науковий центр НАН України і МОН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Матеріяли Матеріяли
spellingShingle	Матеріяли Матеріяли Луцик, М. Бойко, Н. Луцик, М. (мол.) Стойка, Р. Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly Праці наукового товариства ім. Шевченка
description	Із олії насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) одержано речовину, яка відповідає сапогенінам за фізико-хімічними властивостями, а саме: ліпофільність, розчинність у водному етанолі, інтенсивне піноутворення, позитивна реакція Лібермана- Бурхарда, гемолітична дія, відсутність вуглеводів і фосфору (фосфоліпідів). Молекулярна маса основного компонента у препаратах за даними мас-спектрометрії становить 656 Da. Речовина нетоксична, при внутрішньочеревному введенні мишам у дозі 300 мг/кг не викликала загибелі тварин. В експериментах іn vivo досліджено вплив речовини на ріст асцитної форми лімфоми NK/Ly мишей і цитоморфологію пухлинних клітин. При щоденному введенні речовини по 1 мг впродовж 10 днів, починаючи із наступного дня після інокуляції пухлинних клітин, відзначено затримку росту асциту і достовірне зменшення кількості пухлинних клітин у ньому. За даними цитоморфологічного аналізу речовина викликала значне ушкодження пухлинних клітин і достовірне підвищення зв’язування лектинів сочевиці й арахісу. При введенні речовини з інтервалом що 48 годин, а також при пізньому введенні (через 7 діб після інокуляції) вплив на ріст пухлини був слабо виражений, однак ушкодження клітин і зв’язування лектинів сочевиці й арахісу було достовірно вищим, ніж у контролі. Результати свідчать про слабо виражену протипухлинну дію сапогеніну насіння чистотілу і недоцільність його використання як самостійного хіміопрепарата. Обговорено можливість його застосування як ад’юванта в комплексі з активними протипухлинними препаратами. Ключові слова: чистотіл, сапогеніни, протипухлинна активність, лімфома NK/Ly.
format	Article
author	Луцик, М. Бойко, Н. Луцик, М. (мол.) Стойка, Р.
author_facet	Луцик, М. Бойко, Н. Луцик, М. (мол.) Стойка, Р.
author_sort	Луцик, М.
title	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly
title_short	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly
title_full	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly
title_fullStr	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly
title_full_unstemmed	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly
title_sort	очистка сапогеніну із насіння чистотілу (chelidonium majus l.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому nk/ly
publisher	Західний науковий центр НАН України і МОН України
publishDate	2011
topic_facet	Матеріяли
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/75051
citation_txt	Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly / М. Луцик, Н. Бойко, М. Луцик (мол.), Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2011. — Т. XXVIII: Хемія і біохемія. — С. 150-159. — Бібліогр.: 16 назв. — укр.
series	Праці наукового товариства ім. Шевченка
work_keys_str_mv	AT lucikm očistkasapogenínuíznasínnâčistotíluchelidoniummajuslídoslídžennâjogovplivunaeksperimentalʹnulímfomunkly AT bojkon očistkasapogenínuíznasínnâčistotíluchelidoniummajuslídoslídžennâjogovplivunaeksperimentalʹnulímfomunkly AT lucikmmol očistkasapogenínuíznasínnâčistotíluchelidoniummajuslídoslídžennâjogovplivunaeksperimentalʹnulímfomunkly AT stojkar očistkasapogenínuíznasínnâčistotíluchelidoniummajuslídoslídžennâjogovplivunaeksperimentalʹnulímfomunkly
first_indexed	2025-07-05T23:24:00Z
last_indexed	2025-07-05T23:24:00Z
_version_	1836851229528948736
