Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату
Бiлковi комплекси фотосинтетичних мембран хлоропластiв шпинату були роздiленi методом нативного електрофорезу iз змiщенням заряду пiсля солюбiлiзацiї мембран неiонним детергентом дигiтонiном. Для визначення зон гелю, якi мiстили АТФ-синтазний комплекс i його вiдокремлену каталiтичну частину (CF₁),...
Збережено в:
| Дата: | 2014 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2014
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/87829 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн, О.К. Золотарьова // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 6. — С. 151-155. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-87829 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-878292015-10-27T03:02:08Z Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату Семеніхін, А.В. Золотарьова, О.К. Біохімія Бiлковi комплекси фотосинтетичних мембран хлоропластiв шпинату були роздiленi методом нативного електрофорезу iз змiщенням заряду пiсля солюбiлiзацiї мембран неiонним детергентом дигiтонiном. Для визначення зон гелю, якi мiстили АТФ-синтазний комплекс i його вiдокремлену каталiтичну частину (CF₁), була використана кольорова реакцiя на АТФазну активнiсть. Цитохромному b₆f комплексу тилакоїдiв вiдповiдала зона, яка завдяки присутностi цитохромiв мала червоний колiр у нефарбованому гелi. Локалiзацiя цитохромного b₆f комплексу, АТФ-синтази i CF₁ пiдтверджена аналiзом субодиничного складу вiдповiдних бiлкових зон пiсля ДДС-електрофорезу. Визначення карбоангiдразної активностi в бiлкових зонах неденатурованого гелю шляхом фарбування бромтимоловим синiм показало, що крiм фотосистеми II, яка мiстить компоненти з карбоангiдразною активнiстю, карбоангiдраза асоцiйована також цитохромним b₆f комплексом i АТФ-синтазою. Наведенi данi свiдчать на користь припущення про участь множинних форм карбоангiдрази у внутрiшньотилакоїдному перенесеннi протонiв вiд центрiв їх утворення до АТФ-синтази. Белковые комплексы фотосинтетических мембран хлоропластов шпината были разделены методом нативного электрофореза со смещением заряда после их солюбилизации неионным детергентом дигитонином. Для определения зон геля, содержащих АТФ-синтазный комплекс и его каталитическую часть (CF₁), была использована цветная реакция на АТФазную активность. Цитохромному b₆f комплексу тилакоидов соответствовала зона, которая из-за наличия цитохромов имела красную окраску в неокрашенном геле. Локализация цитохромного b₆f комплекса, АТФ-синтазы и CF₁ подтверждена анализом субъединичного состава соответствующих белковых зон после ДДС-электрофореза. Определение карбоангидразной активности в белковых зонах неденатурированного геля цветной реакцией с бромтимоловым синим показало, что кроме фотосистемы II, которая содержит компоненты с карбоангидразной активностью, карбоангидраза ассоциирована также с цитохромным комплексом b₆f и АТФ-синтазой. Приведенные данные свидетельствуют в пользу предположения об участии множественных форм карбоангидразы во внутритилакоидном переносе протонов от центров их образования к АТФ-синтазе. Protein complexes of photosynthetic membranes of spinach chloroplasts were separated by native charge shift electrophoresis after the solubilization of membranes by a non-ionic detergent digitonin. To determine the areas of the gel that contained the ATP synthase complex and its isolated catalytic part (CF₁), the color reaction for ATFase activity was used. Due to the presence of cytochromes, the b₆f thylakoid membrane complex was red in the unstained gel. The localization of cytochrome b₆f complex, ATP synthase, and CF₁ was confirmed by the subunit analysis of the corresponding protein zones by SDS-electrophoresis. Using nondenaturing electrophoresis followed by detection of carbonic anhydrase (CA) activity in the gel stained with bromothymol blue, the following carriers of CA were detected: photosystem II, cytochrome b₆f complex, and ATP synthase. The data favor the assumption that multiple forms of thylakoid carbonic anhydrase take part in the internal proton transfer from the centers of their evolution to the ATP synthase. 2014 Article Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн, О.К. Золотарьова // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 6. — С. 151-155. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/87829 577.355.3 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біохімія Біохімія |
| spellingShingle |
Біохімія Біохімія Семеніхін, А.В. Золотарьова, О.К. Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату Доповіді НАН України |
| description |
Бiлковi комплекси фотосинтетичних мембран хлоропластiв шпинату були роздiленi
методом нативного електрофорезу iз змiщенням заряду пiсля солюбiлiзацiї мембран неiонним детергентом дигiтонiном. Для визначення зон гелю, якi мiстили АТФ-синтазний комплекс i його вiдокремлену каталiтичну частину (CF₁), була використана кольорова реакцiя на АТФазну активнiсть. Цитохромному b₆f комплексу тилакоїдiв вiдповiдала зона, яка завдяки присутностi цитохромiв мала червоний колiр у нефарбованому гелi. Локалiзацiя цитохромного b₆f комплексу, АТФ-синтази i CF₁ пiдтверджена аналiзом субодиничного складу вiдповiдних бiлкових зон пiсля ДДС-електрофорезу.
