Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1
Исследована роль кальция в реализации биологического действия экзогенного 24-эпибрассинолида (ЭБЛ) в метаболизме клеток трансгенных растений Nicotiana tabacum экотипа KY-160 и созданных на его основе трансгенных растений табака cax1, экспрессирующих кодирующую часть гена H⁺/Ca²⁺ вакуолярного антипо...
Збережено в:
| Дата: | 2015 |
|---|---|
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2015
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/97584 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 / С.В. Кретинин, О.М. Бондаренко, В.С. Кравец, В.А. Хрипач, В.П. Кухарь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 9. — С. 105-112. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-97584 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-975842017-11-02T15:28:54Z Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 Кретинин, С.В. Бондаренко, О.М. Кравец, В.С. Хрипач, В.А. Кухарь, В.П. Біохімія Исследована роль кальция в реализации биологического действия экзогенного 24-эпибрассинолида (ЭБЛ) в метаболизме клеток трансгенных растений Nicotiana tabacum экотипа KY-160 и созданных на его основе трансгенных растений табака cax1, экспрессирующих кодирующую часть гена H⁺/Ca²⁺ вакуолярного антипортера арабидопсиса CAX1. Установлено, что ЭБЛ активирует системы антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу и глутатионредуктазу, а также обусловливает повышение уровня супероксид анион-радикала и восстановленного глутатиона. Показано, что нарушение внутриклеточного гомеостаза ионов кальция приводит к снижению реакции растений на действие экзогенного ЭБЛ. При действии ингибитора глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы снижается активность ферментов глутатион-аскорбатного цикла — аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы. Дослiджено роль кальцiю в реалiзацiї бiологiчної дiї екзогенного 24-епiбрасинолiду (ЕБЛ) в метаболiзмi клiтин трансгенних рослин Nicotiana tabacum екотипу KY-160 та створених на їх основi трансгенних рослин тютюну cax1, якi експресують кодуючу частину гена H⁺/Ca²⁺ вакуолярного антипортеру арабiдопсису САХ1. Встановлено, що ЕБЛ активує системи антиоксидантного захисту — супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу та глутатiонредуктазу, а також зумовлює пiдвищення рiвня супероксид анiон-радикала та вiдновленого глутатiону. Показано, що порушення внутрiшньоклiтинного гомеостазу iонiв кальцiю призводить до зниження реакцiї рослин на дiю екзогенного ЕБЛ. За умов дiї iнгiбiтора глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази знижується активнiсть ферментiв глутатiон-аскорбатного циклу — аскорбатпероксидази i глутатiонредуктази. The role of calcium was investigated in the response of cellular metabolism to 24-epibrassinolide (EBL) in transgenic plants of Nicotiana tabacum еcotype KY-160 and tobacco cax1 transgenic plants created from them that express а coding part of H⁺/Ca²⁺ vacuolar antiporter CAX1 of Arabidopsis. It was established that the EBL activates the antioxidant system (superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase) and increases the levels of superoxide anion radical and reduced glutathione. It was shown that a disturbance of intracellular calcium homeostasis reduces plant responses to exogenous EBL. Reduction of the enzymatic activity of the ascorbateglutathione cycle — ascorbate peroxidase and glutathione reductase — was observed in response to glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibitor. 2015 Article Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 / С.В. Кретинин, О.М. Бондаренко, В.С. Кравец, В.А. Хрипач, В.П. Кухарь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 9. — С. 105-112. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/97584 577.17.02 ru Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Біохімія Біохімія |
| spellingShingle |
Біохімія Біохімія Кретинин, С.В. Бондаренко, О.М. Кравец, В.С. Хрипач, В.А. Кухарь, В.П. Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 Доповіді НАН України |
| description |
Исследована роль кальция в реализации биологического действия экзогенного 24-эпибрассинолида (ЭБЛ) в метаболизме клеток трансгенных растений Nicotiana tabacum
экотипа KY-160 и созданных на его основе трансгенных растений табака cax1, экспрессирующих кодирующую часть гена H⁺/Ca²⁺ вакуолярного антипортера арабидопсиса CAX1. Установлено, что ЭБЛ активирует системы антиоксидантной защиты —
супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу и глутатионредуктазу, а также обусловливает повышение уровня супероксид анион-радикала и восстановленного глутатиона. Показано, что нарушение внутриклеточного гомеостаза ионов кальция приводит к снижению реакции растений на действие экзогенного ЭБЛ. При действии ингибитора глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы снижается активность ферментов глутатион-аскорбатного цикла — аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы. |