fulltext	Праці НТШ Хем. Біохем. 2011. Т. 28. C. 150–159 Proc. Shevchenko Sci. Soc. Chem. Biochem. 2011. Vol. 28. P. 150–159 УДК 616-006.441: 577.122 Максим ЛУЦИК1, Наталія БОЙКО1, Максим ЛУЦИК (мол.)2, Ростислав СТОЙКА1 ОЧИСТКА САПОГЕНІНУ ІЗ НАСІННЯ ЧИСТОТІЛУ (СHELIDONIUM MAJUS L) І ДОСЛІДЖЕННЯ ЙОГО ВПЛИВУ НА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНУ ЛІМФОМУ NK/Ly 1Інститут біології клітини НАН України, вул. Драгоманова, 14/16, 79005 Львів, Україна 2Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, вул. Пекарська, 69, 79010 Львів, Україна Із олії насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) одержано речовину, яка відповідає сапогенінам за фізико-хімічними властивостями, а саме: ліпофільність, розчин- ність у водному етанолі, інтенсивне піноутворення, позитивна реакція Лібермана- Бурхарда, гемолітична дія, відсутність вуглеводів і фосфору (фосфоліпідів). Молекулярна маса основного компонента у препаратах за даними мас-спектро- метрії становить 656 Da. Речовина нетоксична, при внутрішньочеревному введенні мишам у дозі 300 мг/кг не викликала загибелі тварин. В експериментах іn vivo досліджено вплив речовини на ріст асцитної форми лімфоми NK/Ly мишей і цитоморфологію пухлинних клітин. При щоденному введенні речовини по 1 мг впродовж 10 днів, починаючи із наступного дня після інокуляції пухлинних клітин, відзначено затримку росту асциту і достовірне зменшення кількості пухлинних клітин у ньому. За даними цитоморфологічного аналізу речовина викликала значне ушкодження пухлинних клітин і достовірне підвищення зв’язування лектинів сочевиці й арахісу. При введенні речовини з інтервалом що 48 годин, а також при пізньому введенні (через 7 діб після інокуляції) вплив на ріст пухлини був слабо виражений, однак ушкодження клітин і зв’язування лектинів сочевиці й арахісу було достовірно вищим, ніж у контролі. Результати свідчать про слабо виражену протипухлинну дію сапогеніну насіння чистотілу і недоцільність його використання як самостійного хіміопрепарата. Обговорено можливість його застосування як ад’юванта в комплексі з активними протипухлинними препаратами. Ключові слова: чистотіл, сапогеніни, протипухлинна активність, лімфома NK/Ly. Чистотіл здавна застосовується у традиційній (народній) медицині для лікува- нні низки захворювань, у тому числі онкологічних [1, 2]. Вважають, що основним діючим началом чистотілу є алкалоїди, які утворюють складну багатокомпонентну суміш речовин (близько 30) із різною біологічною активністю [6, 7]. Сапоніни ФРАКЦІОНУВАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ПРОТЕЇНАЗ КЛІТИН МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/Ly 151 чистотілу, вміст яких у рослині досить значний, практично не досліджені в аспекті структури і біологічної, зокрема протипухлинної, активності. У багатьох популяр- них і наукових публікаціях стверджується наявність сапонінів у чистотілі кількома реченнями [1, 3, 4], стосовно ж спеціального дослідження сапонінів цієї рослини нами знайдено лише одну роботу [5]. Останнім часом значна увага приділяється протипухлинній активності сапоні- нів і сапогенінів у зв’язку з їхньою нешкідливою дією на нормальні клітини і невисокою, проте вибірковою токсичністю щодо пухлинних клітин [8–10]. Інтен- сивні дослідження даммаранових сапогенінів привели до створення на їхній основі ефективних протипухлинних лікарських засобів, які успішно застосовуються в онкологічній клініці [11, 12]. У статті розроблено метод очищення речовини з властивостями сапогеніну із насіння чистотілу і представлено результати дослід- ження її впливу на ріст експериментальної лімфоми NK/Ly мишей та цитоморфо- логічні