Визначення карбоангiдразної активностi в бiлкових зонах неденатурованого гелю шляхом фарбування бромтимоловим синiм показало, що крiм фотосистеми II, яка мiстить компоненти з карбоангiдразною активнiстю, карбоангiдраза асоцiйована також цитохромним b₆f комплексом i АТФ-синтазою. Наведенi данi свiдчать на користь припущення про участь множинних форм карбоангiдрази у внутрiшньотилакоїдному перенесеннi протонiв вiд центрiв їх утворення до АТФ-синтази. |
| format |
Article |
| author |
Семеніхін, А.В. Золотарьова, О.К. |
| author_facet |
Семеніхін, А.В. Золотарьова, О.К. |
| author_sort |
Семеніхін, А.В. |
| title |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| title_short |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| title_full |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| title_fullStr |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| title_full_unstemmed |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| title_sort |
ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2014 |
| topic_facet |
Біохімія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/87829 |
| citation_txt |
Ідентифікація карбоангідразної активності, асоційованої з білковими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн, О.К. Золотарьова // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 6. — С. 151-155. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT semeníhínav ídentifíkacíâkarboangídraznoíaktivnostíasocíjovanoízbílkovimikompleksamifotosintetičnihmembranhloroplastívšpinatu AT zolotarʹovaok ídentifíkacíâkarboangídraznoíaktivnostíasocíjovanoízbílkovimikompleksamifotosintetičnihmembranhloroplastívšpinatu |
| first_indexed |
2025-07-06T15:29:58Z |
| last_indexed |
2025-07-06T15:29:58Z |
| _version_ |
1836912003589865472 |
| fulltext |
УДК 577.355.3
А.В. Семенiхiн, О. К. Золотарьова
Iдентифiкацiя карбоангiдразної активностi, асоцiйованої
з бiлковими комплексами фотосинтетичних мембран
хлоропластiв шпинату
(Представлено членом-кореспондентом НАН України Є.Л. Кордюм)
Бiлковi комплекси фотосинтетичних мембран хлоропластiв шпинату були роздiленi
методом нативного електрофорезу iз змiщенням заряду пiсля солюбiлiзацiї мембран не-
iонним детергентом дигiтонiном. Для визначення зон гелю, якi мiстили АТФ-синтаз-
ний комплекс i його вiдокремлену каталiтичну частину (CF1), була використана ко-
льорова реакцiя на АТФазну активнiсть. Цитохромному b6f комплексу тилакоїдiв вiд-
повiдала зона, яка завдяки присутностi цитохромiв мала червоний колiр у нефарбова-
ному гелi. Локалiзацiя цитохромного b6f комплексу, АТФ-синтази i CF1 пiдтвердже-
на аналiзом субодиничного складу вiдповiдних бiлкових зон пiсля ДДС-електрофорезу.
Визначення карбоангiдразної активностi в бiлкових зонах неденатурованого гелю шля-
хом фарбування бромтимоловим синiм показало, що крiм фотосистеми II, яка мiстить
компоненти з карбоангiдразною активнiстю, карбоангiдраза асоцiйована також цито-
хромним b6f комплексом i АТФ-синтазою. Наведенi данi свiдчать на користь припущен-
ня про участь множинних форм карбоангiдрази у внутрiшньотилакоїдному перенесеннi
протонiв вiд центрiв їх утворення до АТФ-синтази.
