Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію
Р2Х3 рецептори експресуються в сенсорних нейронах i вiдповiдають за генерацiю больових сигналiв пiсля активацiї їх АТФ. Вони є перспективними мiшенями для анальгетичних лiкiв, проте до сьогоднi достеменно не вiдома точна структура для сайта зв’язування АТФ. Цей фактор сповiльнює розробку нових спец...
Збережено в:
| Дата: | 2013 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2013
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/85408 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію / Н.С. Петренко, О.А. Кришталь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 2. — С. 144–151. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-85408 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-854082015-08-02T03:01:58Z Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію Петренко, Н.С. Кришталь, О.А. Біологія Р2Х3 рецептори експресуються в сенсорних нейронах i вiдповiдають за генерацiю больових сигналiв пiсля активацiї їх АТФ. Вони є перспективними мiшенями для анальгетичних лiкiв, проте до сьогоднi достеменно не вiдома точна структура для сайта зв’язування АТФ. Цей фактор сповiльнює розробку нових специфiчних лiкiв. За допомогою гомологiчної моделi Р2Х3 рецептора було iдентифiковано амiнокислоту серин 275 з дiлянки так званого “лiвого плавника”, яка розташована бiля iмовiрного сайта зв’язування АТФ i може служити потенцiальним кандидатом, що фiксує агонiст у сайтi зв’язування та впливає на кiнетичнi параметри каналу. Для перевiрки даної гiпотези було сконструйовано декiлька мутантних рецепторiв, де серин 275 було замiнено на амiнокислоти з рiзними гiдропатичними властивостями, а саме S275A, S275V та S275C. За допомогою методики петч клемпу протестовано рiзнi мутанти i виконано порiвняння їх функцiональних властивостей з гiдропатичним iндексом для серину, ала- нiну, валiну, цистеїну. Показано, що серин 275 впливає на процеси десенситизацiї рецептора, ресенситизацiю, ефективнiсть зв’язування агонiстiв та амплiтуду струмiв, що вони генерують. Висловлено припущення, що в дикому типi рецептора серин 275 формує “кришку” для сайта зв’язування шляхом формування водневих зв’язкiв з агонiстом. Таким чином агонiст утримується в сайтi зв’язування, запобiгаючи його швидкiй дисоцiацiї. Зроблено висновок, що серин 275, вiрогiдно, напряму контактує з агонiстом, стимулюючи активацiю рецептора та десенситизацiю. Р2Х3 рецепторы экспрессируются в сенсорных нейронах и отвечают за генерацию болевых сигналов после активации их АТФ. Они являются перспективными мишенями для анальгетических лекарств, однако до сих пор точно не известна точная структура для сайта связывания АТФ. Этот фактор замедляет разработку новых специфических лекарств. С помощью гомологической модели Р2Х3 рецептора была идентифицирована аминокислота серин 275 с участка так называемого “левого плавника”, расположенная возле предполагаемого сайта связывания АТФ и которая может служить потенциальным кандидатом, фиксирующим агонист в сайте связывания и влияющим на кинетические параметры канала. Для проверки данной гипотезы было сконструировано несколько мутантных рецепторов, где серин 275 был заменен на аминокислоты с разными гидропатическими свойствами, а именно S275A, S275V и S275C. С помощью методики пэтч клэмп протестированы различные мутанты и проведено сравнение их функциональных свойств с гидропатическим индексом для серина, аланина, валина, цистеина. Показано, что серин 275 влияет на процессы десенситизации рецептора, ресенситизацию, эффективность связывания агонистов и амплитуду токов, которые они генерируют. Высказано предположение, что в диком типе рецептора серин 275 формирует “крышку” для сайта связывания путем формирования водородных связей с агонистом. Таким образом агонист удерживается в сайте связывания, что предотвращает его быструю диссоциацию. Сделан взвод, что серин 275, вероятно, напрямую контактирует с агонистом, стимулируя активацию рецептора и десенситизацию. P2X3 receptors expressed in sensory neurons are responsible for generation of pain signals after activation by extracellular ATP. P2X3 receptor is a