Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O

Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O

Установлена адсорбционная активность наноразмерных частиц CoFe₂O₄, синтезированных методом механохимического синтеза из солевых систем, в отношении белковых молекул на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и фермента Taq-полимеразы. Размер, структура и состав частиц охарактеризованы ме...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2008
Автори: Першина, А.Г., Сазонов, А.Э., Итин, В.И., Терехова, О.Г., Магаева, А.А.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України 2008
Назва видання:Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/76190
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O / А.Г. Першина, А.Э. Сазонов, В.И. Итин, О.Г. Терехова, А.А. Магаева // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2008. — Т. 6, № 3. — С. 1019-1028. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-76190
record_format dspace
spelling irk-123456789-761902015-10-31T11:45:40Z Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O Першина, А.Г. Сазонов, А.Э. Итин, В.И. Терехова, О.Г. Магаева, А.А. Установлена адсорбционная активность наноразмерных частиц CoFe₂O₄, синтезированных методом механохимического синтеза из солевых систем, в отношении белковых молекул на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и фермента Taq-полимеразы. Размер, структура и состав частиц охарактеризованы методом электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Молекулы белков иммобилизуются на поверхности частиц, стабилизированных Tween в водных буферных системах. Связывание подтверждено методом ИК-спектрометрии. Получен функциональный бионанокомпозит на основе суперпарамагнитных частиц нанопорошка CoFe₂O₄. Встановлено адсорбційну активність нанорозмірних частинок CoFe₂O₄, синтезованих методою механохемічної синтези із сольових систем, щодо білкових молекуль на прикладі бичачого сироваткового альбуміну (БСА) і ферменту Taq-полімерази. Розмір, структуру й склад частинок охарактеризовано методою електронної мікроскопії та рентґеноструктурної аналізи. Показано, що молекулі білків іммобілізуються на поверхні частинок, стабілізованих Tween у водних буферних системах. Зв’язування підтверджено методою ІЧ-спектрометрії. Одержано функціональний біонанокомпозит на основі суперпарамагнетних частинок нанопорошку CoFe₂O₄. Adsorption activity of nanosize CoFe₂O₄ particles with regard to albumin molecules is demonstrated for bovine serum albumin (BSA) and enzyme Taqpolymerase. These nanoparticles are prepared using mechanochemical synthesis. Sizes, structure and composition of the particles are characterized using transmission electron microscopy and x-ray diffraction. The binding of nanoparticles and proteins is confirmed by IR-spectrometry. Functional bionanocomposite based on the superparamagnetic particles of CoFe₂O₄ nanopowder is fabricated. 2008 Article Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O / А.Г. Першина, А.Э. Сазонов, В.И. Итин, О.Г. Терехова, А.А. Магаева // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2008. — Т. 6, № 3. — С. 1019-1028. — Бібліогр.: 18 назв. — рос. 1816-5230 PACS numbers: 62.23.Pq,78.30.-j,78.67.Bf,81.07.Wx,87.14.E-,87.15.K-,87.64.Ee http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/76190 ru Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
description Установлена адсорбционная активность наноразмерных частиц CoFe₂O₄, синтезированных методом механохимического синтеза из солевых систем, в отношении белковых молекул на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и фермента Taq-полимеразы. Размер, структура и состав частиц охарактеризованы методом электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Молекулы белков иммобилизуются на поверхности частиц, стабилизированных Tween в водных буферных системах. Связывание подтверждено методом ИК-спектрометрии. Получен функциональный бионанокомпозит на основе суперпарамагнитных частиц нанопорошка CoFe₂O₄.
format Article
author Першина, А.Г.
Сазонов, А.Э.
Итин, В.И.
Терехова, О.Г.
Магаева, А.А.
spellingShingle Першина, А.Г.
Сазонов, А.Э.
Итин, В.И.
Терехова, О.Г.
Магаева, А.А.
Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології
author_facet Першина, А.Г.
Сазонов, А.Э.
Итин, В.И.
Терехова, О.Г.