Карбоангiдраза (КА, карбонат гiдролiаза, EC 4.2.1.1) — металофермент, що мiстить цинк
i каталiзує взаємоперетворення СО2 i НСО−
3
. КА в десятки тисяч разiв прискорює встанов-
лення рiвноваги мiж формами вугiльної кислоти, яке в розчинi досягається дуже повiль-
но [1, 2]. У кристах мiтохондрiй, цитоплазмi (гiалоплазмi) та стромi хлоропластiв вищих
рослин наявнi як розчиннi форми ферменту, так i зв’язанi з плазматичними та тилакоїдни-
ми [3] мембранами. Експериментально показано, що в тилакоїдних мембранах хлоропластiв
молекули КА асоцiйованi принаймнi з трьома рiзними компонентами електрон-транспорт-
ного ланцюга тилакоїдов. Два носiя карбоангiдразної активностi знайденi як в мономерах,
так i в димерах фотосистеми II (ФСII). Препарати мембран, збагачених фотосистемою I
(ФСI), також мiстять КА [1, 3]. Доведено, що КА, асоцiйована з ФСII, каталiзує утворення
iонiв бiкарбонату в кiлькостi, достатнiй для зв’язування протонiв, що вивiльняються у вну-
трiшнiй об’єм тилакоїду при фотосинтетичному окисленнi води [2]. Встановлено [4], що
вiльна дифузiя не може бути ефективним механiзмом перенесення протонiв вiд центрiв їх
утворення всерединi тилакоїду до АТФ-синтази. Транспорт протонiв значно прискорюєть-
ся при залученнi полегшеної дифузiї за участю рухливих буферiв, зокрема бiкарбонату,
фонд якого пiдтримується завдяки активностi КА. Це дає пiдставу для припущення, що,
крiм асоцiйованих з ФСI та ФСII карбоангiдраз, у складi iнших мембранних полiпептидних
комплексiв можуть бути присутнi бiлки з карбоангiдразною активнiстю.
У тилакоїдних мембранах, крiм хлорофiлвмiстних полiпептидних комплексiв фотосис-
тем, наявнi також iнтегральнi мультибiлковi комплекси цитохромiв b6f i АТФ-синтази, а та-
кож, згiдно з останнiми даними, НАД-дегiдрогеназний комплекс [5]. Разом цi компоненти
© А.В. Семенiхiн, О.К. Золотарьова, 2014
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №6 151
забезпечують фотосинтетичне перенесення електронiв i спряжене з ним перенесення прото-
нiв, у результатi якого формується трансмембранний протонний градiєнт — рушiйна сила
в процесi синтезу АТФ, тобто всi основнi полiпептиднi комплекси фотосинтетичних мембран
беруть участь у свiтлозалежному протонному обмiнi.
Мета дослiдження полягала у виявленнi бiлкових комплексiв тилакоїдної мембрани,
з якими асоцiйована карбоангiдразна активнiсть.
Для цього був вiдпрацьований метод нативного електрофорезу зi змiщенням заряду для
роздiлення нативних пiгмент-бiлкових та бiлкових комплексiв iз листя шпинату i визначена
карбоангiдразна активнiсть цих полiпептидiв.
Тилакоїди видiляли зi свiжого подрiбненого листя шпинату, руйнуючи їх у гомогенi-
заторi в крижаному буферi (20 мМ трис/NaOH (pH 7,8), 400 мМ сорбiтол, 2 мМ ЕДТА,
1 мМ MgCl2, 5 мМ аскорбат i 0,1% БСА, 0,05% цистеїн, 1 мМ фенiлметилсульфонiлфторид
(ФМСФ)). Суспензiю фiльтрували через два шари полотна i центрифугували при 200 g
3 хв та при 2500 g протягом 10 хв. Осад ресуспендували в гiпотонiчному буферi (20 мМ
трис/NaOH (pH 7,5), 5 мМ сорбiтол та 5 мМ MgCl2) з подальшим центрифугуванням при
2500 g протягом 4 хв та при 15000 g протягом 10 хв. Осад, який мiстив iзольованi тилакоїди,
промивали буфером зберiгання (330 мМ сорбiтол, 10 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2,
10 мМ Трис/NaOH, pH 7,8) i пiсля переосадження суспендували в невеликому об’ємi буферу
зберiгання при концентрацiї хлорофiлу 4 мг/мл (концентрацiя бiлка 20 мг/мл). Усi операцiї
по iзоляцiї тилакоїдiв проводили 4 ◦C. Концентрацiю хлорофiлу в препаратах тилакоїдних
мембран визначали за Арноном [6], концентрацiю бiлка — за Лоурi [7].