prospective target for analgesic drugs, however, the structure of ATP binding site is not known in such details which can help to design new specific ligands. Using the homology model of P2X3 receptor, we identified serine 275 from the region of socelled “left flipper”, which is located near the hypothetical ATP binding site as a potential candidate for the capture of the agonist in the binding pocket and affects channel kinetic characteristics. To explore this hypothesis, we generated several mutants where serine 275 was substituted with aminoacids with variable hydrophobic properties: S275A, S275V and S275C. Using patch clamp technique we tested these mutants and compared their functional properties with the hydropathy indices for serine, alanine, valine, cysteine. It is shown that serine 275 takes part in the processes of receptor desensitization and resensitization and influences the efficiency of agonist binding and the generated current amplitude. We suggest that serine 275 in the WT P2X3 receptor shapes a cap for the binding pocket, by forming H-bonds with the agonist and, in such way, capturing agonist in the binding site, preventing its fast dissociation. Taken together, our results suggest that serine 275 probably directly interacts with the agonist to promote receptor activation and desensitization. 2013 Article Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію / Н.С. Петренко, О.А. Кришталь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 2. — С. 144–151. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/85408 577.352 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Петренко, Н.С. Кришталь, О.А. Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію Доповіді НАН України |
| description |
Р2Х3 рецептори експресуються в сенсорних нейронах i вiдповiдають за генерацiю больових сигналiв пiсля активацiї їх АТФ. Вони є перспективними мiшенями для анальгетичних лiкiв, проте до сьогоднi достеменно не вiдома точна структура для сайта
зв’язування АТФ. Цей фактор сповiльнює розробку нових специфiчних лiкiв. За допомогою гомологiчної моделi Р2Х3 рецептора було iдентифiковано амiнокислоту серин 275
з дiлянки так званого “лiвого плавника”, яка розташована бiля iмовiрного сайта зв’язування АТФ i може служити потенцiальним кандидатом, що фiксує агонiст у сайтi зв’язування та впливає на кiнетичнi параметри каналу. Для перевiрки даної гiпотези було сконструйовано декiлька мутантних рецепторiв, де серин 275 було замiнено на амiнокислоти з рiзними гiдропатичними властивостями, а саме S275A, S275V та
S275C. За допомогою методики петч клемпу протестовано рiзнi мутанти i виконано
порiвняння їх функцiональних властивостей з гiдропатичним iндексом для серину, ала-
нiну, валiну, цистеїну. Показано, що серин 275 впливає на процеси десенситизацiї рецептора, ресенситизацiю, ефективнiсть зв’язування агонiстiв та амплiтуду струмiв, що вони генерують. Висловлено припущення, що в дикому типi рецептора серин 275 формує “кришку” для сайта зв’язування шляхом формування водневих зв’язкiв з агонiстом.
Таким чином агонiст утримується в сайтi зв’язування, запобiгаючи його швидкiй дисоцiацiї. Зроблено висновок, що серин 275, вiрогiдно, напряму контактує з агонiстом, стимулюючи активацiю рецептора та десенситизацiю. |
| format |
Article |
| author |
Петренко, Н.С. Кришталь, О.А. |
| author_facet |
Петренко, Н.С. Кришталь, О.А. |
| author_sort |
Петренко, Н.С. |
| title |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| title_short |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| title_full |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| title_fullStr |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| title_full_unstemmed |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| title_sort |
вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' р2х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/85408 |
| citation_txt |
Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію / Н.С. Петренко, О.А. Кришталь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 2. — С. 144–151. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT petrenkons vplivmutacíjserinu275zlívogoplavnikar2h3receptoranapokaznikiaktivacííkanalutadesensitizacíû AT krištalʹoa vplivmutacíjserinu275zlívogoplavnikar2h3receptoranapokaznikiaktivacííkanalutadesensitizacíû |