Магаева, А.А.
author_sort Першина, А.Г.
title Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
title_short Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
title_full Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
title_fullStr Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
title_full_unstemmed Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O
title_sort адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка cofe₂o
publisher Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України
publishDate 2008
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/76190
citation_txt Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe₂O / А.Г. Першина, А.Э. Сазонов, В.И. Итин, О.Г. Терехова, А.А. Магаева // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2008. — Т. 6, № 3. — С. 1019-1028. — Бібліогр.: 18 назв. — рос.
series Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології
work_keys_str_mv AT peršinaag adsorbciâbelkovnačasticahnanorazmernogoporoškacofe2o
AT sazonovaé adsorbciâbelkovnačasticahnanorazmernogoporoškacofe2o
AT itinvi adsorbciâbelkovnačasticahnanorazmernogoporoškacofe2o
AT terehovaog adsorbciâbelkovnačasticahnanorazmernogoporoškacofe2o
AT magaevaaa adsorbciâbelkovnačasticahnanorazmernogoporoškacofe2o
first_indexed 2025-07-06T00:38:03Z
last_indexed 2025-07-06T00:38:03Z
_version_ 1836855888760012800
fulltext 1019 PACS numbers: 62.23.Pq, 78.30.-j, 78.67.Bf, 81.07.Wx, 87.14.E-, 87.15.K-, 87.64.Ee Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe2O4 А. Г. Першина, А. Э. Сазонов, В. И. Итин *, О. Г. Терехова *, А. А. Магаева * Сибирский государственный медицинский университет, просп. Московский, 2, 634050 Томск, Россия *Отдел структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН, просп. Академический, 10/4, 634021 Томск, Россия Установлена адсорбционная активность наноразмерных частиц CoFe2O4, синтезированных методом механохимического синтеза из солевых сис- тем, в отношении белковых молекул на примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) и фермента Taq-полимеразы. Размер, структура и состав частиц охарактеризованы методом электронной микроскопии и рентгено- структурного анализа. Молекулы белков иммобилизуются на поверхно- сти частиц, стабилизированных Tween в водных буферных системах. Свя- зывание подтверждено методом ИК-спектрометрии. Получен функцио- нальный бионанокомпозит на основе суперпарамагнитных частиц нано- порошка CoFe2O4. Встановлено адсорбційну активність нанорозмірних частинок CoFe2O4, синтезованих методою механохемічної синтези із сольових систем, щодо білкових молекуль на прикладі бичачого сироваткового альбуміну (БСА) і ферменту Taq-полімерази. Розмір, структуру й склад частинок охаракте- ризовано методою електронної мікроскопії та рентґеноструктурної аналі- зи. Показано, що молекулі білків іммобілізуються на поверхні частинок, стабілізованих Tween у водних буферних системах. Зв’язування підтвер- джено методою ІЧ-спектрометрії. Одержано функціональний біонаноко- мпозит на основі суперпарамагнетних частинок нанопорошку CoFe2O4. Adsorption activity of nanosize CoFe2O4 particles with regard to albumin molecules is demonstrated for bovine serum albumin (BSA) and enzyme Taq- polymerase. These nanoparticles are prepared using mechanochemical syn- thesis. Sizes, structure and composition of the particles are characterized using transmission electron microscopy and x-ray diffraction. The binding of nanoparticles and proteins is confirmed by IR-spectrometry. Functional bionanocomposite based on the superparamagnetic particles of CoFe2O4 nanopowder is fabricated. Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології Nanosystems, Nanomaterials, Nanotechnologies 2008, т. 6, № 3, сс. 1019—1028 © 2008 ІМФ (Інститут металофізики ім. Г. В. Курдюмова НАН України) Надруковано в Україні. Фотокопіювання дозволено тільки відповідно до ліцензії 1020 А. Г. ПЕРШИНА, А. Э. САЗОНОВ, В. И. ИТИН и др. Ключевые слова: наноразмерные частицы, БСА, Тaq-полимераза, адсорб- ция, CoFe2O4. (Получено 21 ноября 2007 г.) 1. ВВЕДЕНИЕ Результаты исследований в области нанотехнологии, интегрирующей передовые достижения физики, химии и биологии, находят широкое применение для решения актуальных задач биотехнологии и медици- ны. Интерес к использованию наноматериалов обусловлен тем, что при переходе к наноразмерам фундаментальные характеристики ве- щества меняются, в результате чего в твердом теле проявляются но- вые физические явления и свойства [1]. Малые размеры частиц (менее 100 нм) сопоставимы с размером белка (5—50 нм) и высокоразвитая поверхность позволяет наночастицам активно взаимодействовать с биомолекулами на индивидуальном уровне. Значительный интерес представляют наночастицы, обладающие магнитными свойствами, что обусловлено возможностью управления конструкциями на их ос- нове в магнитном поле. Магнитные наночастицы широко используют- ся для иммобилизации сигнальных молекул белковой природы, пеп- тидов и ферментов. На основе композитов наночастиц с антителами или их фрагментами разрабатывают методы высокочувствительной диагностики и высокоспецифичные магнитоуправляемые транспорт- ные системы целевой доставки терапевтических молекул (олигонук- леотидов, лекарственных препаратов и др.) [2]. Использование маг- нитных наночастиц для иммобилизации ферментов, приводит к ста- билизации последних: продлению срока их хранения, повышению устойчивости к неблагоприятным воздействиям рН, температуры, и, кроме того, препятствует протеолитической деградации [3]. Исполь- зование магнитной сепарации позволяет отделять иммобилизованный фермент с целью повторного использования. Адсорбция молекулы белка на поверхности наноносителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых, гид- рофобных, электростатических взаимодействий, водородных связей, либо в результате образования ковалентной связи [4]. Относитель- ный вклад каждого типа связи зависит от химических характери- стик поверхности частицы и функциональных групп на поверхности белковой молекулы. Основными механизмами адсорбции белков на наноматериалах являются электростатические, гидрофобные взаи- модействие и специфическая химическая связь [5]. Наночастицы, обладающие высокой поверхностной активностью, характеризуются склонностью к агрегации. В этой связи, для их биомедицинского использования необходимо создавать устойчивую коллоидную систему наночастиц в водных средах. Одним из при- АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ НА ЧАСТИЦАХ НАНОРАЗМЕРНОГО ПОРОШКА 1021 влекательных подходов к стабилизации наночастиц является по- крытие их полимерами. Наиболее часто для этих целей используют полиэтиленоксид, полиэтиленгликоль, декстран, крахмал. Допол- нительные преимущества полимерного покрытия обусловлены тем, что полимеры могут играть роль «спейсера» для связывания белко- вых молекул с наночастицей и обеспечивать биосовместимость [6]. Целью данной работы является исследование возможности созда- ния бионанокомпозита на основе частиц наноразмерного порошка феррита кобальта и белков. Для достижения этой цели проводили адсорбцию бычьего сывороточного альбумина (БСА) и фермента син- теза нуклеиновых кислот Taq-полимеразы на поверхности стабили- зированных в водной среде частиц CoFe2O4. 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Наноразмерный порошок кобальтового феррита СоFe2O4 получен методом механохимического синтеза из солевых систем в присутст- вии инертного разбавителя NaCl [7]. Для синтеза кобальтовой фер- рошпинели использовали реакцию: 2FeCl3 + 3Ca(OH)2 + CoCl2 + Na2CO3 → CoFe2O4 + 3CaCl2 + 2NaCl + CO2↑ + 3H2O. Параметры кристаллической структуры, фазовый состав и дис- персность синтезированного наноферримагнитного порошка иссле- довали методами просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ- 125) и рентгеноструктурного анализа (дифрактометр