Для солюбiлiзацiї бiлкових комплексiв очищенi тилакоїднi мембрани iнкубували протя-
гом 30 хв при 4 ◦C у 10% розчинi дигiтонiну (при спiввiдношеннях детергент/бiлок 1 : 1;
2 : 1; 4 : 1; 8 : 1) за наявностi iнгiбiторiв протеаз 0,75 М амiнокапронової кислоти i 1 мМ
ФМСФ. Пiсля iнкубацiї (60 хв, 4 ◦C) фракцiю розчинених бiлкiв тилакоїдних мембран
вiдокремлювали центрифугуванням протягом 45 хв при 140 000 g i 4 ◦C. Вмiст бiлка в су-
пернатантi визначали за Лоурi [7].
Нативний електрофорез зi змiщенням заряду мембранних бiлкових комплексiв проводи-
ли в модифiкованiй системi за Андерсоном та iн. [8] i Колiснiченком та iн. [9] у блоках ПААГ
(70× 80× 1 мм), у градiєнтi концентрацiї акриламiду (4–11%) у 0,375 М трис НCl (pH 8,8)
буферi. Концентруючий (формуючий) гель мiстив 3,75% акриламiду в 0,0625 М трис НСl
(pH 6,8) буферi. Верхнiй (катодний) та нижнiй (анодний) електроднi буфери складалися
з розчину глiцину i трису (25 мМ трис НСl, 192 мМ глiцин), pH 8,3. Для забезпечення
змiщення заряду в катодний електродний буфер додавали 0,005% розчин додецилсульфату
натрiю (ДДС-Na).
Для аналiзу субодиничного складу комплексiв, отриманих пiд час нативного електро-
форезу, смужку гелю з бiлковими треками вирiзали та проводили ДДС-денатуруючий
електрофорез у другому напрямку в модифiкованiй системi Леммлi [10] у блоках ПААГ
(70×80×1 мм). Роздiляючий (робочий) гель формували, створюючи градiєнт концентрацiї
акриламiду вiд 10 до 20%. Концентруючий (формуючий) гель мiстив 4% акриламiду. Бiл-
ковi зони вiзуалiзували за допомогою барвника кумассi R-250. Для визначення АТФазної
активностi використовували методи Алена i Хiнцика [11] та Гоморi [12]. Гелi пiсля нативного
електрофорезу iнкубували протягом ночi в розчинi 10 мМ АТФ, 10 мМ СаСl2 у 100 мМ трис
НСl (pH 9,5). Потiм гель промивали водою та iнкубували протягом 20 хв у 3 мМ розчинi
Рb(NO3)2, приготованому на 80 мМ трис-малатному буферi (pH 7,0). Пiсля промивання
водою гелi занурювали в 0,2% розчин Na2S. Мiсця локалiзацiї АТФ-синтази проявлялися
152 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №6
Рис. 1. Електрофоретичне розділення компонентів ізольованих тилакоїдних мембран шпинату в
ПААГ після солюбізації в 10% розчині дигітоніну в присутності 0,75 М амінокапронової кислоти
і 1 мМ ФМСФ.
а — маркерні білки (феритин, мономер та димер); б–д — тилакоїди, солюбілізовані дигітоніном
при співвідношенні детергент/білок: б — 8 : 1, в — 2 : 1, г — 4 : 1, д — 1 : 1
Рис. 2. АТФазна активність білкових зон нативного ПААГ електрофорезу тилакоїдів листків шпи-
нату. Електрофореграма гелю, пофарбованого сульфідом свинцю, стрілки показують зони прояву
АТФ-синтазної активності.
а–г —білки-маркери; д — білкові зони тилакоїдних мембран після солюбілізації дигітоніном; е —
білкові зони, у яких виявилась АТФазна активність
Рис. 3. Поділ білкових комплексів у другому напрямку (система Леммлі) ДДС / ПААГ і фарбу-
вання кумасі R-250. Молекулярну масу вказано в кДа.
