Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii

Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов Solanum tuberosum (сортов Луговской и Славянка) с геном nptII в ядерной ДНК и полученного нами ранее транспластомного растения Solanum rickii с геном aadA. На селективной среде, содержавшей антибиотики канамицин, спектиномицин и стрептомицин...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2008
Hauptverfasser:	Матвеева, Н.А., Шаховский, А.М., Кучук, Н.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Schlagworte:	Оригинальные работы
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/8212
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii / Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 38-44. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-8212
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-82122010-05-17T12:02:19Z Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii Матвеева, Н.А. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. Оригинальные работы Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов Solanum tuberosum (сортов Луговской и Славянка) с геном nptII в ядерной ДНК и полученного нами ранее транспластомного растения Solanum rickii с геном aadA. На селективной среде, содержавшей антибиотики канамицин, спектиномицин и стрептомицин, были получены гибридные растения, имеющие гены aadA и nptII, хлоропласты S. rickii и S. tuberosum, гибридный ядерный геном, что подтверждено результатами ПЦР-анализов. Проведено експерименти по злиттю мезофільних протопластів Solanum tuberosum (сортів Луговський та Слов’янка) з геном nptII в ядерній ДНК та отриманої нами раніше транспластомної рослини Solanum rickii з геном aadA. На селективному середовищі, що містило одночасно антибіотики канаміцин, спектиноміцин та стрептоміцин, було отримано гібридні рослини, що мали гени aadA та nptII, хлоропласти S. rickii та S. tuberosum і гібридний ядерний геном. Ці дані було підтверджено результатами ПЦР-аналізів. The hybrid plants with transformed plastids were regenerated after fusion of mesophyll protoplasts of Solanum rickii with aadA chloroplast selective marker gene and Solanu tuberosum with nptII nuclear selective marker gene. The hybrid callus clones were selected on the medium containing streptomycine, spectinоmycine and kanamycine. The hybrids were identified on the base of PCR analysis of nuclear and plastid DNAs. The analysis have shown that regenerated plants were somatic hybrids containing aadA and nptII genes, Solanum rickii and Solanum tuberosum nuclear and chloroplast DNA. 2008 Article Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii / Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 38-44. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0564-3783 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/8212 575.222.7:581.1 ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Матвеева, Н.А. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
description	Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов Solanum tuberosum (сортов Луговской и Славянка) с геном nptII в ядерной ДНК и полученного нами ранее транспластомного растения Solanum rickii с геном aadA. На селективной среде, содержавшей антибиотики канамицин, спектиномицин и стрептомицин, были получены гибридные растения, имеющие гены aadA и nptII, хлоропласты S. rickii и S. tuberosum, гибридный ядерный геном, что подтверждено результатами ПЦР-анализов.
format	Article
author	Матвеева, Н.А. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В.
author_facet	Матвеева, Н.А. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В.
author_sort	Матвеева, Н.А.
title	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
title_short	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
title_full	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
title_fullStr	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
title_full_unstemmed	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii
title_sort	соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля solanum tuberosum и транспластомными растениями solanum rickii
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Оригинальные работы