| format |
Article |
| author |
Кретинин, С.В. Бондаренко, О.М. Кравец, В.С. Хрипач, В.А. Кухарь, В.П. |
| author_facet |
Кретинин, С.В. Бондаренко, О.М. Кравец, В.С. Хрипач, В.А. Кухарь, В.П. |
| author_sort |
Кретинин, С.В. |
| title |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| title_short |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| title_full |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| title_fullStr |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| title_full_unstemmed |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| title_sort |
роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2015 |
| topic_facet |
Біохімія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/97584 |
| citation_txt |
Роль кальция в реализации биологического действия эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных растений табака cax1 / С.В. Кретинин, О.М. Бондаренко, В.С. Кравец, В.А. Хрипач, В.П. Кухарь // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 9. — С. 105-112. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT kretininsv rolʹkalʹciâvrealizaciibiologičeskogodejstviâépibrassinolidavmetabolizmekletoktransgennyhrastenijtabakacax1 AT bondarenkoom rolʹkalʹciâvrealizaciibiologičeskogodejstviâépibrassinolidavmetabolizmekletoktransgennyhrastenijtabakacax1 AT kravecvs rolʹkalʹciâvrealizaciibiologičeskogodejstviâépibrassinolidavmetabolizmekletoktransgennyhrastenijtabakacax1 AT hripačva rolʹkalʹciâvrealizaciibiologičeskogodejstviâépibrassinolidavmetabolizmekletoktransgennyhrastenijtabakacax1 AT kuharʹvp rolʹkalʹciâvrealizaciibiologičeskogodejstviâépibrassinolidavmetabolizmekletoktransgennyhrastenijtabakacax1 |
| first_indexed |
2025-07-07T05:11:58Z |
| last_indexed |
2025-07-07T05:11:58Z |
| _version_ |
1836963719067729920 |
| fulltext |
УДК 577.17.02
С.В. Кретинин, О. М. Бондаренко, В. С. Кравец,
академик НАН Беларуси В.А. Хрипач,
академик НАН Украины В.П. Кухарь
Роль кальция в реализации биологического действия
эпибрассинолида в метаболизме клеток трансгенных
растений табака cax1
Исследована роль кальция в реализации биологического действия экзогенного 24-эпи-
брассинолида (ЭБЛ) в метаболизме клеток трансгенных растений Nicotiana tabacum
экотипа KY-160 и созданных на его основе трансгенных растений табака cax1, экс-
прессирующих кодирующую часть гена H+/Ca2+ вакуолярного антипортера арабидопси-
са CAX1. Установлено, что ЭБЛ активирует системы антиоксидантной защиты —
супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу и глутатионредуктазу, а также обусловли-
вает повышение уровня супероксид анион-радикала и восстановленного глутатиона. По-
казано, что нарушение внутриклеточного гомеостаза ионов кальция приводит к сниже-
нию реакции растений на действие экзогенного ЭБЛ. При действии ингибитора глюко-
зо-6-фосфатдегидрогеназы снижается активность ферментов глутатион-аскорбатного
цикла — аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum, 24-эпибрассинолид, кальций, CAX1 (Cation Exchan-
ger 1), аскорбатпероксидаза, глутатионредуктаза, супероксиддисмутаза, НАД, НАДФ,
НАДФН.
24-эпибрассинолид (ЭБЛ) относится к гормонам стероидной природы, которые вовлечены
как в регуляцию ключевых этапов роста и развития растений, так и обеспечение устойчиво-
сти растений к ряду биотических и абиотических факторов внешней среды [1], связанных
с развитием оксидативного стресса. ЭБЛ способен контролировать уровень активных форм
кислорода (АФК), активируя системы антиоксидантной защиты, в том числе супероксид-
дисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1), аскорбатпероксидазы (АПО; КФ 1.11.1.11), глутатионпер-
оксидазы и глутатионредуктазы (ГР; КФ 1.8.1.7).
Тонкая регуляция уровня АФК в клетке является ключевым этапом в сигнализации
АФК и предотвращении развития оксидативного стресса [2].
Адаптивные перестройки и изменения в метаболизме клеток растений в значительной
степени опосредуются ионами кальция. Вероятно, кальций цитозоля клеток может слу-
жить связующим звеном для многих сигнальных путей, способствуя формированию сети
трансдукции сигналов растительной клетки. Выявлено формирование всплеска цитозоль-
ного уровня кальция при действии брассиностероидов [3, 4]. В настоящей работе рассма-
тривается влияние градиента Ca2+ в клетке на реакцию растений табака при действии
экзогенного ЭБЛ.
Материалы и методы. Объект исследования. Для исследования использовали расте-
ния табака Nicotiana tabacum KY-160, а также трансгенные растения табака cax1, экспресси-
рующие кодирующую часть гена H+/Ca2+ вакуолярного антипортера арабидопсиса CAX1
(Canion Exchanger 1, At2g38170) [5].
