Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату

Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату

Дослiджено карбоангiдразну активнiсть чинника спряження CF₁ — каталiтичної частини АТФ-синтазного комплексу хлоропластiв. Чистоту препарату CF₁, що видiляли стандартним методом з iзольованих хлоропластiв шпинату, перевiряли електрофоретичним аналiзом у нативних та денатуруючих умовах (система Леммл...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2014
Main Author: Семеніхін, А.В.
Format: Article
Language:Ukrainian
Published: Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2014
Series:Доповіді НАН України
Subjects:
Біохімія
Online Access:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/88265
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 9. — С. 141-145. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-88265
record_format dspace
spelling irk-123456789-882652015-11-12T03:02:08Z Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату Семеніхін, А.В. Біохімія Дослiджено карбоангiдразну активнiсть чинника спряження CF₁ — каталiтичної частини АТФ-синтазного комплексу хлоропластiв. Чистоту препарату CF₁, що видiляли стандартним методом з iзольованих хлоропластiв шпинату, перевiряли електрофоретичним аналiзом у нативних та денатуруючих умовах (система Леммлi). Властивостi отриманого препарату вiдповiдали лiтературним даним щодо CF₁: полiпептид складався з 5 типiв субодиниць з вiдповiдною молекулярною масою та за наявностi iонiв Mg²⁺ або Ca²⁺ каталiзував реакцiю гiдролiзу АТФ. Пiд час аналiзу iзольованого препарату CF₁ в нативному гелi з використанням pH-iндикатора бромтимолового синього доведено, що в буферному розчинi, який насичували CO₂, у мiсцях локалiзацiї CF₁ колiр полiпептидної зони змiнюється з синього на жовтий, що свiдчить про активацiю конверсiї вуглекислого газу з утворенням бiкарбонату та протонiв. Зроблено висновок, що iзольований CF₁ крiм АТФазної активностi має також карбоангiдразну активнiсть. Розглядається ймовiрна роль карбоангiдразної активностi в механiзмi синтезу–гiдролiзу АТФ, що каталiзується АТФ-синтазою. Исследована карбоангидразная активность сопрягающего фактора CF₁ — каталитической части АТФ-синтазного комплекса хлоропластов. Чистоту препарата CF₁, выделенного стандартным методом из изолированных хлоропластов шпината, тестировали электрофоретическим анализом в нативных и денатурирующих условиях в системе Лэммли. Свойства полученного препарата соответствовали литературным данным для CF₁: полипептид состоял из 5 типов субъединиц с соответствующей молекулярной массой и в присутствии ионов Mg²⁺ или Ca²⁺ катализировал реакцию гидролиза АТФ. При анализе изолированного препарата CF₁ в нативном геле с помощью pH-индикатора бромтимолового синего показано, что при погружении геля в буферный раствор, насыщенный CO₂, в местах локализации CF₁ цвет полипептидной зоны меняется с синего на желтый, что указывает на активацию конверсии углекислого газа с образованием бикарбоната и протонов. Сделан вывод, что изолированный CF₁ наряду с АТФазной имеет также карбоангидразную активность. Обсуждается возможная роль карбоангидразной активности в механизме синтеза–гидролиза АТФ, катализируемых АТФ-синтазой. The aim of the work was to determine the carbonic anhydrase (CA) activity of coupling factor CF₁ — catalytic part of ATPsyntase complex from chloroplasts. The purity of CF₁ prepared by the standard method from spinach chloroplasts was tested by electrophoretic analysis under native and denaturing conditions in the Laemmli system. The properties of the obtained preparation correspond to the literature data for CF₁: polypeptide consists of 5 types of subunits with appropriate molecular masses and catalyzes ATP hydrolysis in the presence of Mg²⁺ or Ca²⁺. The analysis of the isolated preparation of CF₁ in the native gel with a pH indicator bromothymol blue was shown that, when the gel was immersed in a buffer solution saturated with CO₂, the color of the polypeptide zone with CF₁ changed from blue to yellow, indicating the activation of carbon dioxide conversion into bicarbonate and protons. Data obtained in this study allow us to conclude that the isolated CF₁ along with ATPase has also the carbonic anhydrase activity. A possible role of the CA-activity in the mechanisms of ATP synthesis-hydrolysis catalyzed by ATP synthase is discussed. 2014 Article Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 9. — С. 141-145. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/88265 577.23 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Біохімія
Біохімія
spellingShingle Біохімія
Біохімія
Семеніхін, А.В.
Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
Доповіді НАН України
description Дослiджено карбоангiдразну активнiсть чинника спряження CF₁ — каталiтичної частини АТФ-синтазного комплексу хлоропластiв. Чистоту препарату CF₁, що видiляли стандартним методом з iзольованих хлоропластiв шпинату, перевiряли електрофоретичним аналiзом у нативних та денатуруючих умовах (система Леммлi). Властивостi отриманого препарату вiдповiдали лiтературним даним щодо CF₁: полiпептид складався з 5 типiв субодиниць з вiдповiдною молекулярною масою та за наявностi iонiв Mg²⁺ або Ca²⁺ каталiзував реакцiю гiдролiзу АТФ. Пiд час аналiзу iзольованого препарату CF₁ в нативному гелi з використанням pH-iндикатора бромтимолового синього доведено, що в буферному розчинi, який насичували CO₂, у мiсцях локалiзацiї CF₁ колiр полiпептидної зони змiнюється з синього на жовтий, що свiдчить про активацiю конверсiї вуглекислого газу з утворенням бiкарбонату та протонiв. Зроблено висновок, що iзольований CF₁ крiм АТФазної активностi має також карбоангiдразну активнiсть. Розглядається ймовiрна роль карбоангiдразної активностi в механiзмi синтезу–гiдролiзу АТФ, що каталiзується АТФ-синтазою.
format Article
author Семеніхін, А.В.
author_facet Семеніхін, А.В.
author_sort Семеніхін, А.В.
title Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
title_short Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
title_full Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
title_fullStr Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
title_full_unstemmed Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
title_sort карбоангідразна активність чинника спряження cf₁, ізольованого з хлоропластів шпинату
publisher Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate 2014
topic_facet Біохімія
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/88265
citation_txt Карбоангідразна активність чинника спряження CF₁, ізольованого з хлоропластів шпинату / А.В. Семенiхiн // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 9. — С. 141-145. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
series Доповіді НАН України
work_keys_str_mv AT semeníhínav karboangídraznaaktivnístʹčinnikasprâžennâcf1ízolʹovanogozhloroplastívšpinatu
first_indexed 2025-07-06T16:01:43Z
last_indexed 2025-07-06T16:01:43Z
_version_ 1836914001038016512
fulltext УДК 577.23 А.В. Семенiхiн Карбоангiдразна активнiсть чинника спряження CF1, iзольованого з хлоропластiв шпинату (Представлено членом-кореспондентом НАН України Є.Л. Кордюм) Дослiджено карбоангiдразну активнiсть чинника спряження CF1 — каталiтичної час- тини АТФ-синтазного комплексу хлоропластiв. Чистоту препарату CF1, що видiляли стандартним методом з iзольованих хлоропластiв шпинату, перевiряли електрофоре- тичним аналiзом у нативних та денатуруючих умовах (система Леммлi). Власти- востi отриманого препарату вiдповiдали лiтературним даним щодо CF1: полiпептид складався з 5 типiв субодиниць з вiдповiдною молекулярною масою та за наявностi iонiв Mg2+ або Ca2+ каталiзував реакцiю гiдролiзу АТФ. Пiд час аналiзу iзольовано- го препарату CF1 в нативному гелi з використанням pH-iндикатора бромтимолового синього доведено, що в буферному розчинi, який насичували CO2, у мiсцях локалiза- цiї CF1 колiр полiпептидної зони змiнюється з синього на жовтий, що свiдчить про активацiю конверсiї вуглекислого газу з утворенням бiкарбонату та протонiв. Зробле- но висновок, що iзольований CF1 крiм АТФазної активностi має також карбоангiдраз- ну активнiсть. Розглядається ймовiрна роль карбоангiдразної активностi