Shimadzu XRD 6000, CuKα-излучение). Магнитные свойства гексагонального ферримагнетика изучали в импульсных магнитных полях напря- жённостью 3 Т с помощью автоматизированного магнитометра [8]. Удельную поверхность порошка кобальтового феррита измеряли методом БЭТ на приборе серии СОРБИ ® N.4.1.; в качестве газа- адсорбата использовали азот. Стабильный коллоидный раствор на- ночастиц (1 мг/мл) получали методом ультразвукового диспергиро- вания частиц нанопорошка в буфере содержащем 20 mМ Tris, 50 mM KCl, 0,1% Tween-20 (Microson XL2005, Farmingdale). Предель- ный размер частиц в суспензии определяли на лазерном анализато- ре (Microtrac S3000, Horiba, Япония). Измерения дзета-потенциала наночастиц в буфере 20 mМ Tris, 50 mM KCl, 0,1% Tween-20 (при рН от 4,0 до 10,0), проводили на приборе Чайковского методом пе- редвигающейся границы. В работе использовали: лиофилизированный бычий сывороточ- ный альбумин (БСА) фракция V (Sigma, США) и рекомбинантную Taq-полимеразу, любезно предоставленную лабораторией фармако- геномики Института химической биологии и фундаментальной ме- дицины СО РАН (Новосибирск, Россия). 1022 А. Г. ПЕРШИНА, А. Э. САЗОНОВ, В. И. ИТИН и др. Иммобилизацию проводили смешиванием стабилизированной суспензии частиц СоFe2O4 с раствором БСА (0,5 мг/мл 20 mМ Tris, 50 mM KCl (рН = 6,4) раствора фермента (50 е.а./мкл, рН = 8,5) в объем- ном соотношении 10:1. Смесь инкубировали в течение 16 часов на роторном шейкере при rpm 40 (Biosan Multi RS60, Латвия) при тем- пературе 25°С. Преципитаты частиц и белка отделяли из раствора методом магнитной сепарации с использованием постоянного магни- та с поверхностной намагниченностью 2000 G и промывали 20 мМ Tris-HCl (pH = 8,0). Концентрацию белка измеряли методом Бред- форд при OD595 на спектрофотометре (СФ 2000, Россия) [9]. Количе- ство не связавшегося белка в супернатанте определяли по калибро- вочной кривой, построенной с использованием БСА; количество им- мобилизованного белка рассчитывали по формуле: A = (Co − Ci)V/m, где А – количество связанного белка; Сo – исходная концентрация раствора белка; Сi – концентрация несвязавшегося белка в суперна- танте; V – объем реакционной среды; m – масса нанопорошка. ИК-спектры снимали на ИК-фурье-спектрометре (Nicolet 5700, США) на приставке диффузного отражения в KBr в диапазоне 4000—400 см −1. Функциональную активность иммобилизованной на частицах СоFe2O4 Taq-полимеразы определяли методом ПЦР в режиме реально- го времени на совмещенном амплификаторе-флуориметре АМФ001 (Биомедсиб, Россия). Для постановки ПЦР использовали олигонукле- отидные праймеры на ген глицероальдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH) (Синтол, Москва). Реакционная смесь объёмом 25 мкл со- держала: 60 мМ Tris-HCl (pH 8.9), 25 мМ KCl, 15 мМ MgCl2, 0.01% Triton X100, 200 мкМ dNTP, 200 пкМ каждого специфического оли- гонуклеотидного праймера, SYBR Green I (1:5000 от коммерческого стокового раствора, ‘Molecular Probes’, США), 20 нг/мкл ДНК лейко- цитов человека, 1 мкл Taq-полимеразы (5 е.а./мкл). Статистическую обработку данных проводили, используя пакет программ Statistic 6.0. for Windows. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика частиц нанопорошка CoFe2O4 Исследования кобальтового феррита методом просвечивающей элек- тронной микроскопии показало, что синтезированный порошок представляет собой наноразмерные сферические частицы со средним диаметром в интервале 6—12 нм (рис. 1). Микроэлектронограмма по- рошков имела характерное кольцевое строение с выраженным диф- фузным максимумом в области малых углов рассеяния. По данным рентгеноструктурного анализа определен параметр решетки (0,8376 нм), средний размер частиц (11 нм). Содержание АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ НА ЧАСТИЦАХ НАНОРАЗМЕРНОГО ПОРОШКА 1023 шпинельной фазы в порошке CoFe2O4 составляет 98,8%мас., при- меси гематита (α-Fe2O3) – 1,2% масс. Площадь удельной поверхно- сти частиц кобальтовой шпинели равна 113 м 2/г. Рассчитанный из этого значения диаметр сферических частиц – 10 нм, что хорошо согласуется с данными электронно-микроскопического и рентгено- структурного анализов. Величина удельной намагниченности составляла 22 Гс⋅см3/г. На- норазмерный порошок находится в суперпарамагнитном состоянии. 