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/8212
citation_txt	Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii / Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 38-44. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT matveevana somatičeskiegibridymeždutransgennymirasteniâmikartofelâsolanumtuberosumitransplastomnymirasteniâmisolanumrickii AT šahovskijam somatičeskiegibridymeždutransgennymirasteniâmikartofelâsolanumtuberosumitransplastomnymirasteniâmisolanumrickii AT kučuknv somatičeskiegibridymeždutransgennymirasteniâmikartofelâsolanumtuberosumitransplastomnymirasteniâmisolanumrickii
first_indexed	2025-07-02T10:57:52Z
last_indexed	2025-07-02T10:57:52Z
_version_	1836532496620060672
fulltext	38 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 УДК 575.222.7:581.1 Н.А. МАТВЕЕВА, А.М. ШАХОВСКИЙ, Н.В. КУЧУК Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины 03143, Киев, ул. Акад. Заболотного, 148 E/mail: joyna@i.com.ua СОМАТИЧЕСКИЕ ГИБРИДЫ МЕЖДУ ТРАНСГЕННЫМИ РАСТЕНИЯМИ КАРТОФЕЛЯ SOLANUM TUBEROSUM И ТРАНСПЛАСТОМНЫМИ РАСТЕНИЯМИ SOLANUM RICKII Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов Solanum tuberosum (сортов Луговской и Славянка) с геном nptII в ядерной ДНК и полученного нами ранее транспластомного растения Solanum rickii с геном aadA. На селективной среде, содержавшей ан� тибиотики канамицин, спектиномицин и стрептоми� цин, были получены гибридные растения, имеющие гены aadA и nptII, хлоропласты S. rickii и S. tuberosum, гиб� ридный ядерный геном, что подтверждено результата� ми ПЦР�анализов. Введение. В настоящее время эффективное сельскохозяйственное производство неотдели� мо от новейших достижений науки. К ним мож� но отнести внедрение новых аграрных техноло� гий, новых средств защиты растений, новых сортов. Широко используются созданные бла� годаря значительным успехам генетической ин� женерии трансгенные сельскохозяйственные культуры с генами устойчивости к гербицидам, заболеваниям, вредителям [1]. Особый интерес представляют растения, имеющие чужеродные гены в хлоропластах. Хлоропластная трансформация по сравне� нию с ядерной имеет ряд несомненных пре� имуществ. К ним можно отнести высокий уровень экспрессии и возможность накопле� ния существенно большего количества белко� вого продукта по сравнению с переносом того же гена в ядерную ДНК [2]. При встраивании чужеродного гена в ядерную ДНК существует опасность неконтролируемого его распрост� ранения, в то время как материнское наследо� вание цитоплазматических генов у большин� ства сельскохозяйственных культур делает не� возможным перенос с пыльцой чужеродных генов и таким образом способствует экологи� ческой безопасности [3]. Трансформация хлоропластной ДНК, в отличие от ядерной, осуществляется по способу гомологичной ре� комбинации [4]. Строгая специфичность по месту встраивания переносимого гена дает возможность избежать влияния так называе� мого неконтролируемого эффекта положения или «молчания» перенесенных генов. Поли� цистронный тип экспрессии при трансфор� мации хлоропластов позволяет вводить в рас� тительную клетку несколько генов одновре� менно [5]. На сегодня имеется несколько способов осу� ществления трансформации хлоропластной ДНК. К ним относятся «прямая» трансформа� ция с использованием культуры протопластов [6, 7] и биолистическая трансформация [8]. Однако до настоящего времени надежные про� токолы трансформации хлоропластной ДНК разработаны только для растений рода Nicotiana [4]. Хлоропластная трансформация других цен� ных сельскохозяйственных культур, например, картофеля, томатов, капусты, кукурузы и др. до сих пор остается затруднительной. Имеется лишь несколько успешных работ по трансфор� мации хлоропластной ДНК, например, для© Н.А. МАТВЕЕВА, А.М. ШАХОВСКИЙ, Н.