характеристики пухлинних клітин в експериментах in vivo. Матеріал і методи дослідження Дослідження проводили на асцитній формі лімфоми NK/Ly, яку пасажували на мишах лінії С57Bl. Штам одержано із колекції Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ). Перещеплення пухлини проводили згідно із загальноприйнятою методикою, іно- кулювали 10 млн пухлинних клітин внутрішньочеревно [13]. Вплив досліджуваної речовини вивчали при ранньому введенні препарату, починаючи із 24 годин після інокуляції пухлинних клітин, і при пізньому введенні препарату після дренування асциту на 6–7-ий день росту пухлини. Клінічні показники впливу речовини включали динаміку росту пухлини, яку визначали щоденним зважуванням тварин, об’єм асциту при дренажі, концентрацію і загальну кількість клітин у ньому, три- валість життя тварин у досліді й контролі. Цитоморфологічні характеристики пух- линних клітин включали: 1) аналіз розподілу клітин у популяції за розміром (крива розподілу клітин згідно з їхнім діаметром, визначення середнього діаметра та від- сотка клітин збільшених розмірів (діаметр більше М+σ); 2) визначення ступеня пошкодження пухлинних клітин шляхом морфометричного комп’ютерного аналізу мазків, забарвлених азур-еозином, бромфеноловим синім, гематоксиліном Дела- фільда і нейтральним червоним. Визначали відсоток клітин з порушеннями струк- тури порівняно з клітинами першого дренажу контрольних тварин, які приймали за стандарт. У кожному мазку підраховували не менше 300 клітин на фотовідбит- ках із різних полів зору препарату. Вуглеводні детермінанти поверхні пухлинних клітин характеризували по зв’язуванню лектинів (конканаваліну А, сочевиці, арахісу, зародків пшениці) непрямим імуноцитохімічним методом. Як другі антитіла для виявлення локаліза- ції зв’язаних лектинів застосовували очищені антилектинові антитіла (отримані в лабораторії імунізацією кролів), мічені колоїдним золотом за методом [16]. Візуалізацію частинок колоїдного золота для світлооптичної мікроскопії здійсню- вали методом фізичного проявлення ацетатом срібла (технологія відома під назвою immunogold silver staining) [14, 15]. Очистка сапогеніну із насіння чистотілу Насіння чистотілу збирали у червні в місцях скупчень чистотілу. Насіння розмелювали на кавомолці, муку екстрагували диетиловим ефіром шляхом 152 МАКСИМ ЛУЦИК, CВЯТОСЛАВ НАВИТКА, ОЛЬГА ПРИДАТКО, РОСТИСЛАВ СТОЙКА перколяції в колонці чотирикратним об’ємом ефіру. Ефірний екстракт упарювали на роторному випаровувачі. Із 160 г муки отримали 62 г олії. Надалі, для уник- нення повторів, леткі органічні розчинники видаляли на роторному випарювачі. 50 г олії змішували із 250 мл етанолу, емульсію залишали при 4°С на добу, після чого центрифугували при 1500 хв-1, відділяли верхній етанольний шар, із якого після видалення етанолу отримали 52 г олійного залишку. До нього додава- ли 300 мл 0,2 н сульфатної кислоти і струшували до отримання однорідної драглистої маси, яку залишали при кімнатній температурі на 12–18 годин (протя- гом ночі). Після цього масу центрифугували при 3000 хв-1 20 хвилин, невеликий об’єм олії (близько 25 мл) видаляли, драглисту масу промивали водою у кристалі- заторі або упарювальній чашці. Отриману масу доводили до рН 10 за допомогою 2 н NaOH із застосуванням гомогенізатора типу Поттера-Ельвейєма, й отримували колоїдний розчин. До нього додавали 1 н HCl при постійному перемішуванні до рН 8,0, після чого додавали 10% розчин СаСІ2 для коагуляції розчину. рН при цьому знижувалось до 5,8. Суміш залишали в холодильнику на ніч, коагулят відділяли фільтруванням на ситі 100 меш (із штучного волокна) і промивали на ситі водою. Після