3.2. Стабилизация частиц нанопорошка CoFe2O4 в водных системах С целью проведения иммобилизации белков в водных средах полу- чали устойчивые суспензии частиц порошка CoFe2O4, в диапазоне рН буферного раствора от 4.0 до 10.0. В качестве стабилизатора ис- пользовали Tween20 в концентрации 0,1%. По данным исследова- ний проведенных на лазерном анализаторе, было показано, что размер частиц в суспензии не превышал 20 нм. Стабилизация суспензии нанопорошка могла достигаться за счет покрытия частиц полимером. Это предположение хорошо согласует- ся с данными ИК-спектрометрии (рис. 2). Так, на ИК-спектрах нано- порошка CoFe2O4, стабилизированных Tween-20, выявляются полосы поглощения в диапазоне 600—400 см −1 характерные для шпинелей, а так же присутствуют характерные полосы поглощения полимера при 1742,8 см −1, при 2855,9 см −1, обусловленная жирнокислотным остат- ком Tween-20, и при 1066,5 см −1, принадлежащая колебаниям С—О- связи. На спектре чистого кобальтового феррита детектируется поло- са поглощения, при 875 см −1 характерная для (—ОН) группы [10]. По- явление гидроксильной группы на поверхности наноразмерного CoFe2O4, обусловлено особенностями их синтеза, в котором вода явля- Рис. 1. Гистограмма распределения размеров частиц порошка кобальто- вого феррита СоFe2O4. 1024 А. Г. ПЕРШИНА, А. Э. САЗОНОВ, В. И. ИТИН и др. ется участником реакции. Таким образом, взаимодействие Tween-20 с частицами нанопорошка препятствует их агрегации. Измерение дзета-потенциала на поверхности наноразмерных частиц феррита кобальта в стабилизирующем буфере показало, что они имели положительный заряд, а величина электрокинетическо- го потенциала зависит от рН. 3.3. Иммобилизация белков на частицах нанопорошка CoFe2O4 Иммобилизацию БСА проводили согласно методике при значениях рН стабилизирующего буфера (20 mМ Tris, 50 mM KCl, 0,1% Tween- 20) от 4.0 до 10.0 с шагом 1. На основании данных спектрофотомет- рического определения несвязавшегося белка в супернатанте были проведены расчеты количеств белка, связываемого частицами на- нопорошка. В результате сравнения количеств связываемого белка при разных рН достоверных отличий в эффективности адсорбции БСА на наноразмерном феррите кобальта не обнаружено (при р > 0,05). Таким образом показано, что эффективность адсорбции не зависит от рН раствора. Адсорбционная емкость частиц нанопорош- ка феррита кобальта относительно БСА, составила 1:3 (в пересчете на сухой вес), так 1 мг частиц CoFe2O4 связывает 0,32±0,06 мг белка. Рис. 2. ИК-спектры: (1) частицы нанопорошка кобальтового феррита СоFe2O4, (2) Tween-20, (3) частицы нанопорошка кобальтового феррита СоFe2O4, стабилизированныеТween-20. АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ НА ЧАСТИЦАХ НАНОРАЗМЕРНОГО ПОРОШКА 1025 Связь БСА с магнитными частицами качественно исследована методом ИК-спектрометрии (рис. 3). На ИК-спектре преципитата БСА—CoFe2O4 показано присутствие полос поглощения белка при 1669,8 см −1 и 1531,7 см −1, обусловленных (—NH—) группами; при 1446,3 см −1 и 1327,0 см −1, характерных для (—CO—) групп, что под- тверждает факт иммобилизации БСА на поверхности наноразмер- ных частиц [10, 11]. Важно отметить исчезновение полосы погло- щения, присутствующей на спектре чистого кобальтового феррита, при 875 см −1, принадлежащей (—ОН) группе. Это позволяет выска- зать предположение об участии гидроксильной группы в образова- нии химической связи с белком [12]. Взаимодействие Tween-20 и белка при адсорбции могут носить с одной стороны конкурентный характер – неионогенные ПАВ способны вытеснять белок с меж- фазной поверхности, однако они