В. КУЧУК, 2008 39 Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 Lycopersicon esculentum [9], Lesguerella fendleri [10], Petunia hybrida [11], Glycine max [12]. Что касается трансформации хлоропластной ДНК растений картофеля, то цитируемые ра� боты остаются пока единственными [13, 14]. Нами методом биолистической трансформа� ции сегментов междоузлий были получены рас� тения Solanum rickii Corr. с трансформирован� ными пластидами, имеющие ген ааdА [15, 16]. Осуществление трансформации хлороплас� тной ДНК картофеля как с помощью «прямой» трансформации протопластов, так и с исполь� зованием метода биолистической трансформа� ции листьев, междоузлий, клубней требует вы� сокой эффективности регенерации растений. Объективные трудности в решении этой задачи вызваны как отсутствием надежных и воспро� изводимых методик регенерации растений из протопластов, так и значительными разли� чиями в регенерационной способности раз� ных сортов картофеля [17]. Возможное реше� ние проблемы получения транспластомных растений рода Solanum заключается в исполь� зовании соматической гибридизации. Этот метод позволяет создавать растения с новыми признаками, причем сконструированные сома� тические гибриды могут иметь наборы генов, которые не удается получить с помощью по� лового скрещивания. Слияние протопластов трансгенных расте� ний, которые имеют в хлоропластной ДНК встроенный чужеродный ген, и протопластов растений, трансформация которых затруднена, позволяет решить проблему пластомной транс� формации и таким образом создавать ценные сельскохозяйственные растения с необходи� мыми признаками. Этот подход к решению проблемы был использован Сытник и др. [18]. Авторами была показана возможность получе� ния транспластомных растений Salpiglossis sinu� ata путем переноса трансформированных плас� тид от гибрида Nicotiana tabacum (+S. sinuata) после слияния изолированных протопластов. Целью нашей работы был перенос транс� формированных хлоропластов S. rickii с геном aadA в картофель путем слияния мезофиль� ных протопластов Solanum tuberosum сортов Луговской и Славянка с мезофильными про� топластами полученного нами ранее транс� пластомного растения S. rickii. Материалы и методы. Растительный мате7 риал. В эксперименте были использованы полу� ченные нами трансформированные растения S. rickii, имеющие в хлоропластах ген ааdА (устой� чивые к стрептомицину и спектиномицину), и ядерные трансгенные растения S. tuberosum сор� тов Луговской и Славянка, имеющие ген nptII (устойчивые к канамицину). Растения выращивали в асептических усло� виях на среде MS [19] без гормонов при 16�ча� совом световом фотопериоде и температуре 22–24 °С. Размножали растения черенковани� ем на той же среде. Выделение и слияние протопластов, культи7 вирование продуктов слияния. Мезофильные протопласты выделяли по методике [20]. Сли� яние протопластов проводили по модифици� рованной методике [21]. Культивирование продуктов слияния осуществляли в жидкой культуральной среде WSS [20] с 2,4�дихлорфе� ноксиуксусной кислотой (0,2 мг/л), нафтил� уксусной кислотой (2 мг/л), бензиламинопу� рином (0,5 мг/л). Антибиотики добавляли в концентрациях 30 мг/л канамицина, 100 мг/л стрептомицина и 50 мг/л спектиномицина. Через 1 сут продукты слияния заплавляли в альгинатную пленку по модифицирован� ной нами методике. Для этого продукты слия� ния центрифугировали в 0,5 М растворе ман� нита, осадок ресуспендировали в этом же рас� творе, добавляли 1 % раствора альгината на� трия в соотношении 1 : 2, перемешивали и по каплям вводили непосредственно в жид� кую среду WSS в чашках Петри. В течение 15–20 мин происходило застывание альгинат� ной пленки. Селекцию гибридных колоний проводили по их способности к биосинтезу хлорофилла на среде, содержащей одновременно три ан� тибиотика. Для индукции морфогенеза использовали последовательную смену сред: STA (SH с до� бавлением бензиламинопурина 0,5 мг/л, наф� тилуксусной кислоты 0,1 мг/л) и STC (SH с зеа� тином 1 мг/л и гибберелловой кислотой 1 мг/л) [22, 23]. Через 1 мес после слияния концентра� ции антибиотиков в культуральной среде по� вышали: канамицина до 50 мг/л, стрептоми� цина до 200 мг/л, спектиномицина до 100 мг/л. Регенеранты укореняли на безгормональной 40 Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 агаризованной среде MS с антибиотиками в той же концентрации. Выделение и молекулярный анализ ДНК. Суммарную ДНК экстрагировали из свежих листьев СТАВ�методом [24]. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе Mastercycler personal 5332 (Eppendorf) с термо� статированной крышкой в пробирках с ультра� тонкими стенками. Реакционная смесь состояла из однократ� ного ПЦР�буфера с сульфатом аммония, 0,2 мкМ соответствующих праймеров, 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфа� тов, 0,5 ед. TaqДНК�полимеразы, 2,0 мМ хло� рида магния, 10–50 нг ДНК�пробы. Общий объем реакцинной смеси составлял 20 мкл. Для подтверждения присутствия гена aadA использовали пару праймеров 5'�catttgtacg� gctccgcagtg�3' и 5'�attttgccggttactgcgctg�3', спе� цифичных к внутренней части гена aadA. Раз� мер амплифицированного с помощью этих праймеров фрагмента составляет 513 п.н. Для подтверждения присутствия гена nptII использовали пару праймеров 5'�cctgaatgaac� tccaggacgaggca�3' и 5'�gctctagatccagagtcccgctca� gaag�3'. Размер амплифицированного с помо� щью этих праймеров фрагмента составляет 622 п.н. Природу хлоропластной ДНК гибридных растений, полученных после слияния, изуча� ли исследованием рестриктных спектров ПЦР�амлифицированного фрагмента хлоро� пластного участка atpH–atpI. Для этого были использованы праймеры 5'�ttgaccaactccaggtc� caa�3' и 5'�ccgcagcttatataggcgaa�3'. Амплифици� рованный фрагмент (1282 п.н.) обрабатывали рестриктазой HaeIII. Продукты реакции раз� деляли с помощью электрофореза в 1,5%�ном агарозном геле. Анализ ядерной ДНК осуществляли с по� мощью одиночного праймера (tcc) �5. Происхождение митохондриальной ДНК регенерировавших растений исследовали с помощью рестриктных спектров митохондри� альных генов ndhI. Для ПЦР�амплификации фрагментов этого гена использовали праймеры 5'�gcattacgatctgcagctca�3' и 5'�gcagctcgattagtttct� gc�3'. Амплифицированный фрагмент (1500 п.н.) обрабатывали рестрикционной эндонук� леазой AluI. Результаты исследований и их обсуждение. В качестве донора трансформированных хлоро� пластов были использованы полученные нами ранее с использованием метода биолистичес� кой трансформации транспластомные растения S. rickii. Они имели в хлоропластах ген aadA. Продукт этого гена, фермент аминогликозид� 3'�аденилтрансфераза, обеспечивает устойчи� вость растений к антибиотикам стрептомицину и спектиномицину. Эти транспластомные рас� тения длительно (более трех лет) культивирова� лись на среде, содержащей 200 мг/л стрептоми� цина и 100 мг/л спектиномицина, при этом стабильно сохраняли зеленую окраску. Другим партнером для слияния были выбраны расте� ния картофеля двух сортов – Луговской и Сла� вянка, которые ранее были трансформированы и содержали в ядерной ДНК ген nptII (Е. Ки� щенко, Институт клеточной биологии и гене� тической инженерии, неопубликованные дан� ные) (рис. 1, а, б). Через 1 сут после слияния культуру смеши� вали с раствором альгината натрия и по кап� лям вводили непосредственно в жидкую среду в чашки Петри. Такой способ иммобилизации протопластов давал возможность получения очень тонкой пленки, что способствовало луч� шему доступу культуральной среды к культи� Рис. 1. Исходные расте� ния (а – S. rickii, б – S. tu� berosum) и микроколонии, полученные после слия� ния протопластов S. rickii и S. tuberosum (в) 41 Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 вируемым клеткам. При этом сокращалось число необходимых манипуляций. Отпадала необходимость использования среды с высо� ким содержанием ионов кальция и последую� щего переноса пленки в жидкую среду. В даль� нейшем по мере роста микроколоний пленку не растворяли, а просто переносили на агари� зованную среду. При культивировании микроколоний (рис. 1, в) селекцию осуществляли по признаку устойчивости одновременно к трем антибиоти� кам – канамицину (ядро S. tuberosum), стрепто� мицину и спектиномицину (хлоропласты S. rickii). Предполагалось, что такая схема селек� ции даст возможность отобрать именно те про� дукты слияния, которые имеют одновременно ген nptII и ген aadA, а значит, ядерную ДНК S. tuberosum и хлоропласты S. rickii. Для селекции продуктов слияния к культу� ральной среде через 11–28 сут добавляли кана� мицин, стрептомицин и спектиномицин. Вве� дение одновременно трех антибиотиков в концентрациях 30 мг/л канамицина, 100 мг/л стрептомицина и 50 мг/л спектиномицина не позднее, чем через 14 сут после слияния, приво� дило к существенному увеличению как коли� чества