підсушування на плоскій поверхні отримали 58 г сирої маси. Отриману масу суспендували у 300 мл ацетону, нерозчинну речовину збирали центрифугуванням при 2000 хв-1 і осад промивали 100 мл ацетону. Після висушу- вання осаду на фарфоровій тарілці отримали 7,4 г речовини у формі порошку. Для виділення фракції сапогенінів отриманий порошок розмішували у 15 мл 2 н сульфатної кислоти, суміш екстрагували 40 мл диетилового ефіру. Після вида- лення ефіру отримали олію, яку розчинили у 10 мл етанолу. Видаливши етанол, отримали 5 мл олійного залишку. Його розчинили у 25 мл етанолу, розчин центри- фугували при 3000 хв-1 10 хвилин, до прозорого супернатанту додавали 3 мл метанольного розчину 1 М метилату натрію і суміш залишали при 4°С на кілька годин. Кристалічний осад, який сформувався за цей час, відділяли центрифугуван- ням (осад № 1, волога маса 4,2 г). До прозорого супернатанту додавали 1,5 мл 1 М розчину метилату натрію і залишали при 4 °С на 12–16 годин. Кристалічний осад відділяли центрифугуванням (осад № 2, волога маса 3,5 г). До супернатанту дода- вали 3 об’єми ацетону, осад збирали центрифугуванням, промивали невеликим об’ємом ацетону і висушували (осад № 3, вихід – 1 г повітряно сухої речовини). Властивості отриманих фракцій Осад № 1 практично нерозчинний у етанолі, розчиняється у 50% водному ета- нолі при 40°С, що було використано для перекристалізації речовини. Для цього 4,2 г вологого осаду № 1 розміщували у 6 мл етанолу, додавали 6 мл води і суміш нагрівали до 45°С, незначний нерозчинний залишок відділяли короткотривалим центрифугуванням, супернатант залишали при кімнатній температурі для криста- лізації. Після двох циклів перекристалізації отримали 380 мг повітряно сухої речовини. Речовина давала позитивну реакцію Лібермана-Бурхарда. Вуглеводів і фосфору (відповідно фосфоліпідів) у її складі не виявлено, мінімальна гемолітична концентрація 30–35 мкг/мл. За результатами мас-спектрометричного аналізу моле- кулярна маса речовини становить 656 Da. Осад № 3, тверда речовина консистенції мила, розчинна у водному етанолі, позитивна реакція Лібермана-Бурхарда, вуглеводів і фосфору (відповідно фосфолі- підів) не виявлено, мінімальна гемолітична концентрація 32 мкг/мл. Молекулярна маса головного компоненту 656 Da (рис. 1). ФРАКЦІОНУВАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ПРОТЕЇНАЗ КЛІТИН МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/Ly 153 Рис. 1. Мас-спектр сапогеніну чистотілу (метод MALDI-TOF). Молекулярна маса основного піку 656,1. На вкладці кристали сапогеніну, отримані з 50% етанолу. Мас-спектрометричний аналіз проведено Т.В. Стасиком (Біоцентр Іннсбруксь- кого університету, Австрія), за що висловлюємо щиру подяку. У дослідах впливу на лімфому NK/Ly використовували речовину осаду № 3, яка добре розчинна у водно-етанольному розчиннику. Із неї ex tempore готували розчини для внутрішньочеревного введення. Для цього 2 мг речовини вносили у стерильну пробірку (5×50 мм), додавали 10 мкл етанолу і розмішували вміст до однорідної маси скляною паличкою. Вносили 5 мкл 1% спиртового розчину лево- міцетину і 0,4 мл води для ін’єкцій, при цьому спостерігалося повне розчинення речовини. Зразу вводили 0,2 мл розчину внутрішньочеревно, що відповідає 1 мг сапогеніну. Розчин тривалому зберіганню не підлягає. Залежно від кількості мишей у досліді, об’єм ін’єкційного розчину пропорційно збільшували в n раз + 1 доза, де n – кількість дослідних мишей. Результати дослідження На рис. 2 наведено криву росту асцитної пухлини NK/Ly в контролі та при різних режимах раннього введення препарату сапогеніну. При ранньому введенні препарату щоденно протягом 9 днів у дозі 50 мг/кг спостерігали гальмування проліферації пухлинних клітин і сповільнення росту асциту. Загальна кількість клітин в асциті у дослідних мишей була у 2,4–2,5 разу менша, ніж у контролі (табл. 1). При другому дренажі об’єм асциту в дослідних мишей був більший, ніж у контролі, що може бути зумовлено подразненням очеревини систематичними ін’єкціями речовини. 