| first_indexed |
2025-07-06T12:37:20Z |
| last_indexed |
2025-07-06T12:37:20Z |
| _version_ |
1836901142521446400 |
| fulltext |
УДК 577.352
Н.С. Петренко, академiк НАН України О. А. Кришталь
Вплив мутацiй серину 275 з “лiвого плавника” Р2Х3
рецептора на показники активацiї каналу
та десенситизацiю
Р2Х3 рецептори експресуються в сенсорних нейронах i вiдповiдають за генерацiю бо-
льових сигналiв пiсля активацiї їх АТФ. Вони є перспективними мiшенями для аналь-
гетичних лiкiв, проте до сьогоднi достеменно не вiдома точна структура для сайта
зв’язування АТФ. Цей фактор сповiльнює розробку нових специфiчних лiкiв. За допомо-
гою гомологiчної моделi Р2Х3 рецептора було iдентифiковано амiнокислоту серин 275
з дiлянки так званого “лiвого плавника”, яка розташована бiля iмовiрного сайта зв’я-
зування АТФ i може служити потенцiальним кандидатом, що фiксує агонiст у сайтi
зв’язування та впливає на кiнетичнi параметри каналу. Для перевiрки даної гiпоте-
зи було сконструйовано декiлька мутантних рецепторiв, де серин 275 було замiнено
на амiнокислоти з рiзними гiдропатичними властивостями, а саме S275A, S275V та
S275C. За допомогою методики петч клемпу протестовано рiзнi мутанти i виконано
порiвняння їх функцiональних властивостей з гiдропатичним iндексом для серину, ала-
нiну, валiну, цистеїну. Показано, що серин 275 впливає на процеси десенситизацiї рецеп-
тора, ресенситизацiю, ефективнiсть зв’язування агонiстiв та амплiтуду струмiв, що
вони генерують. Висловлено припущення, що в дикому типi рецептора серин 275 фор-
мує “кришку” для сайта зв’язування шляхом формування водневих зв’язкiв з агонiстом.
Таким чином агонiст утримується в сайтi зв’язування, запобiгаючи його швидкiй ди-
соцiацiї. Зроблено висновок, що серин 275, вiрогiдно, напряму контактує з агонiстом,
стимулюючи активацiю рецептора та десенситизацiю.
Однiєю з найбiльш iнтригуючих функцiй зовнiшньоклiтинної АТФ є її роль у процесi iнi-
цiацiї та передачi больового сигналу шляхом активацiї пуринергiчних рецепторiв Р2Х3 [1].
Периферичнi АТФ-активованi Р2Х3 рецептори вiдiграють вирiшальну роль при ушкоджен-
нi тканин та їх запаленнi. АТФ-генерованi Р2Х3 рецептори експресуються в ноцицептивних
нейронах i є перспективними мiшенями для анальгетичних лiкiв [2].
Явище довготривалої десенситизацiї є характерною особливiстю Р2Х3 рецепторiв, за-
лучених до процесiв передачi больових сигналiв [3, 4]. Десенситизацiя — це iнактивацiя
рецептора при довготривалiй присутностi агонiста, i виникає вона пiсля активацiї каналу
внаслiдок прикрiплення агонiста до сайта зв’язування. Розвиток десенситизацiї залежить
вiд рiвня дисоцiацiї агонiста iз сайта зв’язування.
Нещодавно була опублiкована кристалiчна структура для Р2Х4 рецептора, у якiй кожна
з трьох субодиниць рецептора зображена у виглядi дельфiна, що виринає з океану (оке-
ан-плазматична мембрана) [5, 6]. Цiкавою дiлянкою в данiй структурi є так званий “лiвий
плавник” — петля, яка направлена в iмовiрний сайт зв’язування АТФ та бере участь у вза-
ємодiях субодиниця–субодиниця i, вiдповiдно, може вiдiгравати важливу роль у конформа-
цiйних змiнах пiд час зв’язування агонiста. Проте механiзм та структура сайта зв’язування
для АТФ ще досi точно не встановленi. Оскiльки багато з пуринових рецепторiв задiянi
у процесах болю опосередковано з їх активацiєю АТФ, то розумiння вищенаведених явищ
© Н.С. Петренко, О.А. Кришталь, 2013
144 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №2
дало б можливiсть розробити анальгетичнi препарати, якi б усували або зменшували участь
пуринергiчних рецепторiв у механiзмах iнiцiацiї та передачi болю.
На основi гомологiчної моделi Р2Х3 рецептора була висунута гiпотеза про важливiсть
ролi серину 275 у процесах взаємодiї з агонiстом, активацiї та десенситизацiї. Тому нами,
за допомогою методу петч клемпу та мутагенезу було експериментально дослiджено роль
амiнокислоти серину 275 з “лiвого плавника” на параметри функцiонування Р2Х3 рецеп-
тора.