Субодиниці CF0 I (19 кДа), II (16,5 кДа), III (8 кДа), IV (25 кДа) і субодиниці CF1 α (60 кДа),
β (56 кДА), γ (39 кДа), δ (20,5 кДа), ε (14,7 кДа)
Рис. 4. Карбоангідразна активність білкових зон нативного ПААГ електрофорезу тилакоїдів листя
шпинату. Електрофореграми гелю, пофарбованого бромтимоловим синім (е), стрілки показують
зони прояву карбоангідразної активності.
а–г — білки-маркери; д — білкові зони тилакоїдних мембран після солюбілізації дигітоніном; е —
білкові зони, у яких виявилась карбоангідразна активність
у виглядi темно-червоних смуг за рахунок утворення нерозчинного РbS. Вiзуалiзацiю кар-
боангiдразної активностi проводили за методом Едвардса i Петтона [13]. Гелi iнкубували
30 хв у 0,2% розчинi бромтимолового блакитного на 50 мМ вероналовому буферi (pH 9,0),
далi гель переносили у воду, насичену СО2 при 0 ◦C. У мiсцi локалiзацiї КА блакитне
забарвлення iндикатора змiнювалося на жовте.
Залежно вiд природи детергенту та спiввiдношення детергент/бiлок в iнкубацiйному се-
редовищi досягається солюбiлiзацiя тих чи iнших пiгмент-бiлкових комплексiв. Дослiджен-
ня екстрагуючої здатностi рiзних детергентiв [14] показали, що найефективнiше солюбiлi-
зацiя бiлкових компонентiв стромальних дiлянок тилакоїдiв вiдбувається при використаннi
дигiтонiну. Для вирiшення завдань роботи потрiбно було iзолювати нативнi комплекси ла-
мелярних (стромальних) мембран.
Результати електрофоретичного роздiлення в ПААГ компонентiв iзольованих тилако-
їдних мембран пiсля солюбiзацiї дигiтонiном показанi на рис. 1. Видно, що кiлькiсть бiл-
кових зон на електрофореграмах залежить вiд спiввiдношення детергент/бiлок, причому
високомолекулярнi комплекси проявляються при бiльш високому вмiстi детергенту. За да-
ними рис. 1, найефективнiша солюбiлiзацiя нативних бiлкових комплексiв тилакоїдiв дося-
галася при спiввiдношеннi дигiтонiн/бiлок 8 : 1. Цей режим солюбiлiзацiї дає можливiсть
виявити бiлковi структури з молекулярною масою ≈900 кДа i бiльше. При електрофоре-
тичному роздiленнi солюбiлiзованих дигiтонiном комплексiв тилакоїдiв на незабарвлених
електрофореграмах у бiлковiй зонi, яка мiгрує приблизно як маркер з мол. масою 440 кДа,
чiтко проявляється смуга червоного кольору. Ця смуга, вiрогiдно, має вiдношення до цито-
хромного b6f комплексу, який через наявнiсть залiзовмiсних цитохромiв у нативному станi
забарвлений у червоний колiр.
Для виявлення серед бiлкових зон таких, якi мають АТФазну активнiсть i, вiдповiдно,
можуть бути частиною нативного АТФ-синтазного комплексу, ми проаналiзували специ-
фiчну ферментну активнiсть у ПААГ-гелях. Пiсля проявлення гелiв за наявностi АТФ та
нiтрату плюмбуму були виявленi чотири бiлковi смуги, що мають АТФазну активнiсть.
Положення цих смуг у гелi вiдповiдає 700–750 кДа, ≈600 кДа i ≈130–200 кДа.
Як видно з рис. 2, АТФазна активнiсть реєструється в бiлковiй зонi з мол. масою 600 кДа,
яка, за даними [15], вiдповiдає повному комплексу АТФ-синтази тилакоїдiв. Крiм того,
АТФазну активнiсть мали бiлкова зона з мол. масою >900 кДа, яка, вiрогiдно, вiдповiдає
олiгомернiй формi ферменту, i бiлкова зона з мол. масою 200 кДа, близькою до молекуляр-
ної маси фактора спряження CF1. Фактор спряження CF1 є каталiтичною (водорозчинною)
частиною АТФ-синтазного комплексу, яка не мiстить гiдрофобних субодиниць, що забез-
печують занурення повного комплексу в мембрану. CF1 зберiгає здатнiсть каталiзувати
реакцiю гiдролiзу АТФ, завдяки чому легко виявляється на електрофореграмах.