© С.В. Кретинин, О. М. Бондаренко, В. С. Кравец, В. А. Хрипач, В.П. Кухарь, 2015
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9 105
Семена табака проращивали и доводили до возраста 4 недель на 1/2 питательного раст-
вора Хогланда–Арнона в условиях гидропонной системы с еженедельной сменой питатель-
ного раствора. После этого у части вариантов, согласно схеме опыта, питательный раствор
заменяли на 1/2 питательного раствора Хогланда–Арнона без кальция. Через неделю в со-
ответствующие варианты опыта в питательный раствор добавляли ЭБЛ до конечной кон-
центрации 1 мкМ. Листья растений табака этих вариантов опрыскивали раствором ЭБЛ
1 мкМ. По истечении суток часть растений отбирали на анализ активности ферментов, со-
держания пероксида водорода, общего белка и глутатиона. У оставшейся части растений
питательный раствор с ЭБЛ заменяли на питательный раствор без гормона. На 6-й неделе
после начала эксперимента растения пересаживали в почву и доводили до созревания семян.
Использованные реактивы: 24-ЭБЛ, синтезированный в лаборатории химии стероидов
под руководством В. А. Хрипача в Институте биоорганической химии НАН Беларуси, краси-
тель Кумасси G250 (“Loba Feinchemie”), нитросиний тетразолий (NBT) (“Sigma”), 2,3-бис-(2-
метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид (ХТТ)(“Sigma”),НАДФН
(“Merck”), 2-винилпиридин (“Aldrich”), ГР (“Sigma”), ДНТБ (“Sigma”), ЭГТА (“Merck”). Оста-
льные реактивы были производства России и Украины квалификации “х. ч. ”.
Определение активности ферментов антиоксидантной системы. Активность АПО
определяли в реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, pH 7,0, 17 мМ раствор
аскорбиновой кислоты, 5 мМ раствор Na-ЭДТА. К смеси добавляли растительный экстракт,
30 мкл 0,06% раствора пероксида водорода и проводили измерения при 290 нм.
Активность (ГР) определяли по изменению абсорбции реакционной смеси, при образо-
вании окисленной формы НАДФН. Реакционная смесь содержала 50 мМ трис-HCl, pH 7,5,
3 мM MgCl, 0,15 мM НАДФН, 10 мМ окисленного глутатиона и 100 мкл растительного
экстракта. Оптическую плотность измеряли при 340 нм.
Активность СОД определяли по способности ингибировать фотохимическое восстанов-
ление NBT. Реакционная смесь содержала 0,05% раствор NBT, 50 мМ К,Na-фосфатный
буфер, 100 мкл растительного экстракта, 0,24% раствор Na-ЭДТА. Реакция запускалась
добавлением 20 мкл 0,025% раствора рибофлавина. Пробирки перемешивали и выставляли
на 10 мин под люминесцентную лампу TLD 36 W/54. Пробы анализировали на спектрофо-
тометре СФ-46 при 560 нм. Контролем служили пробирки, находящиеся в темноте.
Измерение генерации супероксид-радикала выполняли спектрофотометрическим мето-
дом с использованием ХТТ. Акцептор электронов 0,2 мМ ХТТ в присутствии суперокси-
да превращается в ХТТ формазан [6]. Измерение проводили в 50 мМ K-фосфатном бу-
фере, pH 7,0. Оптическое поглощение формазана регистрировали спектрофотометрически
(D = 470 нм) через 30 мин после начала опыта.
Определение уровня эндогенного пероксида. Уровень эндогенного пероксида водорода
определяли методом FOX с модификациям [7]. 500 мг ткани экстрагировали 5 мл 0,25 М
серной кислоты. 1 мл раствора смешивали с 4 мл смеси, содержащей 1 мл 0,1 М сорбитола,
1 мл 0,25 М серной кислоты, 1 мл 1 мМ ксиленолового оранжевого, 1 мл 2,5 мМ соли
Мора. Оптическую плотность окрашенного комплекса измеряли при 560 нм.
Определение уровня восстановленного глутатиона (GSH). Для определения уровня об-
щего глутатиона использовали реакционную смесь, содержащую К,Na-фосфатный буфер,
0,15 мМ ЭДТА, 0,3 мМ 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) и 1,5 ед. акт. глутатион-
редуктазы. Реакцию инициировали добавлением 80 мкМ НАДФH и результат оценивали
по изменению оптической плотности при 412 нм. Для определения количества окисленного
глутатиона перед проведением анализа к растительному экстракту добавляли 2-винилпи-
106 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9
ридин. Уровень GSH рассчитывали как разность между общим и окисленным глутатио-
ном [8].
Определение общего содержания белка. Содержание белка определяли по методу Бред-
форд. Кумасси G250 (50 мг) растворяли в 96% этаноле. Добавляли 50 мл 85% H3PO4 и изме-
ряли до 500 мл. Оптическую плотность окрашенного комплекса с белком определяли при
595 нм относительно чистого реагента.