Методи. Плазмiди та трансфекцiя. Для трансфекцiї використовували плазмiди, що
мiстили рецептор Р2Х3 у комбiнацiї з зеленим флуоресцентним бiлком (enhanced green
fluorescent protein (GFP)). Ген Р2Х3 рецептора щура було субклоновано у pIRES2-EGFP
(“Clontech”, США). Рецептори з одноточковою мутацiєю були сконструйованi за допомо-
гою полiмеразно-ланцюгової реакцiї з використанням специфiчних олiгонуклеотидних прай-
мерiв, що перекриваються (синтезовано “VBC-Genomics”, Австрiя), та сайт-направленого
мутагенезного комплекту “QuikChange II (“Stratagene”, США) i P2X3/pIRES2-EGFP як
матрицi. Правильнiсть послiдовностi перевiряли. Для вiзуалiзацiї трансфекованих клiтин
у флуоресцентному мiкроскопi застосовували зелений флуоресцентний бiлок (GFP). В екс-
периментах використовували дикий тип рецептора Р2Х3 (далi WT) та рецептори, мутованi
в позицiї серин 275 на аланiн (S275A), цистеїн (S275C) або валiн (S275V). Такi мутацiї були
вибранi з огляду на гiдрофобнi властивостi амiнокислот (гiдропатичний iндекс або iндекс
гiдрофобностi) та структуру їх бiчного ланцюга. Iндекс гiдрофобностi амiнокислоти — це
число, що характеризує гiдрофобнi чи гiдрофiльнi властивостi її бiчного ланцюга. Чим
бiльше число гiдрофобного iндексу, тим бiльш гiдрофобною є амiнокислота. Найбiльш гiд-
рофобною є амiнокислота iзолейцин (4,5) та валiн (4,2). Найбiльш гiдрофiльною є аргiнiн
(−4,5) та лiзин (−3,9).
Електрофiзiологiя. Для дослiдження властивостей рекомбiнантних рецепторiв Р2Х3 ви-
користовували лiнiю клiтин HEK293. HEK293 були трансфекованi 2000 нг плазмiдної ДНК
за допомогою FuGENE 6 (“Roche Diagnostics”, США). Дослiди проводили за методикою петч
клемпу в конфiгурацiї “цiла клiтина” iз застосуванням пiдсилювача HEKA PC-10 (“HEKA
Elektronik”). Клiтини постiйно омивали (3 мл/хв) фiзiологiчним розчином, що мiстив, мМ:
NaCl 152, KCl 2,5, глюкозу 10, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10 (pH доведено до 7,4 за допомо-
гою NaOH). Склянi мiкропiпетки виготовляли з легкоплавких капiлярiв дiаметром 1,5 мм.
Дiаметр отвору в кiнчику пiпетки становив 2–3 мкм. Опiр отриманих пiпеток становив
3–5 МОм [7]. Пiпетки заповнювали розчином такого складу, мМ: CsCl 130, EGTA 5, CaCl2
0,5, MgCl2 5, K2ATФ 5, NaГTФ 0,5 та HEPES 10 (pH доведено до 7,2 за допомогою CsOH).
Осмолярнiсть внутрiшньопiпеткового розчину доводили до 290 мОсм.
Вiзуалiзацiю трансфекованих клiтин здiйснювали за допомогою флуоресцентного iнвер-
тованого мiкроскопа IX-71 Olympus з фiльтрами та розташованої на ньому 175 В ксенонової
лампи. Пiдтримуваний потенцiал становив −70 мВ. Данi аналiзували, використовуючи про-
граму FitMaster (“HEKA Elektronik”) та Origin 8.0 (“Microcal”, США).
Аплiкацiйна система. У дослiдженнях використовували агонiсти Р2Х3 рецепторiв
α, β-меАТФ та АТФ (придбанi у “Sigma-Aldrich”), якi розчиняли у фiзiологiчному розчи-
нi до фiнальної концентрацiї перед експериментом. Аплiкацiю агонiстiв (час змiни розчи-
ну 20–40 мс) здiйснювали за допомогою швидкої перфузiйної системи RSC-200 (“BioLogic
Science Instruments”).