Аналiз пептидного складу бiлкових зон, пов’язаних з АТФ-синтазою, проводили за до-
помогою методу електрофорезу в другому напрямку в денатуруючих умовах у присутностi
ДДС — Na (система Леммлi). Пiсля роздiлення нативних бiлкiв та бiлкових комплексiв
(перший напрямок) смужку гелю вирiзали, iнкубували за наявностi ДДС-Na та мерка-
птоетанолу й помiщали в систему денатуруючого ДДС-електрофорезу (система Леммлi).
ДДС-електрофорез у другому напрямку полiпептидного комплексу показав наявнiсть усiх
субодиниць АТФ-синтазного комплексу — CF0CF1. Визначено дев’ять пептидних складо-
вих (рис. 3): субодиницi CF0 I (19 кДа), II (16,5 кДа), III (8 кДа), IV (25 кДа) i субодиницi
CF1 α (60 кДа), β (56 кДА), γ (39 кДа), δ (20,5 кДа), ε (14,7 кДа), молекулярнi маси яких
в основному вiдповiдають лiтературним даним [15].
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №6 153
Електрофореграма бiлкових зон, якi були ферментно активними в АТФазнiй реакцiї,
показує (див. рис. 3), що набiр полiпептидiв, з яких складаються бiлковi зони з мол.
масою ≈600 i ≈900 кДа, є дуже близьким i вiдповiдає полiпептидному складу повного
АТФ-синтазного комплексу. Бiлковi зони з мол. масою 900 кДа та бiльше виявлялися на
електрофореграмi за умов використання дигiтонiну при спiввiдношеннi до бiлка 8 : 1.
На цiй пiдставi можна зробити висновок, що додавання дигiтонiну до тилакоїдiв у спiв-
вiдношеннi 8 : 1 призводить до повної солюбiлiзацiї основних мембранних пiгмент-бiлко-
во-лiпiдних комплексiв тилакоїдiв, що зберiгають свою структуру i функцiональну актив-
нiсть.
У паралельному експериментi по локалiзацiї КА було показано, що в цьому полiпепти-
дному комплексi наявна i карбоангiдразна активнiсть. Найбiльш активною є КА, пов’язана
iз ФСII (рис. 4), що узгоджується з даними лiтератури [1–3]. Крiм того, карбоангiдразна
активнiсть надiйно виявлялася також у бiлкових зонах, якi мiстили АТФ-синтазу i цито-
хромний b6f комплекс. Оскiльки, як зазначалося вище, у складi комплексу ФСII знайдено
два носiя карбоангiдразної активностi [1, 3], це, можливо, пояснює бiльш iнтенсивне забарв-
лення бiлкової зони ФСII за умов нашого експерименту.
Таким чином, показано, що основнi комплекси тилакоїдної мембрани (ФСII, цитохром-
ний b6f комплекс i АТФ-синтаза) асоцiйованi з компонентами, якi мають карбоангiдразну
активнiсть. Оскiльки цi комплекси беруть участь у перенесеннi протонiв, отриманi резуль-
тати свiдчать на користь висунутого припущення про залучення множинних форм КА ти-
лакоїдiв у процеси фотосинтетичного протонного транспорту.
1. Ignatova L.K., Rudenko N.N., Mudrik V.A. et al. Carbonic anhydrase activity in Arabidopsis thaliana
thylakoid membrane and fragments enriched with PSI or PSII // Photosynth. Res. – 2011. – 110, No 2. –
P. 89–98.
2. Shutova T., Kenneweg H., Buchta J. et al. The photosystem II-associated Cah3 in Chlamydomonas enhan-
ces the O2 evolution rate by proton removal // EMBO J. – 2008. – 27, No 5. – P. 782–791.
3. Игнатова Л.К., Руденко Н.Н., Христин М.С., Иванов Б.Н. Гетерогенная природа карбоангидра-
зной активности тилакоидных мембран // Биохимия. – 2006. – 71, № 5. – С. 651–659.
4. Золотарева Е.К. Протонная регуляция процессов фотосинтетической трансформации энергии //
Физиология и биохимия культ. растений. – 2010. – 42, № 1. – С. 37–50.
5. Aro E.-M., Suorsa M., Rokka A. et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid
protein complexes // J. Exp. Bot. – 2005. – 56. – P. 347–356.