в механiзмi синтезу–гiдролiзу АТФ, що каталiзується АТФ-синтазою. У хлоропластах, мiтохондрiях i бактерiях синтез–гiдролiз АТФ, сполучений з транс- мембранним перенесенням протонiв, здiйснюється зв’язаним з мембраною ферментом — АТФ-синтазою. Вiн складається з гiдрофобної частини — F0, функцiонуючої як протонний канал, i гiдрофiльної частини — чинника спряження F1, що виконує каталiтичнi функцiї i мiстить центри зв’язування нуклеотидiв [1]. Чинник спряження хлоропластiв CF1, подiбно до каталiтичних частин мiтохондрiальних i бактерiальних АТФ-синтаз, складається з п’яти типiв полiпептидiв у стехiометричному вiдношеннi α : β : γ : δ : ε — 3 : 3 : 1 : 1 : 1 [2–4]. 3α i 3β субодиницi, що розташованi навколо подвiйної спiралi γ субодиницi, мiстять три ката- лiтичних i три так званих некаталiтичних центри зв’язування нуклеотидiв. Назва останнiх обумовлена вкрай низькою, несумiсною з каталiзом, швидкiстю обмiну нуклеотидiв, зв’я- заних з цими центрами, з середовищем [5]. CF1AТФаза хлоропластiв є водорозчинним ферментом i може бути вiддiлена вiд тила- коїдних мембран при їх обробцi ЕДТА. АТФазна активнiсть iзольованого CF1, на вiдмiну вiд iнших F1АТФаз, є латентною, тобто вона вiдсутня в iзольованому ферментi та iнду- кується при нагрiваннi, при обробцi тiоловими сполуками, трипсином або детергентами [6]. Значна активацiя АТФазної активностi досягається також при додаваннi до реакцiйного середовища деяких оксианiонiв — бiкарбонату, борату, фосфату i деяких iнших [5]. Екзо- генний бiкарбонат здатен також стимулювати синтез АТФ у тилакоїдах [7]. Нещодавно, при визначеннi ензиматичної активностi окремих полiпептидiв тилакоїдних мембран пiсля їхнього роздiлення в ПААГ вдалося показати, що повний АТФ-синтазний комплекс тилако- їдiв має карбоангiдразну активнiсть [8]. Природа цiєї активностi та її локалiзацiя у межах мультисубодиничного комплексу CF1 · CF0 лишаються невiдомими. © А.В. Семенiхiн, 2014 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №9 141 Метою дослiдження було визначення карбоангiдразної активностi iзольованого чинника спряження CF1 — каталiтичної частини АТФ-синтази хлоропластiв. Хлоропласти видiляли iз свiжого листя шпинату як описано ранiше [7] i руйнували про- тягом 10 хв у гiпотонiчному середовищi, що мiстило 5 мМ трис-НСl (pH 7,8) i 10 мМ NaCl, розмiшуючи розчин на магнiтнiй мiшалцi. Тилакоїди двiчi промивали гiпотонiчним сере- довищем i переосаджували протягом 10 хв при 15000 g та використовували для видiлення препарату чинника спряження за методом Лiєна i Рекера [5] та Степанової i Нiкифоро- вої [9] з деякими модифiкацiями. Вiдмитi вiд надлишку солей i розчинних бiлкiв тилакоїди суспендували до концентрацiї 1,0 мг хл/мл у розчинi 1,0 мМ ЕДТА, 0,750 М амiнокапроно- ва кислота, 50 мМ трис, pH 7,8. Суспензiю перемiшували протягом 20 хв i пiсля осадження мембран (10 хв при 15 000 g) у супернатант додавали сухий сефадекс G-25, iнкубували 45–60 хв, центрифугували при 1000 g 10 хв. Сконцентрований розчин обезсолювали за до- помогою центрифугування (1000 g, 10 хв) на сефадексi G-25 у 0,0625 М трис, 0,750 М амiнокапронова кислота, pH 6,8. Сконцентрований, очищений препарат використовували для визначення бiлкового складу та ферментної активностi пiсля нативного електрофоре- зу та ДДС-електрофорезу у ПААГ. Усi операцiї по iзоляцiї тилакоїдiв i CF1 виконували при 4 ◦C. Концентрацiю хлорофiлу в препаратах тилакоїдних мембран визначали за Арно- ном [10], концентрацiю бiлка — за Лоурi [11]. Для аналiзу чистоти отриманий препарат CF1 роздiляли на протеїновi зони електрофо- резом