Аналiз даних. Данi наведено як середнє значення ± стандартна похибка (SE ) середнього
(n — число клiтин). Статистичну достовiрнiсть оцiнено за допомогою t-тесту Стьюдента для
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №2 145
Рис. 1. Порiвняння впливу рiзних неполярних амiнокислот у позицiї 275 на параметр ЕС50 в рецепторi Р2Х3.
На графiку наведенi змiни в значеннях ЕС50 для АТФ (1 ) та α, β-меАТФ (2 ) як функцiя гiдропатичного
iндексу. Лiнiйне апроксимування застосовувалося для S275 (Ser), S275A (Ala) та S275V (Val). Зауважимо, що
ЕС50 для S275C (Cys) не використовувався в апроксимуваннi (окресленi штриховою лiнiєю). Данi отриманi
з 4–10 клiтин
параметричних даних чи тесту Манна–Уїтнi для непараметричних даних з використанням
GraphPad Prism 4.03 (“GraphPadSoftware Inc.”, США) або Origin 8.0 (“Microcal”). Рiвень
значущостi P < 0,05 був обраний за iндикатор достовiрної рiзницi.
Результати. Сумарнi графiки, що описують результати рiзних замiн серину 275 у Р2Х
рецепторi, наведенi на рис. 1–4. Спочатку проводилися експерименти, в результатi яких бу-
146 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №2
Рис. 2. Порiвняння струмiв рiзних мутантiв, викликаних прикладаннямα, β-меАТФ у концентрацiї 100 мкМ.
а — приклади α, β-меАТФ струмiв у WT (Ser), S275A (Ala), S275C (Cys) та S275 V (Val); б — сигмоїда,
що сполучає точки максимального струму, iндукованого 100 мкM α, β-меАТФ у S275, S275A, S275C та
S275V формах. Результати нормалiзованi до вiдповiдей, iндукованих 100 мкM АТФ. Данi отриманi з 4–10
клiтин
ли побудованi кривi доза–ефект для α, β-меАТФ та АТФ у дикому типi рецептора та трьох
мутантах i обчисленi значення ЕС50 (рис. 1, а–г). В рядi мутантних рецепторiв з вмiстом
серин–аланiн–валiн параметр EC50 для α, β-меАТФ лiнiйно зростав, пропорцiйно до значень
гiдропатичного iндексу амiнокислот. Збiльшення значень ЕС50 говорить про пiдвищення по-
рогу активацiї рецептора для того чи iншого агонiста (див. рис. 1, д). Мутацiя серину на
цистеїн пiдвищила порiг активацiї бiльше, нiж аналогiчна мутацiя з валiном (проте гiдропа-
тичний iндекс цистеїну менший за такий для валiну (див. рис. 1, в, г). Подiбнi результати
отриманi i для АТФ (див. рис. 1).
Наступним кроком було порiвняння струмiв рiзних мутантiв, викликаних прикладан-
ням α, β-меАТФ у концентрацiї 100 мкM на 2 с (рис. 2). Амплiтуда струмiв для α, β-меАТФ
(як процентна частка вiд вiдповiдей на прикладання 100 мкM АТФ) зменшувалася в рядi
серин–аланiн–цистеїн–валiн з рiзким зниженням амлiтуди для найбiльш гiдрофобних амi-
нокислот: цистеїну i валiну (див. рис. 2, б ).
За рахунок змiщення параметра ЕС50 у правий бiк кривої доза–ефект для α, β-меАТФ
та АТФ у концентрацiї 100 мкМ кiнетичнi параметри активацiї та деактивацiї струмiв були
також сповiльненi. Стала часу десенситизацiї зростала монотонно (рис. 3). Так, у дикому
типi рецептора, що представлений серином у позицiї 275, струм швидше переходив у де-
сенситизований стан порiвняно з мутантом S275A. На противагу дикому типу рецептора,
в мутантному S275A рiвень десенситизацiї був значно змiненим: час спаду струму був спо-
вiльнений у 13 разiв для α, β-меАТФ (n = 10), у 2 рази для АТФ (n = 8) порiвняно з WT.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №2 147
Рис. 3. Порiвняння впливу рiзних неполярних амiнокислот у позицiї 275 на процес iнiцiацiї десенситизацiї
в рецепторi Р2Х3. На графiку наведенi змiни в значеннях константи часу спаду струму для АТФ (1 ) та
α, β-меАТФ (2 ) як функцiя гiдропатичного iндексу для S275, S275A, S275C та S275V. Данi отриманi з 4–10
клiтин
Рис. 4. Порiвняння впливу рiзних неполярних амiнокислот у позицiї 275 на процес вiдновлення з десенси-
тизацiї рецептора Р2Х3. а — на графiку наведенi значення вiдновлення з десенситизацiї (данi 10 с парного
протоколу, як частка вiд першого тестового струму) для АТФ (1 ) та α, β-меАТФ (2 ) як функцiя гiдропа-
тичного iндексу для S275, S275A, S275C та S275V, зауважимо лiнiйний характер функцiї апроксимування;
б — приклади парних протоколiв з 10 с iнтервалом для АТФ. Данi отриманi з 4–10 клiтин
У мутантних рецепторах S275C та S275V процес iнiцiацiї десенситизацiї був ще бiльш спо-
вiльнений (див. рис. 3).