Определение общего содержания масла. Экстракцию масла из измельченных семян та-
бака проводили при 30 ◦С с использованием гексана в качестве растворителя при соотноше-
нии семена/растворитель 1/10 (масса/объем). Продолжительность экстракции — 24 ч при
непрерывном помешивании. После завершения экстракции содержимое колб фильтровали
под вакуумом и высушивали под вакуумом.
Результаты и обсуждение. Эндогенный уровень кальция в клетках различных видов
растений не превышает 100 нМ. При изучении реакции растений на обработку экзоген-
ными ЭБЛ наблюдали резкое возрастание цитозольного пула Са2+ [3, 4]. Известно, что
внутриклеточная концентрация Са2+ в процессе трансдукции сигналов может возрастать
как за счет непосредственного поступления его в клетку, так и в результате мобилизации
из внутриклеточных депо, например из вакуоли. Для блокирования обоих пулов кальция —
внутриклеточного и внеклеточного, применялись два подхода: исключение кальция из пи-
тательной среды и использование трансгенных растений табака cax1, с гиперэкспрессией
гена CAX1 арабидопсиса, встроенного в геном клеток табака. CAX антипортеры обеспечи-
вают низкоаффинный транспорт цитозольных ионов Ca2+ в вакуоль. Растения табака cax1
характеризуются быстрым истощением цитозольного пула ионов Ca2+, при ограничении
его притока, что обусловливает нарушение функций кальциевого сигналинга [5].
Результаты исследования влияния кальция и ЭБЛ (1 мкМ) на содержание субстратов
и активность ферментов-антиоксидантов в клетках исходных и трансгенных растений та-
бака приведены в табл. 1.
Образование О•−
2 постоянно происходит в растительных клетках, прежде всего в резуль-
тате взаимодействия кислорода с восстановленными компонентами электрон-транспортных
цепей фотосинтеза и дыхания. Среди других ферментных систем особенного внимания
Таблица 1. Влияние кальция и ЭБЛ (1 мкМ) на содержание субстратов, активность ферментов-антиокси-
дантов и содержание восстановленного глутатиона в клетках исходных и трансгенных растений табака
Параметр Растения Са, 0 мМ Са, 2 мМ
Са, 0 мМ +
+ ЭБЛ,
1 мкМ
Са, 2 мМ +
+ ЭБЛ,
1 мкМ
Супероксид-радикал Исх. тип 0,06± 0,02 0,04± 0,03 0,09± 0,02 0,12± 0,02
(D = 470 нм) сах1 0,05± 0,03 0,04± 0,02 0,1± 0,02 0,11± 0,03
Активность СОД, отн. ед. Исх. тип 22,60± 3,24 30,99± 1,24 33,78± 2,43 42,19± 4,75
активности/мг белка сах1 17,88± 2,73 18,97± 3,98 29,64± 1,62 33,36± 4,42
Содержание H2O2, Исх. тип 3,55± 0,19 3,69± 0,11 3,80± 0,40 2,81± 0,34
мкМ/г сухой массы сах1 3,55± 0,19 3,55± 0,19 3,53± 0,29 3,44± 0,20
Активность АПО, отн. ед. Исх. тип 4,77± 0,80 6,20± 1,04 7,30± 0,20 8,67± 0,65
активности/(мин−1 · мг белка) сах1 4,70± 1,37 5,64± 0,71 7,15± 0,43 7,25± 0,49
Содержание GSH, Исх. тип 4,07± 0,52 5,16± 0,60 5,16± 0,60 6,01± 0,36
мкМ/г сухой массы сах1 3,77± 0,24 4,86± 0,60 5,16± 0,60 5,47± 0,41
Активность ГР, Исх. тип 2,28± 0,09 2,59± 0,27 3,41± 0,60 4,54± 0,47
мМ/(мин−1 · мг белка) сах1 2,17± 0,43 4,54± 0,47 2,40± 0,34 3,41± 0,52
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9 107
заслуживают НАДФН-оксидазы плазматической мембраны, являющиеся кальцийзависи-
мыми энзимами, играющими ключевую роль в регуляции метаболизма клеток [9].
Проведенные исследования выявили изменения в интенсивности новообразования су-
пероксид анион-радикала у обработанных ЭБЛ и необработанных растений табака (см.
табл. 1). После обработки растений ЭБЛ наблюдалось резкое повышение генерации супер-
оксида, которое имело тенденцию к дальнейшему возрастанию при одновременном действии
ЭБЛ и кальция. Увеличение продукции О•−
2 приводило к активации СОД, для которой по-
казана субстратная индукция. Можно видеть, что активность СОД после действия ЭБЛ
(см. табл. 1) частично отражает динамику образования супероксид-радикала. В результате
действия СОД образуется более стабильный молекулярный продукт — пероксид водорода,
который из-за отсутствия в хлоропластах основного фермента его детоксикации — катала-
зы элиминируется в глутатион-аскорбатном цикле [10]. О работе этого цикла можно судить
по активности его ключевых ферментов — АПО и ГР. Действие ЭБЛ вызвало достоверное
уменьшение уровня пероксида водорода в варианте с 2 мМ кальция в питательном растворе.