154 МАКСИМ ЛУЦИК, CВЯТОСЛАВ НАВИТКА, ОЛЬГА ПРИДАТКО, РОСТИСЛАВ СТОЙКА Рис. 2. Ріст асцитної лімфоми NK/Ly в контролі (а, в), при ранньому щоденному введенні препарату (б) і при введенні з інтервалом 48 годин (г). Позначення: – внутрішньочеревні введення речовини, – дренування асциту. Інокуляція пухлинних клітин у день 0. Таблиця 1 Вплив раннього введення сапогеніну чистотілу на проліферацію асцитних клітин NK/Ly (M±m) Порядок дренажу n Об’єм асциту, мл Концентрація клітин в асциті, млн/мл Сумарна кількість клітин в асциті, млн Дренаж 1, дослід 4 5,5±0,7 75±4* 407±33* Дренаж 1, контроль 4 6,2±0,6 198±25 1180±39 Дренаж 2, дослід 4 9,7±1,4 79±4* 653±85* Дренаж 2, контроль 4 7,8±0,9 199±32 1341±45 різниця між дослідом і контролем достовірна (P<0,05). 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 тривалість експерименту, дні ва га м иш і, г а б в г ФРАКЦІОНУВАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ПРОТЕЇНАЗ КЛІТИН МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/Ly 155 При ранньому введенні досліджуваної речовини з інтервалом 48 годин криві росту пухлини в контролі та в досліді суттєво не відрізнялись. Кількість клітин в асциті при перших дренажах у досліді та в контролі статистично не відрізнялась, достовірне зменшення кількості клітин у дослідних мишей відзначали пізніше, при 3-му – 5-му дренажах, що може бути зумовлене кумуляцією речовини в організмі. При пізньому початку введення сапоніну дворазове введення препарату після дренування асциту початково забезпечило тимчасову ремісію. Відновлення росту було зумовлене розвитком вузлів солідної лімфоми з утворенням асциту. Введення препарату сапогеніну в цьому стані було неефективним. Загалом у групі 20 мишей із пізнім введенням сапогеніну тривалість життя становила 25,6±2,2 дня, у контрольній групі (10 мишей) – 22,7±1,5 дні, різниця статистично недостовірна. Водночас із 20 лікованих мишей у 2 особин спостерігали повну ремісію після одноразового видалення асциту і введення сапогеніну чистотілу, 2 особини прожили більше 40 днів. Такий результат можна пояснити тільки індивідуальними особливостями тварин, їхньою природною резистентністю. Цитологічні зміни при ранньому введенні сапогеніну чистотілу проявлялися достовірним збільшенням розмірів пухлинних клітин за всіма показниками (табл. 2). При забарвленні азур-еозином виявлено масове утворення пухирців на поверхні клітини (блебінг-феномен), що свідчить про її патологічний стан і практично не зустрічається в контролі (рис. 3, Б). Зміни ядер характеризувалися різноспрямова- ністю – конденсацією хроматину і зменшенням розмірів ядра, або збільшенням і фрагментацією ядер з утворенням багатоядерних клітин. Таблиця 2 Вплив внутрішньочеревного введення сапогеніну чистотілу на цитоморфологічні характеристики клітин асцитної лімфоми NK/Ly № п/п Цитологічні показники, M±m n Початкова стадія росту (7 – 8 днів, контроль) n Раннє введення, 9 щоденних введень n Пізнє введення, (5-10-й день, дренаж асциту) 1 Діаметр клітин, мкм 10 13,6±0,3 5 16,5±0,3 10 14,6±0,2* 2 Відсоток клітин 18 мкм і більше 10 6,3±0,5 5 29,8±2,3* 10 13,2±2,8* 3 Відсоток пошкоджених клітин за даними забарвлення 3а Азур-еозином 10 26,8±2,8 5 80,2±4,8* 8 75,3±3,9* 3б Бромфеноловим синім 10 18,5±1,5 5 27,3±2,3 8 54,4±2,2* 3в Гематоксиліном Делафільда 10 13,2±1,2 5 63,0±5,1* 8 53,2±8,4* 3г Нейтральним червоним 10 15,8±1,8 5 59,3±5,4* 8 59,0±5,1* 4 Відсоток клітин у популяції, які зв’язують лектини 4а Con A 4 67,0±6,1 4 75,1±5,5 4 71,6±6,7 4б LCA 4 13,6±1,1 4 45,0±5,2* 4 40,0±5,0* 4в PNA 4 29,8±2,8 4 51,0±4,9* 4 43,1±3,9* 4г WGA 4 81,8±3,6 3 87,0±5,7 3 83,2±5,4 *різниця між дослідом і контролем достовірна (P<0,05). 