Для дослiдження процесу вiдновлення рецептора з десенситизацiї також були використа-
нi парнi протоколи. Пiсля отримання першого тестового струму другий запис генерувався
з iнтервалом в 10 с для агонiстiв α, β-меАТФ та АТФ в дикому та мутантних типах рецепто-
рiв. I час, потрiбний для вiдновлення рецептора, зменшувався майже лiнiйно, корелюючи
з гiдропатичним iндексом (рис. 4).
Обговорення результатiв. Базуючись на даних дослiджень гомологiчної моделi Р2Х3
рецептора щура, була iдентифiкована амiнокислота серин 275, що розташована у “лiвому
плавнику” в межах ектодомену, як один з найважливiших учасникiв сайта зв’язування аго-
нiста. Вiдповiдно до наших припущень були проведенi експерименти з тестування декiлькох
148 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №2
мутантiв серину в позицiї 275 i була пiдтверджена важлива роль цiєї амiнокислоти у фор-
муваннi десенситизацiї i чутливостi до АТФ та α, β-меАТФ.
Р2Х3 рецептори активуються рiзними агонiстами, в тому числi α, β-меАТФ [4, 8, 9],
що активний лише у Р2Х1 та Р2Х3 рецепторах [10]. Зважаючи на це, ми протесту-
вали α, β-меАТФ та АТФ, що були повними агонiстами дикого типу рецептора Р2Х3.
Проте в мутантному рецепторi S275А α, β-меАТФ став лише частковим агонiстом. Тести
з α, β-меАТФ, проведенi на мутантних рецепторах S275C та S275V, показали ще бiльш зна-
чнi зменшення в амплiтудi струмiв. Виходячи з цього, можна припустити, що бiчний ланцюг
серину 275 вiдiграє важливу роль у зв’язуваннi агонiста, особливо α, β-меАТФ. Це можна
пояснити наявнiстю розташованих поряд позитивно заряджених залишкiв амiнокислот, що
були iдентифiкованi в попереднiх дослiдженнях i якi залученi до зв’язування агонiста [5, 11].
Важливо, що, на противагу серину 275, сусiднiй серин 269 не бере участi у зв’язуваннi аго-
нiстiв [12, 13]. Це узгоджується з його периферiйним розташуванням на зовнiшнiй частинi
бiлка в гомологiчнiй моделi.
Поряд зi збiльшеним значенням показника ЕС50 ми також виявили, що в мутантному
рецепторi S275А час наростання струму до пiкового значення, активований α, β-меАТФ, був
довшим, нiж у дикому типi рецептора. Це може бути пов’язано з бiльш слабким зв’язува-
нням агонiста чи швидкою дисоцiацiєю. Тому можна припустити, що в рецепторах, в яких
вiдсутнiй серин 275, треба бiльше часу для зв’язування агонiста в сайтi та перенесення
конформацiйних змiн у трансмембранну зону для вiдкриття каналу.
Вiдмiнностi у властивостях десенситизацiї були ще бiльш значними в дикому типi Р2Х3
порiвняно з мутантними рецепторами. У мутантних рiзновидах здатнiсть рецептора до де-
сенситизацiї була зменшена пiд впливом усiх агонiстiв, тодi як у дикому типi вони швидко
десенситизували рецептор. Така слабка активнiсть агонiстiв у мутантних рецепторах може
бути пов’язана повiльним зв’язуванням чи швидкою дисоцiацiєю.