Активация АПО под влиянием ЭБЛ в целом повторяла картину с СОД. Скорость работы
всего цикла определяет ГР, катализирующая реакцию восстановления окисленного димера
глутатиона GSSG в GSH, который идет на пополнение пула восстановленного аскорбата
и работу фермента детоксикации продуктов окисления — глутатионтрансферазы. Актив-
ность ГР при обработке ЭБЛ возросла почти в 1,5 раза по сравнению с контролем. Процесс
был более выраженным при наличии кальция в питательном растворе.
Исследование закономерностей проявления биологических эффектов при комбиниро-
ванных воздействиях может прояснить механизмы усиления или ослабления комбинации
эффектов. В связи с этим в дальнейших экспериментах применялись трансгенные расте-
ния табака cax1. Анализ работы антиоксидантной системы у этих растений выявил, что
скорость новообразования супероксид анион-радикала как у обработанных ЭБЛ, так и не-
обработанных трансгенных растений табака имела значения, сходные с таковыми у расте-
ний исходного типа (см. табл. 1). Стимуляция защитных механизмов — активация СОД —
у трансгенных растений табака cax1 была ниже, чем у растений исходного типа. Активность
ключевого фермента — аскорбатпероксидазы — также была ниже у растений табака cax1.
Количество пероксида водорода при этом существенно не менялось. Активнисть ГР у ра-
стений табака cax1 возрастала значительно меньше по сравнению с контролем. Действие
ЭБЛ индуцировало синтез восстановленного глутатиона в меньшей степени, чем у расте-
ний исходного типа.
Об участии фитогормонов и ряда вторичных мессенджеров, в том числе брассиносте-
роидов и свободного кальция, в регуляции уровня НАДФ/ НАДФН в метаболизме клеток
растений информация крайне ограничена. В частности, показано, что стимуляция иона-
ми кальция кальмодулинзависимой НАД-киназы [11] приводит к увеличению соотноше-
ния НАДФ/НАД. Установлена также активация ионами кальция (10−7 М) глюкозо-6-фо-
сфатдегидрогеназы (Г6ФД, КФ 1.1.1.49) [12]. С использованием генетических подходов на
трансгенных растениях арабидопсиса со сниженной чувствительностью к брассиностерои-
дам (bri1) выявлено участие НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.40) в опосре-
дованной брассиностероидами регуляции клеточного роста [13].
Учитывая ключевую роль НАДФН во многих метаболических путях клеток разного
уровня организации, особенно биосинтез жирных кислот и формирование триацидглице-
ридов в тканях растений, с одной стороны, а также его как компонент, обеспечивающий
функционирование различных антиоксидантных систем, включая активацию глутатион-
108 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9
редуктазы, несомненно актуальное значение приобретает поиск гормонов и их мишеней,
обеспечивающих тонкую регуляцию обмена НАДФН в живых системах. Важное значение
в анализе этих процессов принадлежит модуляции активности Г6ФД [14]. Среди возможных
путей анализа функций указанного фермента используется воздействие Na3PO4, который
обладает способностью связывать ионы кальция, при этом образуются малорастворимые
фосфаты кальция. Так, при изучении роли кальция в кавитационных процессах в ксилеме
растений фосфат натрия применялся для связывания Са2+ наряду с ЭГТА и щавелевой
кислотой [15]. В связи с этим нами в схему опыта был добавлен вариант с использованием
ЭГТА.
Результаты ингибиторного анализа показали, что подавление активности фермента
Г6ФД приводило к значительному снижению активности ферментов глутатион-аскорба-
тного цикла (табл. 2). Аналогичные результаты были получены при изучении действия
блокирования активности Г6ФД с помощью Na3PO4 на активность ферментов антиокси-
дантов в клетках корней красной фасоли [14]. Наряду с этим использование ЭГТА также
приводило к подавлению активности ферментов глутатион-аскорбатного цикла. Несмотря
на то, что эффект ЭГТА был значительно ниже, чем Na3PO4, можно предположить, что
некоторая доля в наблюдаемом эффекте опосредована связыванием кальция.