156 МАКСИМ ЛУЦИК, CВЯТОСЛАВ НАВИТКА, ОЛЬГА ПРИДАТКО, РОСТИСЛАВ СТОЙКА Рис. 3. Клітини асцитної лімфоми NK/Ly в контролі (А) і при введенні препарату сапогеніну чистотілу (Б). Забарвлення азур-еозином за Романовським-Гімза. Кількісний аналіз цитоморфологічних змін при застосованих методах забарв- лення виявив високодостовірне збільшення кількості пошкоджених пухлинних клітин порівняно з контролем при ранньому і пізньому введенні препарату сапогеніну (табл. 2). За результатами зв’язування лектинів виявлено достовірне збільшення кількості клітин, які взаємодіяли з лектинами сочевиці й арахісу. Для конканаваліну А і аглютиніну зародків пшениці достовірних змін у зв’язуванні не виявлено. Такий результат можна інтерпретувати як часткове десіалювання по- верхневих вуглеводних детермінант клітин – О-гліканів при зв’язуванні лектину арахісу і N-гліканів при зв’язуванні лектину сочевиці. У випадку конканаваліну А і аглютиніну пшениці зміни не проявилися внаслідок високого вихідного рівня зв’язування цих лектинів. На основі отриманих результатів дослідження речовини з властивостями сапо- геніну із насіння чистотілу можна сформулювати такі висновки. Отримана речовина нетоксична, проявляє слабо виражену протипухлинну активність щодо мишачої лімфоми NK/Ly. При ранньому (24 години після іноку- ляції пухлини) щоденному введенні речовини відзначається пригнічення росту асциту і зменшення в ньому кількості пухлинних клітин у середньому на 58%. Цитоморфологічні зміни характеризуються достовірним збільшенням розмірів клітин і зростанням відсотка клітин із порушеною структурою. Ефект речовини нетривалий, краще виражений при щодобовому введенні, ніж при більших часових проміжках. При пізньому введенні (6–7 днів після інокуляції) терапевтичний ефект речо- вини із властивостями сапогеніну статистично недостовірний, продовження життя окремих мишей-пухлиноносіїв спостерігається рідко і зумовлене швидше індиві- дуальними особливостями тварини, ніж дією речовини. Цитоморфологічні зміни подібні до таких при ранньому введенні препарату. Під впливом одержаної із чистотілу речовини спостерігається достовірне збільшення у порівнянні з контро- лем відсотка клітин NK/Ly, які зв’язують лектини сочевиці і арахісу. Характерною особливістю сапогенінів є різноспрямованість їхнього впливу на пухлинні клітини, одним із аспектів їхньої дії є гальмування активності мембран- ФРАКЦІОНУВАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ПРОТЕЇНАЗ КЛІТИН МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/Ly 157 ного Р-глікопротеїну, який здійснює АТФ-залежне виведення ксенобіотиків, у тому числі лікарських препаратів, із клітини і зумовлює неселективну резистент- ність клітин до ліків [11]. У зв’язку з цим доцільно дослідити сумісне застосування сапогеніну чистотілу із відомими протипухлинними хіміопрепаратами з метою потенціювання їхньої дії, відповідно, зменшення дози і побічного токсичного ефекту, характерного для цих препаратів. ЛІТЕРАТУРА 1. Балицкий К.П., Воронцова А.М. Лекарственные растения и рак. – К., Наук. думка, 1982. – 376 с. 2. Потопальский А.И. Препараты чистотела в биологии и медицине. – К., Наук. думка, 1992. – 237 с. 3. Мазнев Н.