Дослiдити процес дисоцiацiї агонiста з рецептора на завжди вдається за допомогою
електрофiзiологiчного обладнання. Проте оскiльки у Р2Х3 рецепторi дисоцiацiя агонiста —
це обмежуючий фактор повiльного вiдновлення з десенситизацiї, то рiвень дисоцiацiї мож-
на оцiнити, використовуючи так званi парнi протоколи для струму [4]. З використанням
даних протоколiв ми показали, що для мутантних рецепторiв вiдновлення з десенситизацiї
вiдбувалося набагато швидше. Це свiдчить про те, що дисоцiацiя агонiста здiйснюється на-
багато швидше, коли “лiвий плавник” модифiкований i бiчний ланцюг серину 275 вiдсутнiй.
Ми припускаємо, що у WT агонiст зазвичай перебуває в пастцi, нiби прикритий так званим
“лiвим плавником” на входi до сайта зв’язування. Таким чином, “лiвий плавник” може слу-
жити “кришкою”, в якiй бiчний ланцюг S275 знаходиться в контактi з лiгандною молекулою,
перешкождаючи її швидкiй дисоцiацiї. Коли ми замiнили серин на аланiн, ефективiсть “кри-
шки” зменшилася внаслiдок вiдсутностi полярної групи в аланiну, що, вiрогiдно, бере участь
у формуваннi водневого зв’язку з агонiстом. Можливо, що, застосовуючи бiльш гiдрофобнi
та громiздкi амiнокислоти, такi як цистеїн та валiн, ми забезпечили додатковi стеричнi вза-
ємодiї з певними агонiстами (α, β-меАТФ), i це пояснює статистично достовiрне зниження
амплiтуди струму в мутантних рецепторах S275C та S275V. Наведенi результати свiдчать
про можливiсть полярної взаємодiї мiж бiчним ланцюгом серину 275 та молекулою агонiста.
Таким чином, показано, що серин 275 вiдiграє важливу роль в процесах зв’язуван-
ня/вивiльнення агонiстiв iз сайта зв’язування рецептора шляхом закриття входу до сайта,
опосередкованого бiчним ланцюгом серину 275. Висунуто гiпотезу про те, що серин 275
може безпосередньо взаємодiяти з АТФ та його аналогами, контролювати рiвень асоцiацiї
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №2 149
та дисоцiацiї агонiстiв, що обумовлюють такi характеристики, як десенситизацiя та показ-
ники активацiї каналу тощо.
1. Burnstock G., Wood J. N. Purinergic receptors: their role in nociception and primary afferent neurotransmis-
sion // Curr. Opin. Neurobiol. – 1996. – 6, No 4. – P. 526–532.
2. North R. A. The P2X3 subunit: a molecular target in pain therapeutics // Curr. Opin. Investig. Drugs. –
2003. – 4, No 7. – P. 833–840.
3. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors // Physiol Rev. – 2002. – 82, No 4. – P. 1013–1067.
4. Sokolova E., Skorinkin A., Moiseev I. et al. Experimental and modeling studies of desensitization of P2X3
receptors // Mol. Pharmacol. – 2006. – 70, No 1. – P. 373–382.
5. Kawate T., Michel J. C., Birdsong W.T. et al. Crystal structure of the ATP-gated P2X(4) ion channel in
the closed state // Nature. – 2009. – 460, No 7255. – P. 592–598.
6. Hattori M., Gouaux E. Molecular mechanism of ATP binding and ion channel activation in P2X receptors //
Nature. – 2012. – 485, No 7397. – P. 207–212.
7. Sakmann B., Neher E. Single-channel recording. – New York etc.: Springer Science+Business Media, LLC,
2009. – 700 p.
8. North R.A., Surprenant A. Pharmacology of cloned P2X receptors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. –
2000. – 40, No 563–80. – P. 563–580.
9. Sokolova E., Skorinkin A., Fabbretti E. et al. Agonist-dependence of recovery from desensitization of
P2X(3) receptors provides a novel and sensitive approach for their rapid up or downregulation // Brit.
J. Pharmacol. – 2004. – 141, No 6. – P. 1048–1058.
10. Evans R. J. Structural interpretation of P2X receptor mutagenesis studies on drug action // Ibid. – 2010. –
161, No 5. – P. 961–971.