Способность ЭБЛ повышать продуктивность растений и содержание жиров в их тка-
нях имеет важное значение для повышения продуктивности и максимальной реализации
биологического потенциала растений и представляет несомненный интерес для практиче-
ского решения задач возделывания масличных растений. Нами исследовано действие ЭБЛ
на биологическую продуктивность исходных и трансгенных растений табака при различ-
ных уровнях кальция в питательном растворе в момент воздействия. Согласно результатам
эксперимента (табл. 3), при достаточном уровне кальция в питательной среде трансгенные
растения статистически не отличимы от исходных. При временном исключении кальция из
питательной среды различия были намного существеннее. Так, средняя масса семян с расте-
ний исходного типа при наличии кальция в среде под воздействием ЭБЛ возрастала на 10%,
а выход масла — на 16%. Для трансгенных растений в аналогичных условиях масса семян
также возрастала на 10%, а количество масла с растения — на 35%. Временное исключе-
ние кальция из питательной среды у трансгенных растений при действии ЭБЛ приводило
к снижению массы семян с растения на 21%, а количества масла — на 30% по сравнению
с вариантами с достаточным уровнем кальция.
Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что интенсивность
новообразования супероксид анион-радикала у обработанных ЭБЛ и необработанных ра-
стений табака существенно различалась. После обработки растений ЭБЛ наблюдалось рез-
Таблица 2. Влияние кальция, 24-эпибрассинолида, блокатора активности Г6ФД Na3PO4 и ЭГТА на актив-
ность ферментов глутатион-аскорбатного цикла в клетках исходных и трансгенных растений табака
Параметр Растения
Са,0 мМ + ЭБЛ,
1 мкМ+Na3PO4,
2,5 мM
Са,2 мМ + ЭБЛ,
1 мкМ+Na3PO4,
2,5 мM
Са,0 мМ + ЭБЛ,
1 мкМ + ЭГТА,
5 мM
Са,2 мМ + ЭБЛ,
1 мкМ + ЭГТА,
5 мM
Активность АПО, Исх. тип 2,36± 0,87 2,67± 0,65 3,68± 0,50 3,78± 0,36
отн. ед. активности/ сах1 2,12± 0,73 2,14± 0,84 3,49± 0,21 3,51± 0,48
(мин−1 · мг белка)
Активность ГР, Исх. тип 1,75± 0,32 2,19± 0,08 2,42± 0,15 2,63± 0,12
мМ/(мин−1 · мг белка) сах1 1,39± 0,21 1,52± 0,32 2,27± 0,13 2,42± 0,15
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9 109
Таблица 3. Сравнение биологической продуктивности исходных и трансгенных растений табака под дей-
ствием эпибрассинолида при различных уровнях кальция в питательном растворе в момент воздействия
Параметр Растения Са, 0 мМ Са, 2 мМ
Са, 0 мМ +
+ ЭБЛ,
1 мкМ
Са, 2 мМ +
+ ЭБЛ,
1 мкМ
Количество семян Исх. тип 61998± 5921 61151± 7643 62100± 5642 65201± 4139
с растения, шт. сах1 62023± 6274 62508± 4878 59750± 6193 63910± 7475
Масса семян с растения, г Исх. тип 4,60± 0,21 4,66± 0,40 4,74± 0,20 5,12± 0,44
сах1 4,14± 0,32 4,71± 0,32 4,10± 0,37 5,19± 0,41
Содержание масла Исх. тип 35,6± 1,31 36,0± 1,09 37,0± 0,63 38,1± 0,91
в семенах, % сах1 34,9± 1,41 36,3± 1,32 36,2± 1,36 38,7± 1,30
Выход масла с растения, г Исх. тип 1,64± 0,08 1,68± 0,14 1,76± 0,10 1,95± 0,12
сах1 1,56± 0,15 1,56± 0,22 1,48± 0,15 2,01± 0,22
кое повышение генерации супероксида, которое имело тенденцию к усилению под влиянием
кальция. У растений табака исходного типа активность АО ферментов значительно возра-
стала под действием ЭБЛ. У трансгенных растений cax1 при исключении кальция из пита-
тельного раствора статистически достоверное влияние на активность изучаемых ферментов
было значительно ниже либо отсутствовало, что может указывать на взаимосвязь кальци-
евого сигналинга и брассиностероид-сигналинга, что в дальнейшем позитивно отражалось
на параметрах биологической продуктивности исследуемых растений.
Также установлено, что при действии ингибитора Г6ФД активность ферментов глута-
тион-аскорбатного цикла значительно снижалась во всех исследуемых вариантах. Последу-
ющие исследования помогут раскрыть механизмы взаимосвязи изучаемых процессов.
Авторы выражают благодарность проф. К. Хирши за предоставленные семена расте-
ний табака cax1.
Работа поддержана грантом № 14–1 Целевой комплексной программы научных исследований
НАН Украины “Биологические ресурсы и новейшие технологии биоэнергоконверсии”.