6. Arnon D. I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenolase in Beta vulgaris // Plant Physiol. –
1949. – 24, No 1. – P. 1–154.
7. Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol
reagent // J. Biol Chem. – 1951. – 193. – P. 265–275.
8. Anderson L., Borg H., Mikaelsson M. Molecular weght estimation of proteins by electrophoresis in poly-
acrylamide gels of graded porosity // FEBS Lett. – 1972. – 20. – P. 199–202.
9. Колесниченко А.В., Остроумова Е.А., Зыкова В. В. и др. Белки четырех видов злаков, иммуно-
химически родственные стрессовому белку 310 кД // Физиология растений. – 2000. – 47, № 2. –
С. 199–202.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //
Nature. – 1970. – 227. – P. 680–685.
11. Allen J.M., Hyncik G. Localization of alkaline phosphatases in gel matrices following electrophoresis //
J. Histochem. Cytochem. – 1963. – 11, No 2. – P. 169–175.
12. Gomori G. Preparation of buffers for use in enzyme studies // Meth. Enzymol. – 1955. – 1. – P. 138–146.
13. Edwards L. J., Patton R.L. Visualization of carbonic anhydrase activity in polyacrilamide gel // Stain
Technol. – 41, No 6. – P. 333–334.
14. Ärvi S. J., Suorsa M., Paakkarinen V., Aro E.-M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid
protein complexes: novel super – and mega-complexes // Biochem. J. – 2011. – 439. – P. 207–214.
154 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №6
15. McCarty R. E. A plant biochemist’s view of H+-ATPases and ATP synthases // J. Exp. Biol. – 1992. –
172. – P. 431–441.
Надiйшло до редакцiї 17.10.2013Iнститут ботанiки iм. М. Г. Холодного
НАН України, Київ
А.В. Семенихин, Е.К. Золотарева
Идентификация карбоангидразной активности, ассоциированной
с белковыми комплексами фотосинтетических мембран
хлоропластов шпината
Белковые комплексы фотосинтетических мембран хлоропластов шпината были разделены
методом нативного электрофореза со смещением заряда после их солюбилизации неионным
детергентом дигитонином. Для определения зон геля, содержащих АТФ-синтазный комп-
лекс и его каталитическую часть (CF1), была использована цветная реакция на АТФаз-
ную активность. Цитохромному b6f комплексу тилакоидов соответствовала зона, кото-
рая из-за наличия цитохромов имела красную окраску в неокрашенном геле. Локализация
цитохромного b6f комплекса, АТФ-синтазы и CF1 подтверждена анализом субъединично-
го состава соответствующих белковых зон после ДДС-электрофореза. Определение кар-
боангидразной активности в белковых зонах неденатурированного геля цветной реакцией
с бромтимоловым синим показало, что кроме фотосистемы II, которая содержит ком-
поненты с карбоангидразной активностью, карбоангидраза ассоциирована также с цито-
хромным комплексом b6f и АТФ-синтазой. Приведенные данные свидетельствуют в пользу
предположения об участии множественных форм карбоангидразы во внутритилакоидном
переносе протонов от центров их образования к АТФ-синтазе.
A.V. Semenihin, E.K. Zolotareva
Identification of carbonic anhydrase activity associated with protein
complexes of photosynthetic membranes of spinach chloroplasts
Protein complexes of photosynthetic membranes of spinach chloroplasts were separated by native
charge shift electrophoresis after the solubilization of membranes by a non-ionic detergent digitonin.
To determine the areas of the gel that contained the ATP synthase complex and its isolated catalytic
part (CF1), the color reaction for ATFase activity was used. Due to the presence of cytochromes,
the b6f thylakoid membrane complex was red in the unstained gel. The localization of cytochrome
b6f complex, ATP synthase, and CF1 was confirmed by the subunit analysis of the corresponding
protein zones by SDS-electrophoresis. Using nondenaturing electrophoresis followed by detection of
carbonic anhydrase (CA) activity in the gel stained with bromothymol blue, the following carriers
of CA were detected: photosystem II, cytochrome b6f complex, and ATP synthase. The data favor
the assumption that multiple forms of thylakoid carbonic anhydrase take part in the internal proton
transfer from the centers of their evolution to the ATP synthase.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №6 155
|