нативного бiлка зi змiщенням заряду за Андерсоном та iн. i Колiснiченком та iн. [8] у модифiкованiй системi. Роздiлення проводили в блоках (70 × 80 × 1,5 мм) з градiєнтним ПААГ (4–11%) у 0,375 М трис-НCl буферi (pH 8,8). Концентруючий (формуючий) гель мiстив 3,75% акриламiду в 0,0625 М трис-НCl буферi (pH 6,8). Верхнiй (катодний) та ниж- нiй (анодний) електроднi буфери складалися з розчину глiцину i трису (25 мМ трис-НCl, 192 мМ глiцин), pH 8,3. Для забезпечення змiщення заряду в катодний електродний буфер додавали 0,005% розчин ДДС-Na. АТФазну активнiсть визначали методом Алена i Хiн- цика [12] та Гоморi [8]. Мiсце локалiзацiї CF1 проявлялося у виглядi темно-червоної зони завдяки утворенню нерозчинного РbS. Карбоангiдразну активнiсть у гелi вiзуалiзували ме- тодом Едвардса i Петтона [8], реєструючи змiну блакитного забарвлення iндикатора бром- тимолового блакитного на жовте в мiсцi локалiзацiї карбоангiдрази. Для аналiзу субодиничного складу CF1 вiдповiдну смужку гелю вирiзали та проводили ДДС-денатуруючий електрофорез у модифiкованiй системi Леммлi у другому напрямку як описано ранiше [8]. Полiпептиднi зони виявляли за допомогою барвника Кумассi R-250. Результати електрофоретичного роздiлення препарату iзольованого CF1 наведенi на рис. 1 (див. вклейку). Видно, що бiлковi фракцiї представленi в основному полiпептидом з молекулярною масою 440–450 кДа. Ця величина є близькою до значення молекулярної ма- си CF1, встановленої ранiше у роботах [2–4]. Полiпептиди основної зони протеїнової фракцiї виявляли каталiтичну активнiсть у реакцiї гiдролiзу АТФ, яку було зафiксовано в гелi за допомогою кольорової реакцiї з нiтратом свинцю (рис. 2, див. вклейку). При додаваннi суль- фiду натрiю в мiсцях локалiзацiї АТФазної активностi пiсля iнкубацiї, протягом 8–12 год, з’являються темно-червонi смуги, щiльнiсть яких зростає з часом. Цей спосiб локалiзацiї АТФази має ту перевагу, що не призводить до iнактивацiї ферменту i використовується як швидкий i простий якiсний тест на АТФазу. Аналiз субодиничного складу основного полiпептиду фракцiї проводили методом елект- рофорезу в денатуруючих умовах у системi Леммлi в присутностi ДДС-Nа. Для цього смуж- ку гелю, яка мiстила основний полiпептид фракцiї, що виявила АТФазну активнiсть, ви- 142 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №9 Рис. 1. Електрофореграма нативного бiлка (безбарвний нативний електрофорез зi змiщенням заряду): а — очищений чинник спряження СF1; б — дигiтонiновий солюбiлiзат тилакоїдiв; в — бiлки-маркери Рис. 2. АТФазна активнiсть бiлкових зон очищеного чинника спряження пiсля нативного ПААГ електро- форезу: а — АТФазна активнiсть; б — ПААГ, оброблений барвником Кумасi G-250 Рис. 3. Електрофореграма пептидного складу чинника спряження тилакоїдних мембран (електрофорез у другому напрямку (система Леммлi)). Субодиницi CF1 — α (60 кДа), β (56 кДА), γ (39 кДа), δ (20,5 кДа), ε (14,7 кДа) Рис. 4. Карбоангiдразна активнiсть бiлкових зон очищеного чинника спряження пiсля нативного ПААГ електрофорезу: а — ПААГ, забарвлений бромтимоловим синiм; б — ПААГ, що iнкубували за наявностi 2 мМ CoSО4; в — ПААГ, оброблений барвником Кумасi G-250 (880 кДа, 440 кДа — бiлки-маркери (димер та мономер фере- тину)) рiзали, iнкубували у присутностi ДДС-Nа та меркаптоетанолу i роздiляли в денатуруючiй системi ДДС-електрофорезу. Результати роздiлення наведенi на рис. 3 (див. вклейку). Видно, що зона полiпептиду з орiєнтовною молекулярною масою 440–450 кДа роздiлилася на 4–5 смужок, якi за мо- лекулярною масою вiдповiдають основним субодиницям