И. Лечение ядовитими растениями: чистотел, морозник и другие природные целители семьи. – М., ИКТЦ ЛАДА, ООО ИД «Рипол классик». – 2005. – С. 61–63. 4. Комендар В.І. Лікарські рослини Карпат. Ужгород, Карпати. – 1971. – C. 47. 5. Kwasniewski V. Über die Auffindung eines Saponins im Schollkraute, Chelidonium majus // Archiv der Pharmazie. – 1958. – Bd. 291, N 4. – S. 209–211. 6. Taborska E., Bochorakova H., Paulova H., Dostal J. Separation of alkaloids in Chelidinium majus by reversed phase HPLC // Planta Med. – 1994. – V.60. – P. 380-381. 7. Taborska E., Bochorakova H., Dostal J., Paulova H. The Greater celandine (Chelidinium majus L.) – a review of contemporary knowledge // Ces. a Slov. Farm. – 1995. – V. 44, N 2. – P. 71–75. 8. Ovesna Z., Vachalkova A., Horvathova K., Tothova D. Pentacyclic triterpenoic acids: a new chemoprotective compounds // Neoplasma. – 2004. – V. 51, N 5. – P. 327–333. 9. Paduch R., Kandefer-Szerszen M., Trytek M., Fiedurek J. Terpenes: substances ustful in human healthcare // Arch. Immunol. Ther. Exp. – 2007. – V. 55. – P. 315–327. 10. Zuco V., Supino R., Righetti S.C., Cleris L., Marchesi E., Gambacorti-Basserini C., Formelli F. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells // Cancer Lett. – 2002. – V. 175, N1, – P. 17–25. 11. Dammarane sapogenins. Novel nontoxic anti-cancer agents, 2007. Режим доступу http://j.b5z.net/i/u/2100778/i/Bi_Eng_May_2007.pdf. 12. Panagin Pharmaceuticals Inc. Oral Bioavailability Enhancement Technology (OBET). Режим доступу http://www.panagin.com. 13. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Гольдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. – М., Медицина. 1980. – 295 с. 14. Hacker G.W., Grimelius L., Danscher G., Bernatsky G., Muss W., Adam H., Thurner J. Silver acetate autometallography: an alternative enhancement technique for immunogold- silver staining (IGSS) and silver amplification of gold, silver, mercury and zinc in tissues // J. Histotechnol. − 1988. − V.11. − P. 213-221. 15. Holgate C.S., Jackson P., Cowen P.N., Bird C.C. Immunogold silver staining: new method of immunostaining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. − 1983. − V. 31. − P. 938–944. 16. Geoghean W., Ackerman A. Adsorbtion of horse radish peroxidase, ovomucoid,and anti- immunoglobulin to colloidal gold for the indirectdetection of concanavalin A, WGA and immunoglobulin Gon cell surface on the electron microscopic level // J. Histochem. Cytochem. – 1977. – V. 25. – P. 1187–1200. http://j.b5z.net/i/u/2100778/i/Bi_Eng_May_2007.pdf http://www.panagin.com 158 МАКСИМ ЛУЦИК, CВЯТОСЛАВ НАВИТКА, ОЛЬГА ПРИДАТКО, РОСТИСЛАВ СТОЙКА SUMMARY Maxim LOOTSIK1, Nataliya BOIKO1, Maxim LUTSYK (Jr.)2, Rostyslav STOIKA1 PURIFICATION OF SAPOGENIN FROM SEEDS OF GREATER CELANDINE (СHELIDONIUM MAJUS L.) AND INVESTIGATION OF ITS INFLUENCE TOWARDS EXPERIMENTAL LYMPHOMA NK/Ly 1Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine Drahomanov str., 14/16, 79005 Lviv, Ukraine 2Danylo Halytsky Lviv National Medical University Pekarska str., 79010 Lviv, Ukraine A substance that corresponds sapogenins according to their physico-chemical characteristics (lipophilicity, solubility in ethanol-water mixture, intensive foaming, positive Lieberman-Burchard reaction, hemolytic activity, negative tests for sugars, and phosphorus (phospholipids)) was obtained from seeds oil of Greater celandine (Chelidonium majus L.). Molecular mass of principal component of that substance according to mass-spectrometry analysis equaled 656 Da. Substance was non-toxic, and its intra-abdominal injection in dose 300 mg/kg did not cause animal