могут участвовать в образовании комплекса с белком и способствовать его адсорбции [13]. Так полоса поглощения при 1327,0 см −1 предположительно указывает на ад- сорбцию БСА на поверхности частиц CoFe2O4 за счет кооперации с Tween-20. Взаимодействие белка с полимерным покрытием наноча- стиц может осуществляться за счет гидрофобных и гидрофильных взаимодействий, которые обусловлены присутствием полярных и неполярных группировок как в структуре Tween-20, так и в моле- Рис. 3. ИК-спектры: (1) частицы нанопорошка кобальтового феррита СоFe2O4, (2) Tween-20 (3) Бычий сывороточный альбумин (4) Бычий сывороточный альбумин, иммобилизованный на частицах нанопорошка кобальтового фер- рита СоFe2O4, стабилизированныхTween-20. 1026 А. Г. ПЕРШИНА, А. Э. САЗОНОВ, В. И. ИТИН и др. куле белка [14]. В механизме адсорбции белка на CoFe2O4 дополни- тельная прочность связывания может достигаться за счет образова- ния комплекса белка с ионом металла [15]. Значительную роль при иммобилизации белка на поверхности наночастиц могут играть электростатические взаимодействия [5]. Действительно, БСА – кислый белок (PIБСА = 4,78), что способству- ет электростатическому взаимодействию его с положительно зара- женной поверхностью частиц феррита кобальта. Учитывая, что при значениях рН ниже изоэлектрической точки молекула белка стано- вится положительно заряженной, так же как и поверхность части- цы кобальтового феррита, силы электростатического отталкивания при одноименном заряде белка и носителя должны препятствовать адсорбции белка в данных условиях. Согласно нашим данным, эф- фективность адсорбции при рН = 4,0 не отличалась от данного по- казателя вычисленного при рН ≥ 5,0. Это указывает на то, что элек- тростатические взаимодействия в данном случае не являются ве- дущим механизмом адсорбции, тем не менее, они могут играть оп- ределенную роль в ориентации молекулы белка на носителе. В целом механизм адсорбции белка носит сложный характер, и не может быть объяснен одним типом взаимодействия [16]. Например, Yoon с соавторами показали, что при низких значениях рН адсорб- ция осуществляется преимущественно за счет гидрофобных взаимо- действий, в то время как при рН выше изоэлектрической точки, им- мобилизация БСА на поверхности микрочастиц происходит в основ- ном за счет электростатического связывания [17]. Таким образом, даже в случае образования ковалентной связи при адсорбции белка на поверхности частицы, вклад более слабых взаимодействий (гид- рофобных/гидрофильных и электростатических) может быть значи- тельным. Более того, при иммобилизации они во многом определяют ориентацию белковой молекулы и конформацию полипептидной це- пи белка, что важно для сохранения ее функциональной активности. При адсорбции взаимодействия белковой молекулы с поверхно- стью носителя могут сопровождаться нарушением пространственной структуры белка, важной для сохранения ее функции [4, 16]. Было проведено исследование функциональной активности адсорбирован- ной Taq-полимеразы из раствора фермента на наноразмерных части- цах CoFe2O4, стабилизированных Тween-20 при оптимальном для хранения фермента значении рН = 8,55. Taq-полимераза – кислый (PITaq = 6,4) глобулярный белок, имеющий субъединичное строение. Данные, полученные при проведении ИК-спектрометрии преципи- татов Taq-полимеразы и нанопорошка СоFe2O4, подтверждают ус- пешную иммобилизацию фермента на поверхности частиц нанораз- мерного кобальтового феррита (рис. 4) Так регистрируется характер- ная для молекулы фермента полоса поглощения при 1513,7 см −1 (18). Исчезновение полосы поглощения при 878,1 см −1, принадлежащей гидроксильной группе на поверхности стабилизированного СоFe2O4, АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ НА ЧАСТИЦАХ НАНОРАЗМЕРНОГО ПОРОШКА 1027 указывает на ее участие во взаимодействии с белком. Это хорошо со- гласуется с данными, полученными при ИК-спектрометрии иммоби- лизованного БСА, и позволяет нам