зеленых колоний, так и регенерировав� ших зеленых растений (таблица). Так, при добавлении антибиотиков через 11–14 сут после слияния изолированных про� топластов S. rickii и S. tuberosum (Луговской) эф� фективность регенерации зеленых растений, которую определяли как отношение количества регенерировавших колоний к первоначально отобранному количеству микроколоний, сос� тавляла 13,25–14,89 %. При увеличении перио� да культивирования продуктов слияния в среде без антибиотиков до 18–28 сут наблюдали зна� чительное снижение эффективности регенера� ции зеленых растений, которая составляла 0,78–1,32 %. Через 2 мес после слияния изолированных протопластов S. rickii и S. tuberosum (Лугов� ской) в четырех экспериментах на среде STA было отобрано 505 зеленых микроколоний, а после слияния изолированных протопластов S. rickii и S. tuberosum (Славянка) – 396 зеле� ных колоний. При дальнейшем культивирова� нии на среде STA с антибиотиками часть зеле� ных колоний погибла. Это может быть связано как с несбаланси� рованностью генома гибридных клеток, так и с недостаточным количеством трансформи� рованных пластид S. rickii в гетеропластидных гибридных клетках. После регенерации на среде STС, содержав� шей одновременно три антибиотика, было по� лучено 252 зеленых растения. Все они имели нормальную морфологию, укоренялись на среде с антибиотиками. По форме листовых пластинок в культуре in vitro часть растений делились на несколько групп – приближаю� щиеся к форме листьев S. tuberosum; прибли� Зависимость эффективности регенерации зеленых растений от длительности роста микроколоний на среде без антибиотиков Длительность роста на среде без антибио� тиков, сут отобран� ных колоний на среде WSS + ant зеленых колоний на среде STA + ant регенери� ровавших колоний на среде STС + ant Эффек� тивность регенера� ции зеле� ных расте� ний, % Количество 11 14 18 28 400 188 256 304 376 109 9 11 53 28 2 4 13,25 14,89 0,78 1,32 Рис. 2. Гибридные расте� ния: а, б – S. rickii � S. tuberosum (Славянка); в – S. rickii � S. tuberosum (Лу� говской) 42 Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 жающиеся к форме листьев S. rickii; промежу� точные (рис. 2). В связи с тем, что исходные растения S. rickii имели ген aadA, который определял устойчи� вость к стрептомицину и спектиномицину, а растения S. tuberosum сортов Славянка и Лу� говской имели ген nptII, который должен был обусловить их устойчивость к канамицину, при слиянии протопластов в условиях селек� тивного давления можно было ожидать регене� рации растений, устойчивых к трем антибиоти� кам, т.е. таких, которые имеют одновременно гены aadA и nptII. Для выявления этих генов в полученных после слияния протопластов растениях был ис� пользован метод полимеразной цепной реак� ции. Для молекулярно�биологических анализов были отобраны 33 гибридные линии, представ� ляющие все характерные фенотипы. Анализ 17 зе� леных растений, полученных после слияния протопластов S. rickii и S. tuberosum сорта Лугов� ской, и 16 зеленых растений, полученных после слияния протопластов S. rickii и S. tuberosum сорта Славянка, показал, что все они имели как ген aadA, так и ген nptII (рис. 3), кроме одного растения S1–117, имевшего только ген aadA. Происхождение пластомного генома опре� деляли при помощи рестриктного анализа участка хлоропластной ДНК между генами atpH и atpI. Изучение природы хлоропластной ДНК растений�регенерантов показало, что они имели последовательности обоих родите� лей (рис. 4), и только у растения S1�117 при� сутствовала хлоропластная ДНК S. rickii. Ядерный геном гибридов изучали с помо� щью одиночного праймера (tcc) � 5. Было по� казано, что изученные растения имели после� довательности ядерной ДНК, характерные как для S. rickii, так и для S. tuberosum (рис. 5). У растения Sl1–117 выявлена только ядерная ДНК S. rickii. При исследовании митохондриального ге� на ndhI оказалось, что его рестриктный спектр преимущественно наследовался или от S. rickii, или от S. tuberosum (рис. 6). Это свидетельству� ет о том, что наследование митохондрий у гиб� ридов происходило случайным образом. Результаты анализов позволяют считать рас� тения, полученные после слияния мезофильных