death. The effect of studied substance upon growth of the ascitic form of mouse lymphoma NK/Ly and cytomorphology of tumor cells was studied in the in vivo experiments. Everyday injection of 1 mg of substance per mouse during 10 days beginning from the next day after inoculation of tumor cells led to a retardation of ascite growth and significant decrease of cell number. Cytomorphological analysis showed a marked deterioration of tumor cells and significant increase in cellular binding of lentil and peanut lectins. During the injections of substance every 48 hours or in case of late beginning (7 days after inoculation), the effect upon tumor growth was negligible, but cell damage and binding of lentil and peanut lectins were significantly higher then in control. The obtained results indicate a weak anti-tumor activity of sapogenin from the seeds of greater celandine and its non expedience as a sole anti-tumor drug. A possibility of its application as adjuvant compound in complex with active anti-tumor drugs is discussed. Keywords: Greater celandine, sapogenins, anti-tumor activity, murine lymphoma NK/Ly. РЕЗЮМЕ Максим ЛУЦИК1, Наталия БОЙКО1, Максим ЛУЦИК (мл.)2, Ростислав СТОЙКА1 ОЧИСТКА САПОГЕНИНА ИЗ СЕМЯН ЧИСТОТЕЛА (СHELIDONIUM MAJUS L.) И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ВЛИЯНИЯ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНУЮ ЛИМФОМУ NK/LY 1Институт биологии клетки НАН Украины ул. Драгоманова, 14/16, 79005 Львов, Украина 2Львовський национальний медицинский университет им. Данилы Галицкого ул. Пекарская, 69, 79010 Львов, Украина Из масла семян чистотела (Chelidonium majus L.) выделено вещество, соответствующее сапоге- нинам по физико-химическим свойствам, а именно: липофильность, растворимость в водном этаноле, интенсивное пенообразование, позитивная реакция Либермана-Бурхарда, гемолитическое действие, отсутствие углеводов и фосфора (фосфолипидов). Молекулярная масса основного компонента в препаратах по данным масс-спектрометрии составляет 656 Да. Вещество нетоксично, при внутри- брюшинном введении мышам в дозе 300 мг/кг не вызывало гибели животных. В експериментах іn vivo изучено влияние вещества на рост асцитной формы лимфомы NK/Ly мышей и цитоморфологию опухо- левых клеток. При ежедневном введении вещества по 1 мг на протяжении 10 дней начиная со сле- дующего дня после инокуляции опухолевых клеток, была отмечена задержка роста асцита и досто- ФРАКЦІОНУВАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ ПРОТЕЇНАЗ КЛІТИН МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/Ly 159 верное уменьшение количества опухолевых клеток в нем. По данным цитоморфологического анализа вещество вызывало существенное повреждение опухолевых клеток и достоверное повышение связы- вания лектинов чечевицы и арахиса. При введении вещества с интервалом 48 ч, а также при позднем введении (через 7 суток после инокуляции) влияние на рост опухолей было слабо выражено, однако повреждение клеток и связывание лектинов чечевицы и арахиса было достоверно выше, чем в контро- ле. Результаты свидетельствуют о слабо выраженном противоопухолевом действии сапогенина семян чистотела и нецелесообразность его использования как самостоятельного химиопрепарата. Обсуждается возможность его использования как адьюванта в комплексе с активными противоопу- холевыми препаратами. Ключевые слова: чистотел, сапогенин, противоопухолевая активность, лимфома NK/Ly. Надійшла 26.09.2011. Прийнята до друку 12.10.2011.

Очистка сапогеніну із насіння чистотілу (Chelidonium majus L.) і дослідження його впливу на експериментальну лімфому NK/Ly

Репозитарії

Схожі ресурси