предполагать участие тех же ме- ханизмов взаимодействия между молекулой фермента и стабилизи- рованной частицей нанопорошка. Более слабо выраженные полосы поглощения фермента обусловлены малым количеством анализи- руемого белка, что связано со сложностями пробоподготовки. Для исследования влияния иммобилизации на сохранение функ- циональной структуры молекулы фермента, была проверена его ка- талитическая активность. Иммобилизованную на частицах CoFe2O4 Taq-полимеразу, после отделения из раствора методом магнитной сепарации, ресуспендировали в эквивалентном объеме буфера и ис- пользовали для постановки Real-time ПЦР. Наносвязанная Taq- полимераза успешно осуществляла синтез нуклеотидной цепи, что так же служит подтверждением факта иммобилизации, и сохране- нием функциональной активности фермента после адсорбции. 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенных исследований физических свойств час- Рис. 4. ИК-спектры: (1) частицы нанопорошка кобальтового феррита СоFe2O4, стабилизированные Tween-20, (2) фермент Тaq-полимераза, (3) Тaq-поли- мераза, иммобилизованная на частицах нанопорошка кобальтового феррита СоFe2O4, стабилизированныхTween-20. 1028 А. Г. ПЕРШИНА, А. Э. САЗОНОВ, В. И. ИТИН и др. тиц нанопорошка СоFe2O4, показано, что данные частицы отвечают требованиям универсальных носителей биомолекул. Они обладают большой удельной поверхностью, малыми размерами, не ограничи- вающими диффузию в среде, стабильными магнитными характери- стиками. Показана возможность получения стабильных суспензий в водных средах за счет модификации наноразмерных частиц СоFe2O4 неионогенным ПАВ Tween-20. Важно отметить, что Tween- 20 является нетоксичным и биосовместимым веществом и широко используется в молекулярной биологии, биохимии и фармаколо- гии. Композиционный наноматериал СоFe2O4—Tween-20 обладает высокой сорбционной активностью относительно белков и может быть использован для создания функциональных бионанокомпози- тов. Которые в дальнейшем можно использовать для решения задач биотехнологии и медицины. Работа поддержана грантами Администрации Томской области (договор № 469 от 12 декабря 2006 г.), РФФИ (06-04-96962-р_офи) и РФФИ (07-04-12170-офи). Авторы выражают благодарность со- трудникам Научно-аналитического центра Томского политехниче- ского университета за помощь в проведении ИК-спектрометрии. ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Ч. Пул, Ф. Оуэнс, Нанотехнологии (Москва: Техносфера: 2005). 2. Q. A. Pankhurst, J. Connolly, S. K. Jones, and J. Dobson, J. Phys. D: Appl. Phys., 36: 167 (2003). 3. M.-H. Liao and D.-H. Chen, Biotech. Lett., 23: 1723 (2001). 4. И. В. Березин, Н. Л. Клячко А. Д. Левашов и др., Иммобилизованные фер- менты (Москва: Высшая школа: 1987). 5. S. Patila, А. Sandbergb, Е. Heckertc et al., Biomater., 28: 4600 (2007). 6. A.-H. Lu, E. L. Salabas, and F. Schuth, Angew. Chem. Int. Ed., 46: 1222 (2007). 7. P. G. MacCormick, J. Dind, W.-F. Miao et al., WO 97/07917, B22F 9/16 (1997). 8. В. Ю. Креслин, Е. П. Найден, ПТЭ, № 1: 63 (2002). 9. N. J. Kruger, Methods Mol. Biol., 32: 9 (1994). 10. А. Смит, Прикладная ИК-спектрометрия (Москва: Мир: 1982). 11. M. Koneracka, Р. Kopcansky, М. Antalik et al., JМММ, 201: 427 (1999). 12. R. V. Mehta, R. V. Upadhyay, S. W. Charles, and C. N. Ramchand, Biotechnol- ogy Techniques, 11: 493 (1997). 13. С. М. Ливачев, А. Е. Харлов, А. М. Кукушкина и др., Вест. Моск. ун-та. Сер. 2: Химия, 47, № 3: 218 (2006). 14. Т. М. Goppert and R. H. Muller, J. of Drug Targeting, 11, No. 4: 225 (2003). 15. G. K. Kouassi, J. Irudayaraj, and G. McCarty, J. of Nanobiotech., 3: 1 (2005). 16. В. Н. Измайлова, Г. П. Ямпольская, Б. Д. Сумм, Поверхностные явления в белковых системах (Москва: Химия: 1988). 17. J. Y. Yoon, J. H. Lee, J. H. Kim, and W. S. Kim, Colloids and Surfaces B: Bio- interfaces, 10: 365 (1998). 18. S.-H. Huang, M.-H. Liao, and D.-H. Chen, Biotechnol. Prog., 19: 1095 (2003).

Схожі ресурси