протопластов транспластомного S. rickii и S. Рис. 3. ПЦР�анализ суммарной ДНК на присутствие в гибридах генов aadA (1–4) и nptII (5–8); S.t. – S. tubero� sum, S.r. – S. rickii; S.t.L – картофель, сорт Луговской; S.t.S – картофель, сорт Славянка, М – маркер Рис. 4. Гидролиз амплифицированного фрагмента atpH� atpI хлоропластной ДНК рестриктазой HaeIII. S.r. – S. rickii; S.t.L – картофель, сорт Луговской; S.t.S – картофель, сорт Славянка; 1, 2 – гибридные растения S.r. � S.t.S; 3, 4 – гибридные растения S.r. � S.t.L Рис. 5. ПЦР�анализ ядерного генома с использованием праймера (tcc) � 5: S.t.L – S. tuberosum, сорт Луговской; S.t.S – S. tuberosum, сорт Славянка; S.r. – S. rickii; 1, 2 – гибриды S.r. � S.t.S; 3, 4 – гибриды S.r. � S.t.L Рис. 6. ПЦР�анализ митохондриального генома: S.t.L – S. tuberosum, сорт Луговской; S.t.S –S. tuberosum, сорт Славянка; S.r. – S. rickii; 1, 3 – гибриды S.r. � S.t.S; 2, 4 – гибриды S.r. � S.t.L, М – маркер 43 Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 tuberosum (Славянка и Луговской), соматически� ми гибридами, имеющими последовательности ядерной и хлоропластной ДНК обоих родителей. Только одно из изученных регенерировавших растений имело ядерный и хлоропластный геном исходного S. rickii. Таким образом, можно сделать заключение, что использование селективного давления при наличии у одного из родителей маркерного ге� на в хлоропластах, а у другого в ядерной ДНК дает возможность с большой вероятностью по� лучить гибридные растения, имеющие маркер� ные гены обоих родителей. Проведенные исследования по слиянию мезофильных протопластов показали возмож� ность получения соматических гибридов S. rickii � S. tuberosum. Для достижения этой цели были использованы устойчивые к спектино� мицину и стрептомицину транспластомные растения S. rickii и устойчивые к канамицину трансгенные растения S. tuberosum сортов Сла� вянка и Луговской. Гибридные растения имели ядерный и хлоропластный геном от обоих ро� дителей. Использование при культивировании продуктов слияния и регенерации растений селективных сред, содержащих одновременно канамицин, стрептомицин и спектиномицин, дало возможность с высокой эффективностью отобрать гибридные растения. Присутствие генов aadA и nptII в гибридах было подтвержде� но с помощью ПЦР�анализов. Таким образом метод слияния изолированных протопластов может быть использован для переноса транс� формированных хлоропластов и получения транспластомных растений культурных сортов картофеля. N.A. Matvieieva, A.M. Shakhovsky, N.V. Kuchuk SOMATIC HYBRIDS AMONG TRANSGENIC SOLANUM TUBEROSUM AND TRANSPLASTOMIC SOLANUM RICKII The hybrid plants with transformed plastids were regen� erated after fusion of mesophyll protoplasts of Solanum rickii with aadA chloroplast selective marker gene and Solanum tuberosum with nptII nuclear selective marker gene. The hybrid callus clones were selected on the medium containing streptomycine, spectinоmycine and kanamycine. The hybrids were identified on the base of PCR analysis of nuclear and plastid DNAs. The analysis have shown that regenerated plants were somatic hybrids containing aadA and nptII genes, Solanum rickii and Solanum tuberosum nuclear and chloroplast DNA. Н.А. Матвєєва, А.М. Шаховський, М.В. Кучук СОМАТИЧНІ ГІБРИДИ МІЖ ТРАНСГЕННИМИ РОСЛИНАМИ КАРТОПЛІ SOLANUM TUBEROSUM ТА ТРАНСПЛАСТОМНИМИ РОСЛИНАМИ SOLANUM RICKII Проведено експерименти по злиттю мезофільних протопластів Solanum tuberosum (сортів Луговський та Слов’янка) з геном nptII в ядерній ДНК та отриманої нами раніше транспластомної рослини Solanum rickii з геном aadA. На селективному середовищі, що містило одночасно антибіотики канаміцин, спектиноміцин та стрептоміцин, було отримано гібридні рослини, що ма� ли гени aadA та nptII, хлоропласти S. rickii та S. tubero� sum і гібридний ядерний геном. Ці дані було підтверд� жено результатами ПЦР�аналізів. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших расте� ний. – Киев : Наук. думка, 1997. – 152 с. 2. McBride K.E., Svab Z., Schaaf D.J., Hogan P.S., Stal� ker D.M., Maliga P. Amplification of the chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco // Biotech� nology. – 1995. – 13. – P. 362–365. 