Цитированная литература
1. Kagale S., Divi U.K., Krochko J. E., Keller W.A., Krishna P. Brassinosteroid confers tolerance in Arabi-
dopsis thaliana and Brassica napus to a range of abiotic stresses // Planta. – 2007. – 225, Iss. 2. –
P. 353–364.
2. Yan J., Guan L., Sun Y., Zhu Y., Liu L., Lu R., Jiang M., Tan M., Zhang A. Calcium and ZmCCaMK
are involved in brassinosteroid-induced antioxidant defense in maize leaves // Plant Cell Physiol. – 2015. –
56, No 5. – P. 883–896. – doi: 10.1093/pcp/pcv014.
3. Zhao Y., Qi Z., Berkowitz G.A. Teaching an old hormone new tricks: cytosolic Ca2+ elevation involvement
in plant brassinosteroid signal transduction cascades // Plant Physiol. – 2013. – 163, No 2. – P. 555–565.
4. Straltsova D., Chykun P., Subramaniam S., Sosan A., Kolbanov D., Sokolik A., Demidchik V. Cation
channels are involved in brassinosteroid signalling in higher plants // Steroids. – 2015. – 97. – P. 98–106. –
doi:10.1016/j. steroids. 2014.10.008.
5. Hirschi K.D. Expression of Arabidopsis CAX1 in tobacco: altered calcium homeostasis and increased stress
sensitivity // Plant Cell. – 1999. – 11, Iss. 11. – P. 2113–2122.
6. Able A. J., Guest D. I., Sutherland M.W. Use of a new tetrazolium-based assay to study the production of
superoxide radicals by tobacco cell cultures challenged with avirulent zoospores of phytophthora parasitica
var nicotianae // Plant Physiol. – 1998. – 117, No 2. – P. 491–499.
7. Boveris A., Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect
of hyperbaric oxygen // Biochem. J. – 1973. – 134, Iss. 3. – P. 707–716.
8. Griffith O.W. Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and
2-vinylpyridine // Anal. Biochem. – 1980. – 106, Iss. 1. – P. 207–212.
110 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9
9. Xia X.-J., Zhou Y.-H., Shi K., Zhou J., Foyer C.H., Yu. J.-Q. Interplay between reactive oxygen species
and hormones in the control of plant development and stress tolerance // J. Exp. Bot. – 2015. – doi:
10.1093/jxb/erv089.
10. Foyer C.H., Noctor G. Ascorbate and Glutathione: The Heart of the Redox Hub. // Plant Physiol. –
2011. – 155, No 1. – P. 2–18.
11. Karita E., Yamakawa H., Mitsuhara I., Kuchitsu K., Ohashi Y. Three types of tobacco calmodulins
characteristically activate plant NAD kinase at different Ca2+ concentrations and pHs // Plant Cell Physi-
ol. – 2004. – 45, No 10. – P. 1371–1379.
12. Gahan P.B., Ishkhanes S. T., Crevecoeur M., Greppin H. Calcium stimulation of glucose-6-phosphate
dehydrogenase activity in shoot apices of Spinacia oleracea during floral evocation // Cell Biochem. Funct. –
1998. – 16, Iss. 1. – P. 29–34.
13. Deng Z., Zhang X., Tang W., Oses-Prieto J.A., Suzuki N., Gendron J.M., Chen H., Guan S., Chal-
kley R. J., Peterman T.K., Burlingame A. L., Wang Z.Y. A proteomics study of brassinosteroid response
in Arabidopsis // Mol. Cell. Proteomics. – 2007. – 6, No 12. – P. 2058–2071.
14. Liu Y., Wu R., Wan Q., Xie G., Bi Y. Glucose-6-phosphate dehydrogenase plays a pivotal role in nitric
oxide-involved defense against oxidative stress under salt stress in red kidney bean roots // Plant Cell
Physiol. – 2007. – 48, No 3. – P. 511–522.
15. Herbette S., Cochard H. Calcium Is a Major Determinant of Xylem Vulnerability to Cavitation // Plant
Physiol. – 2010. – 153, No 4. – P. 1932–1939.
References
1. Kagale S., Divi U.K., Krochko J. E., Keller W.A., Krishna P. Planta, 2007, 225, Iss. 2: 353–364.
2. Yan J., Guan L., Sun Y., Zhu Y., Liu L., Lu R., Jiang M., Tan M., Zhang A. Plant Cell Physiol., 2015,
56, No 5: 883-896. doi:10.1093/pcp/pcv014.
3. Zhao Y., Qi Z., Berkowitz G.A. Plant Physiol., 2013, 163, No 2: 555-565.
4. Straltsova D., Chykun P., Subramaniam S., Sosan A., Kolbanov D., Sokolik A., Demidchik V. Steroids,
2015, 97: 98-106. doi:10.1016/j.steroids.2014.10.008.