11. Khakh B. S., North R.A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease // Nature. –
2006. – 442, No 7102. – P. 527–532.
12. Stanchev D., Flehmig G., Gerevich Z. et al. Decrease of current responses at human recombinant P2X3
receptors after substitution by Asp of Ser/Thr residues in protein kinase C phosphorylation sites of their
ecto-domains // Neurosci. Lett. – 2006. – 393, No 1. – P. 78–83.
13. Petrenko N., Khafizov K., Tvrdonova V. et al. Role of the ectodomain serine 275 in shaping the binding
pocket of the ATP-gated P2X3 receptor // Biochemistry. – 2011. – 50, No 39. – P. 8427–8436.
Надiйшло до редакцiї 08.10.2012Мiжнародний центр молекулярної фiзiологiї
НАН України, Київ
А. I. Вiртанен Iнститут молекулярних наук,
Куопiо, Фiнляндiя
Н.С. Петренко, академик НАН Украины О.А. Кришталь
Влияние мутаций серина 275 с “левого плавника” Р2Х3 рецептора
на показатели активации канала и десенситизацию
Р2Х3 рецепторы экспрессируются в сенсорных нейронах и отвечают за генерацию болевых
сигналов после активации их АТФ. Они являются перспективными мишенями для анальге-
тических лекарств, однако до сих пор точно не известна точная структура для сайта свя-
зывания АТФ. Этот фактор замедляет разработку новых специфических лекарств. С помо-
щью гомологической модели Р2Х3 рецептора была идентифицирована аминокислота серин
275 с участка так называемого “левого плавника”, расположенная возле предполагаемого
сайта связывания АТФ и которая может служить потенциальным кандидатом, фикси-
рующим агонист в сайте связывания и влияющим на кинетические параметры канала. Для
проверки данной гипотезы было сконструировано несколько мутантных рецепторов, где се-
рин 275 был заменен на аминокислоты с разными гидропатическими свойствами, а именно
S275A, S275V и S275C. С помощью методики пэтч клэмп протестированы различные му-
150 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №2
танты и проведено сравнение их функциональных свойств с гидропатическим индексом для
серина, аланина, валина, цистеина. Показано, что серин 275 влияет на процессы десенси-
тизации рецептора, ресенситизацию, эффективность связывания агонистов и амплитуду
токов, которые они генерируют. Высказано предположение, что в диком типе рецепто-
ра серин 275 формирует “крышку” для сайта связывания путем формирования водородных
связей с агонистом. Таким образом агонист удерживается в сайте связывания, что пре-
дотвращает его быструю диссоциацию. Сделан взвод, что серин 275, вероятно, напрямую
контактирует с агонистом, стимулируя активацию рецептора и десенситизацию.
N. S. Petrenko, Academician of the NAS of Ukraine O.O. Krishtal
Effect of serine 275 mutations from the “left flipper” of P2X3 receptor
on the receptor activation and desensitization
P2X3 receptors expressed in sensory neurons are responsible for generation of pain signals after
activation by extracellular ATP. P2X3 receptor is a prospective target for analgesic drugs, however,
the structure of ATP binding site is not known in such details which can help to design new specific
ligands. Using the homology model of P2X3 receptor, we identified serine 275 from the region of so-
celled “left flipper”, which is located near the hypothetical ATP binding site as a potential candidate
for the capture of the agonist in the binding pocket and affects channel kinetic characteristics.
To explore this hypothesis, we generated several mutants where serine 275 was substituted with
aminoacids with variable hydrophobic properties: S275A, S275V and S275C. Using patch clamp
technique we tested these mutants and compared their functional properties with the hydropathy
indices for serine, alanine, valine, cysteine. It is shown that serine 275 takes part in the processes
of receptor desensitization and resensitization and influences the efficiency of agonist binding and
the generated current amplitude. We suggest that serine 275 in the WT P2X3 receptor shapes a cap
for the binding pocket, by forming H-bonds with the agonist and, in such way, capturing agonist in
the binding site, preventing its fast dissociation. Taken together, our results suggest that serine 275
probably directly interacts with the agonist to promote receptor activation and desensitization.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №2 151
|