3. Daniell H., Datta R., Varma S., Gray S., Lee S.B. Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome // Nature Biotechnol. – 1998. – 16. – P. 345– 348. 4. Svab Z., Hajdukiewicz P., Maliga P. Stable transforma� tion of plastids in higher plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1990. – 87. – P. 8526– 8530. 5. Staub J.M., Maliga P. Expression of chimeric uidA gene indicates that polycistronic mRNAs are efficiently translated in tobacco plastids // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 87. – P. 8526–8530. 6. Golds T., Maliga P., Koop H.�U. Stable plastid transfor� mation in PEG�treated protoplasts of Nicotiana tabacum // Biotechnology. – 1993. – 11. – P. 95–97. 7. Potrykus I., Shillito R.D., Saul M.W., Paszkow� ski J. Direct gene transfer. State of the art and future poten� tial // Plant Mol. Biol. Rep. – 1985. – 3. – P. 117–128. 8. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High veloc� ity microprojectiles for delivering nucleic acids into liv� ing cells // Nature. – 1987. – 327. – P. 70–73. 9. Ruf S., Hermann M., Berger I.J., Carrer H., Bock R. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit // Nature. Biotechnol. – 2001. – 19 (9). – P. 870–875. 10. Skarjinskaia M., Svab Z., Maliga P. Plastid transforma� 44 Н.А. Матвеева, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук tion of L. fendleri, an oilseed Brassicaceae // Transgenic Res. – 2003. –12. – P. 115–122. 11. Zubko M., Zubko E., Van Zuilen K., Meyer P., Duy A. Stable transformation of petunia plastids // Transgenic Res. – 2004. – 13. – Р. 523– 530. 12. Duformantel N., Pelissier B., Garson F. et al. Generation of fertile transplastome soybeen // Plant Mol. Biol. – 2004. – 55. – P. 479–480. 13. Sidorov V.A., Kasten D., Pang S.Z., Hajdukiewicz P.T.J., Staub J.M., Nehra N.S. Stable chloroplast transforma� tion in potato : use of green fluorescent protein as a plastid marker // Plant J. – 1999. – 19 (2). – P. 209– 216. 14. Thant Thi Nguyen et al. Generation of homoplasmic plastid transformants of a commercial cultivar of potato (Solonum tuberosum L.) // Plant Sci. – 2005. – 168. – P. 1495–1500. 15. Матвеева Н.А., Шаховский А.М., Кучук Н.В. Гене� тическая трансформация хлоропластной ДНК Solanum rickii // Цитология и генетика. – 2005. – 39, № 5. – С. 3–9. 16. Матвеева Н.А., Момот В.П., Шаховський А.М., Ку� чук Н.В. Регенерация цибридных растений Lyco� persicon peruvianum (Solanum rickii) с трансформи� рованными хлоропластами // Цитология и генети� ка. – 2005. – 39, № 6. – С. 3–9. 17. Seabrook J.A., Douglass L.K., Tai G.C.C. Segregation for somatic embrygenesis on stem�internode explants from potato seedlings // Plant Cell Tissue and Organ Culture. – 2001. – 65. – P. 69–73. 18. Сытник Е.С., Парий А.Ф., Комарницкий И.К., Гле� ба Ю.Ю., Кучук Н.В. Анализ ядерного и митохонд� риального геномов у транспластомных растений Salpiglossis sinuata, полученных путем переноса трансформированных пластид от цибрида Nicotiana tabacum (+S. sinuata) // Цитология и генетика. – 2003. – 37, № 5. – С. 3–9. 19. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Phys. Plant. – 1962. – 15. – P. 473– 497. 20. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сыт� ник К.М. Соматическая гибридизация паслено� вых. – Киев : Наук. думка, 1985. – 130 c. 21. Menczel L., Nagy F., Kiss Z., Maliga P. Streptomycin resistant and sensitive somatic hybrids of Nicotiana tabacum + Nicotiana knightiana: Correlation of resist� ance to Nicotiana tabacum plastids // Theor. Appl. Genet. – 1981. – 59. – P. 191–195. 22. Shepard J.F., Totten R.E. Mesophyll cell protoplasts of potato // Plant Physiol. – 1977. – 60. – P. 313–316. 23. Shepard J.F. Abscisic acid�enhanced shoot initiation in protoplast�derived calli of potato // Plant Sci. Lett. – 1980. – 18. – P. 334. 24. Дрейпер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений // Генная инженерия растений. – М.: Мир, 1991. – С. 241–245. Поступила 20.03.07 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4

Соматические гибриды между трансгенными растениями картофеля Solanum tuberosum и транспластомными растениями Solanum rickii

Institution

Ähnliche Einträge