5. Hirschi K.D. Plant Cell., 1999, 11, Iss. 11: 2113–2122.
6. Able A. J., Guest D. I., Sutherland M.W. Plant Physiol., 1998, 117, No 2: 491–499.
7. Boveris A., Chance B. Biochem. J., 1973, 134, Iss. 3: 707–716.
8. Griffith O.W. Anal. Biochem., 1980, 106, Iss. 1: 207–212.
9. Xia X.-J., Zhou Y.-H., Shi K., Zhou J., Foyer C.H., Yu. J.-Q. J. Exp. Bot., 2015, doi:10.1093/jxb/erv089.
10. Foyer C.H., Noctor G. Plant Physiology, 2011, 155, No 1: 2–18.
11. Karita E., Yamakawa H., Mitsuhara I., Kuchitsu K., Ohashi Y. Plant Cell Physiol., 2004, 45, No 10:
1371–1379.
12. Gahan P.B., Ishkhanes S. T., Crevecoeur M., Greppin H. Cell Biochem. Funct., 1998, 16, Iss. 1: 29–34.
13. Deng Z., Zhang X., Tang W., Oses-Prieto J.A., Suzuki N., Gendron J.M., Chen H., Guan S., Chal-
kley R. J., Peterman T.K., Burlingame A. L., Wang Z.Y. Mol. Cell. Proteomics., 2007, 6, No 12: 2058–
2071.
14. Liu Y., Wu R., Wan Q., Xie G., Bi Y. Plant Cell Physiol., 2007, 48, No 3: 511–522.
15. Herbette S., Cochard H. Plant Physiol., 2010, 153, No 4: 1932–1939.
Поступило в редакцию 16.06.2015Институт биоорганической химии
и нефтехимии НАН Украины, Киев
Институт биоорганической химии
НАН Беларуси, Минск
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9 111
С.В. Кретинiн, О.М. Бондаренко, В. С. Кравець,
академiк НАН Бiлорусi В.А. Хрипач,
академiк НАН України В.П. Кухар
Роль кальцiю в реалiзацiї бiологiчної дiї епiбрасинолiду
в метаболiзмi клiтин трансгенних рослин тютюну cax1
Iнститут бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України, Київ
Iнститут бiоорганiчної хiмiї НАН Бiлорусi, Мiнськ
Дослiджено роль кальцiю в реалiзацiї бiологiчної дiї екзогенного 24-епiбрасинолiду (ЕБЛ)
в метаболiзмi клiтин трансгенних рослин Nicotiana tabacum екотипу KY-160 та ство-
рених на їх основi трансгенних рослин тютюну cax1, якi експресують кодуючу частину
гена H+/Ca2+ вакуолярного антипортеру арабiдопсису САХ1. Встановлено, що ЕБЛ акти-
вує системи антиоксидантного захисту — супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу та
глутатiонредуктазу, а також зумовлює пiдвищення рiвня супероксид анiон-радикала та
вiдновленого глутатiону. Показано, що порушення внутрiшньоклiтинного гомеостазу iонiв
кальцiю призводить до зниження реакцiї рослин на дiю екзогенного ЕБЛ. За умов дiї iнгiбi-
тора глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази знижується активнiсть ферментiв глутатiон-аскор-
батного циклу — аскорбатпероксидази i глутатiонредуктази.
Ключовi слова: Nicotiana tabacum, 24-епiбрасинолiд, кальцiй, CAX1 (Cation Exchanger 1),
аскорбатпероксидаза, глутатiонредуктаза, супероксиддисмутаза, НАД, НАДФ, НАДФН.
S.V. Kretynin, O. M. Bondarenko, V. S. Kravets,
Academician of the NAS of Belarus V.A. Khripach,
Academician of the NAS of Ukraine V.P. Kukhar
Role of calcium in the response of cellular metabolism to epibrassinolide
in transgenic tobacco cax1 plants
Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of the NAS of Ukraine, Kiev
Institute of Bioorganic Chemistry of the NAS of Belarus, Minsk
The role of calcium was investigated in the response of cellular metabolism to 24-epibrassinoli-
de (EBL) in transgenic plants of Nicotiana tabacum еcotype KY-160 and tobacco cax1 transgenic
plants created from them that express а coding part of H+/Ca2+ vacuolar antiporter CAX1 of Arabi-
dopsis. It was established that the EBL activates the antioxidant system (superoxide dismutase,
ascorbate peroxidase, and glutathione reductase) and increases the levels of superoxide anion radi-
cal and reduced glutathione. It was shown that a disturbance of intracellular calcium homeostasis
reduces plant responses to exogenous EBL. Reduction of the enzymatic activity of the ascorbate-
glutathione cycle — ascorbate peroxidase and glutathione reductase — was observed in response to
glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibitor.
Keywords: Nicotiana tabacum, 24-epibrassinolide, calcium, CAX1 (Cation Exchanger 1), ascor-
bate peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, NAD, NADP, NADPH.
112 ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №9
|