CF1. Маса субодиниць чинника спряження CF1 та їхнє стехiометричне спiввiдношення вiдомi i визначенi ранiше [2–4]. Зi- ставлення результатiв, наведених на рис. 3, з лiтературними даними свiдчить на користь того, що складовi отриманого в роботi протеїнового комплексу за набором i молекулярною масою вiдповiдають складу CF1. Таким чином, за ознаками орiєнтовної молекулярної маси (див. рис. 1), здатностi каталiзувати реакцiю гiдролiзу АТФ (див. рис. 2) i субодиничного складу (див. рис. 3) основний полiпептид отриманої фракцiї може бути iдентифiкований як чинник спряження хлоропластiв CF1. Визначення карбоангiдразної активностi в протеїнових зонах отриманої фракцiї прово- дили в нативному гелi за допомогою pH-iндикатору бромтимолового синього, колiр якого змiнюється з синього на жовтий у дiапазонi значень pH вiд 7,6 до 5,8. Якщо гелi зану- ренi в буферний розчин, насичений CO2, у мiсцях локалiзацiї карбоангiдраз активується реакцiя гiдратацiї вуглекислого газу, у ходi якої утворюється нестiйка вугiльна кислота. При розкладi Н2СО3 вивiльняються протони, якi призводять до локального зниження pH, що наочно реєструється змiною кольору iндикатору (рис. 4, див. вклейку). Карбоангiдраз- ну активнiсть у протеїнових зонах отриманої фракцiї CF1 у нативному гелi визначали ще одним методом: гелi занурювали в iнкубацiйне середовище — 2 мМ CoSO4, 5 мМ H2SO4, 2% (в/об) NaHCO3, 90 мМ Na2SO4 та витримували 2 год при 20 ◦С. Потiм гелi обробляли роз- веденим розчином Nа2S, багаторазово промивали водою. У мiсцях розташування ферменту утворювався чорний осад сульфiду кобальту (див. рис. 4). Результати визначення карбоангiдразної активностi свiдчать про те, що полiпептидна зона, яка виявилася каталiтично активною в реакцiї гiдролiзу АТФ, має також i карбоангiд- разну активнiсть. Тобто, протеїновий комплекс, локалiзований у цiй зонi, здатен каталiзу- вати реакцiю iнтерконверсiї вуглекислого газу в бiкарбонат з вивiльненням i поглинанням протонiв вiдповiдно. Таким чином, результати дослiдження пiдтверджують, що iзольована каталiтична час- тина АТФ-синтази — мультисубодиничний чинник спряження CF1 поряд з АТФазною має також i карбоангiдразну активнiсть. Виникає питання про можливе значення цiєї ензима- тичної функцiї для роботи АТФ-синтазного комплексу, фундаментальним призначенням якого є забезпечення синтезу АТФ з АДФ i фосфату. Оскiльки за фiзiологiчних умов фос- форилювання АДФ пов’язане з поглинанням, а гiдролiз АТФ — з утворенням протонiв, то здатнiсть карбоангiдрази прискорювати виведення i перенесення протонiв iз зони реакцiї може мати критичне значення для забезпечення високої швидкостi реакцiй фотофосфори- лювання i гiдролiзу АТФ. Обговорюючи можливу роль виявленої карбоангiдразної активностi в механiзмi роботи АТФ-синтазного комплексу, необхiдно зауважити, що всi вiдомi карбоангiдрази є металоен- зимами, в активному центрi яких наявний iон цинку [13]. Вiдомi також кадмiєвмiснi форми карбоангiдрази, якi синтезуються в клiтинах деяких дiатомових водоростей при дефiци- тi цинку в середовищi. У цьому зв’язку слiд пiдкреслити, що нi CF1, нi повний комплекс АТФ-синтази не мiстять iонiв цинку або кадмiю. Також до складу АТФ-синтази обов’яз- ково входять iони магнiю, якi утворюють разом з АТФ або АДФ субстратнi комплекси, компетентнi в реакцiях гiдролiзу або синтезу АТФ. Наявнiсть у просторовiй структурi CF1 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №9 143 iонiв магнiю пiдтверджується даними, отриманими за допомогою рентгеноструктурного аналiзу, якi свiдчать про наявнiсть трьох молекул MgATФ, включених до некаталiтичних центрiв CF1 [14]. Чи здатнi цi iони брати участь у забезпеченнi карбоангiдразної актив- ностi комплексу, невiдомо. Ранiше карбонгiдразна активнiсть була виявлена у фотосистемi II — мультисубодиничному хлорофiл-протеїновому комплексi тилакоїдiв, який, також як i АТФ-синтаза, не мiстить нi iонiв цинку, нi iонiв кадмiю [13] i функцiонування якої пов’я- зано з необхiднiстю транспортування зовнi великої кiлькостi протонiв, що утворюються при фотосинтетичному розкладi води. До складу фотосистеми II, як показано структурними до- слiдженнями, входять iони кальцiю [13], якi, ймовiрно, можуть брати участь у формуваннi активного центру ензиматичної карбоангiдразної реакцiї. Роль представникiв широкої родини карбоангiдраз полягає в прискореннi взаємопере- творення бiкарбонату i протонiв до дiоксиду вуглецю i води (або навпаки) — зворотної реак- цiї, що вiдбувається досить повiльно за вiдсутностi каталiзатора. Однiєю з функцiй ензиму є стабiлiзацiя кислотно-лужного балансу в тканинах тварин i рослин, а також запобiгання формуванню локальних градiєнтiв pH через пришвидшення транспортування протонiв iз центрiв їхнього формування. Численнi форми карбоангiдраз присутнi в рiзних компарт- ментах рослинних, тваринних i бактерiальних клiтин. Можна припустити, що визначена карбоангiдразна активнiсть каталiтичної частини АТФ-синтази допомагає прискорювати синтез–гiдролiз АТФ комплексом CF1CF0 через полегшення протонного обмiну [15], пов’я- заного з конвертацiєю форм вугiльної кислоти. 1. Bek-Somfai T., Lincoln P., Nordén B. Mechanical control of ATP synthase function: activation energy difference between tight and loose binding sites // Biochemistry. – 2010. – 49(3). – P. 401–403. 2. Merchant S., Shaner S. L., Selman B.R. Molecular weight and subunit stoichiometry of the chloroplast coupling factor 1 from Chlamydomonasreinhardi // J. Biol. Chem. – 1983. – 258(2). – P. 1026–1031. 3. Tiedge H., Liinsdorf H., Schafer G., Schairer H. U. Subunit stoichiometry and juxtaposition of the photosynthetic coupling factor 1: Immunoelectron microscopy using monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – 82. – P. 7874–7878. 4. Engelbrecht S., Schurmann K., Junge W. Chloroplast ATP synthase contains one single copy of subunit 6 that is indispensable for photophosphorylation // Eur. J. Biochem. – 1989. – 179. – P. 117–122. 5. Lien S., Racker E. Preparation and assay of chloroplast coupling factor CF1 // Meth. Enzymol. – 1971. – 23. – P. 547–555. 6. Мальян А.Н. Некаталитические нуклеотидсвязывающие центры: свойства и механизм участия в ре- гуляции активности АТР-синтаз // Успехи биол. химии. – 2013. – 53. – P. 297–322. 7. Онойко Е. Б., Полищук А.В., Золотарева Е. К. Стимулирование фотофосфорилирования в изоли- рованных хлоропластах шпината экзогенным бикарбонатом: роль карбоангидразы // Доп. НАН Ук- раїни – 2010. – № 10. – С. 160–165. 8. Семенiхiн А.В., Золотарьова О.К. Iдентифiкацiя карбоангiдразної активностi, асоцiйованої з бiлко- вими комплексами фотосинтетичних мембран хлоропластiв шпинату // Доп. НАН України – 2014. – № 6. – С. 151–154. 9. Степанова А.М., Никифорова Л.Ф. Методика выделения латентной Са2+ – АТФ-азы из хлоропла- стов гороха // Методы биохимического анализа растений / Под ред. В. В. Полевого, Г. Б. Максимова. – Ленинград: Изд-во Ленингр. ун-та, 1978. – С. 62–68. 10. Arnon D. I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenolase in Beta vulgaris // Plant Physiol. – 1949. – 24, No 1. – P. 1–154. 11. Lowry O.H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – 193. – P. 265–275. 12. Allen J.M., Hyncik G. Localization of alkaline phosphatases in gel matricesfollowing electrophoresis // J. Histochem. Cytochem. – 1963. – 11, No 2. – P. 169–175. 13. Игнатова Л.К., Руденко Н.Н., Христин М.С., Иванов Б.Н. Гетерогенная природа карбоангидраз- ной активности тилакоидных мембран // Биохимия. – 2006. – 71, № 5. – С. 651–659. 144 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №9 14. Bowler M.W., Montgomery M.G., Leslie A.G.W., Walker J. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution // J. Biol. Chem. – 2007. – 282. – P. 14238–14242. 15. Zolotareva E.K., Polishchuk O.V., Semenikhin A.V., Onoiko E. B. The contribution of light-dependent bicarbonate uptake in thylakoid membrane energization // Photosynthesis Research for Food, Fuel and the Future: 15th Intern. conf. on Photosynthesis. – Berlin; Heidelberg: Springer, 2013. – P. 197–202. Надiйшло до редакцiї 22.04.2014Iнститут ботанiки iм. М. Г. Холодного НАН України, Київ А.В. Семенихин Карбоангидразная активность сопрягающего фактора CF1, изолированного из хлоропластов шпината Исследована карбоангидразная активность сопрягающего фактора CF1 — каталитической части АТФ-синтазного комплекса хлоропластов. Чистоту препарата CF1, выделенного стандартным методом из изолированных хлоропластов шпината, тестировали электрофо- ретическим анализом в нативных и денатурирующих условиях в системе Лэммли. Свой- ства полученного препарата соответствовали литературным данным для CF1: полипе- птид состоял из 5 типов субъединиц с соответствующей молекулярной массой и в при- сутствии ионов Mg2+ или Ca2+ катализировал реакцию гидролиза АТФ. При анализе изо- лированного препарата CF1 в нативном геле с помощью pH-индикатора бромтимолового синего показано, что при погружении геля в буферный раствор, насыщенный CO2, в ме- стах локализации CF1 цвет полипептидной зоны меняется с синего на желтый, что ука- зывает на активацию конверсии углекислого газа с образованием бикарбоната и протонов. Сделан вывод, что изолированный CF1 наряду с АТФазной имеет также карбоангидраз- ную активность. Обсуждается возможная роль карбоангидразной активности в механиз- ме синтеза–гидролиза АТФ, катализируемых АТФ-синтазой. A.V. Semenihin Carbonic anhydrase activity of coupling factor CF1 isolated from spinach chloroplasts The aim of the work was to determine the carbonic anhydrase (CA) activity of coupling factor CF1 — catalytic part of ATPsyntase complex from chloroplasts. The purity of CF1 prepared by the standard method from spinach chloroplasts was tested by electrophoretic analysis under native and denaturing conditions in the Laemmli system. The properties of the obtained preparation correspond to the literature data for CF1: polypeptide consists of 5 types of subunits with appropriate molecular masses and catalyzes ATP hydrolysis in the presence of Mg2+ or Ca2+. The analysis of the isolated preparation of CF1 in the native gel with a pH indicator bromothymol blue was shown that, when the gel was immersed in a buffer solution saturated with CO2, the color of the polypeptide zone with CF1 changed from blue to yellow, indicating the activation of carbon dioxide conversion into bicarbonate and protons. Data obtained in this study allow us to conclude that the isolated CF1 along with ATPase has also the carbonic anhydrase activity. A possible role of the CA-activity in the mechanisms of ATP synthesis-hydrolysis catalyzed by ATP synthase is discussed. ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №9 145

Similar Items